Типы каспаз и их участие в регуляции апоптоза

Обновлено: 18.05.2024

Физиология:

Популярные разделы сайта:

Развитие и этапы апоптоза. Индукция апоптоза

В развитии апоптоза можно выделить три стадии: индукторную, эффекторную и стадию деградации.
• В стадии индукции апоптоза происходит рецепция сигнала и начальные этапы его передачи.
• В эффекторной стадии активируются каспазы. Этот процесс вызывает необратимые изменения в клетке.
• В стадии деградации реализуются механизмы гибели клетки. Условно механизмы индукции апоптоза можно разделить на две группы:
• рецепторные (при действии внешних факторов на специализированные мембранные рецепторы);
• митохондриальные (при активации внутриклеточных сигналов).

Стадия I (индукция). Наиболее детально изучен рецепторный механизм индукции апоптоза при действии внешних факторов. Рецепторы, запускающие апоптоз, принадлежат к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли и обозначаются как рецепторы смерти (Death Receptor — DR). Характерная особенность этих рецепторов — наличие внутриклеточного домена, называемого доменом «смерти» (англ. Death Domain — DD), активация этого домена индуцирует внутриклеточные сигналы, приводящие к апоптозу. Описано 6 DR; среди них рецептор Fas (Аро-1 или CD95), ФНО-Р1 (р55 или СD120а) и другие рецепторы (TRAIL-R1/DR4, TRAIL-R2/DR5, Apo-2/TRICK2/KILLER, LTpR, CAR1 и DR6). Самые известные лиганды рецепторов смерти — Fas-лиганд (FasL или CD95L) и ФНО-сх. Они представляют собой мембранные белки, экспрессируемые теми же клетками, на которых находятся рецепторы, или клетками ближайшего окружения. Таким образом, апоптоз может индуцироваться по аутокринному или паракринному механизму. В последние годы показано, что не только рецепторы суперсемейства фактора некроза опухоли могут запускать процесс апоптоза — этой способностью обладают и TLR. Цитоплазматический домен TLR2 через каскад адапторных белков (MyD88 и FADD) активирует протеолитический каскад каспаз, что приводит к апоптозу клеток. Этот механизм показан для клеток плаценты. Активация TLR4 индуцирует синтез провоспалительного цитокина ФНО-а, который, связываясь со своим рецептором, запускает апоптоз. В макрофагах, инфицированных М. tuberculosis, тоже инициируется TLR-опосредованный апоптоз.

этапы апоптоза

Внутренний путь активации апоптоза в основном связан с процессами, происходящими в митохондриях, и инициация апоптоза происходит с помощью внутриклеточных сигналов. К таким сигналам относят недостаток факторов роста, гормонов и цитокинов. Уменьшение количества этих факторов приводит к несостоятельности механизма супрессии апоптоза, и клетка запускает программу клеточной гибели. Радиация, гипоксия, гипотермия, вирусная инвазия и свободные радикалы непосредственно запускают внутренние механизмы апоптоза.

Все эти факторы приводят к изменениям на внутренней мембране митохондрий. Результат этих изменений — открытие пор в мембране митохондрий, потеря митохондриями мембранного потенциала и высвобождение из межмембранного пространства в цитозоль проапоптотических факторов.

Можно выделить две группы факторов, высвобождаемых из межмембранного пространства митохондрий. Первую группу представляют белки, имеющие проапоптотическое действие и запускающие каспазозависимый путь апоптоза. К этой группе относят цитохром С, фактор Smac/DIABLO и сериновую протеазу HtrA2/Omi. Высвобожденный цитохром С связывается с фактором APAF-1, что приводит к кластеризации и, как следствие, к активации каспазы-9. Комплекс цитохрома С с белком APAF-1 и каспазой-9 называют апоптосомой.
Проапоптотическая функция Smac/DIABLO и HtrA2/Omi сводится к блокированию ингибиторов апоптоза — белков семейства IAP.

Вторую группу белков составляют AIF (англ. Apoptosis Inducing Factor), эдонуклеаза G и CAD (англ. Caspase Activated DNAse). Эти белки высвобождаются из митохондрий в поздних стадиях, когда клетка уже на пути к гибели. Белок AIF и эндонуклеза G, проникая через ядерную мембрану, индуцируют разрезание ДНК на фрагменты размером 180-200 пар нуклео-тидов и конденсацию периферических участков хроматина. Такая ранняя конденсация в ядре получила название конденсации первого уровня. Белок CAD расщепляется каспазой-3, проникает в ядро и вызывает выраженную конденсацию хроматина.
Эти более поздние и более ярко выраженные изменения в ядре называют конденсацией второго уровня.

Молекулярная регуляция метаболизма и клеточного цикла



Апопто́з ( др.-греч. ἀπόπτωσις «опадание», от ἀπό- + πτῶσις «падение») — регулируемый процесс программируемой клеточной гибели, в результате которого клетка распадается на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной . Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро (в среднем за 90 минут [1] ) фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции . Морфологически регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1—3 часа. [2] Одной из основных функций апоптоза является уничтожение дефектных (повреждённых, мутантных, инфицированных) клеток. В многоклеточных организмах апоптоз к тому же задействован в процессах дифференциации и морфогенеза , в поддержании клеточного гомеостаза , в обеспечении важных аспектов развития и функционирования иммунной системы . Апоптоз наблюдается у всех эукариотов , начиная от одноклеточных простейших и вплоть до высших организмов. В программируемой смерти прокариотов участвуют функциональные аналоги эукариотических белков апоптоза. [3]

Исследования программируемой клеточной смерти ведутся с конца 1960-х годов. Термин «апоптоз» был впервые употреблён в 1972 году в работе британских учёных — Дж. Керра, Э. Уайли и А. Керри. Одними из первых к изучению генетики и молекулярных механизмов апоптоза приступили С. Бреннер, Дж. Салстон и Р. Хорвиц, все трое в 2002 году были удостоены Нобелевской премии по физиологии или медицине за открытия в области генетической регуляции развития органов и за достижения в исследованиях программируемой клеточной смерти. В настоящее время установлены основные механизмы реализации апоптоза в эукариотических клетках, активно ведутся исследования регуляторов и активаторов апоптоза. Интерес учёных связан с возможностью применения знаний о программируемой клеточной смерти в медицине при лечении онкологических, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний. [4]

В организме среднестатистического взрослого человека в результате апоптоза погибает ежедневно порядка 50—70 миллиардов клеток. Для среднестатистического ребёнка в возрасте от 8 до 14 лет число клеток, погибших путём апоптоза, составляет порядка 20—30 миллиардов в день. Суммарная масса клеток, которые на протяжении 1 года жизни подвергаются разрушению, эквивалентна массе тела человека. При этом восполнение утраченных клеток обеспечивается за счёт пролиферации — увеличения клеточной популяции путём деления. [5]



Апоптоз человеческого лейкоцита. Микрофотография, сделанная с помощью сканирующего электронного микроскопа.


Апоптоз, обусловленный воздействием этопозида на клетки рака простаты из клеточной линии DU145. Последовательность изображений получена из 61-часовой покадровой видеосъёмки с использованием фазово-контрастной микроскопии. Оптическая толщина передаётся с помощью цвета: от серого до жёлтого, красного, фиолетового и, наконец, чёрного.

VIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2016


Апоптоз - программированная клеточная гибель, энергетически зависимый, генетически контролируемый процесс, который запускается специфическими сигналами и избавляет организм от ослабленных, ненужных или повреждённых клеток. Ежедневно, примерно около 5% клеток организма подвергаются апоптозу, а их место занимают новые клетки. В процессе апоптоза клетка исчезает бесследно в течение 15-120 минут.

Запрограммированная клеточная гибель это биохимически специфический тип гибели клетки, который характеризуется активацией нелизосомных эндогенных эндонуклеаз, которые расщепляют ядерную ДНК на маленькие фрагменты. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец (“апоптотические тельца”), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками.

Апоптоз ­- энергозависимый процесс, посредством которого удаляются нежелательные и дефектные клетки организма. Он играет большую роль в морфогенезе и является механизмом постоянного контроля размеров органов. При снижении апоптоза происходит накопление клеток, пример - опухолевый рост. При увеличении апоптоза наблюдается прогрессивное уменьшение количества клеток в ткани, пример - атрофия.

Морфологические проявления апоптоза.

Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз - в отличие от некроза - никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление.

Наиболее четко морфологические признаки выявляются при электронной микроскопии. Для клетки, подвергающейся апоптозу характерно:

Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы. Этот фермент вызывает прогрессивное образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия.

Конденсация хроматина. Это наиболее характерное проявление апоптоза. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро же может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм конденсации хроматина изучен достаточно хорошо. Он обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований делится на 180-200. При электрофорезе фрагменты дают характерную картину лестницы. Эта картина отличается от таковой при некрозе клеток, где длина фрагментов ДНК варьирует.

Формирование в цитоплазме полостей и апоптотических телец. В апоптотической клетке первоначально формируются глубокие впячивания поверхности с образованием полостей, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра.

Фагоцитоз апоптотических телец. Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками, или паренхиматозными, или макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство. Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на этих клетках: они захватывают и поглощают апоптотические клетки. Один из таких рецепторов на макрофагах - рецептор витронектина, который является β3-интегрином и активирует фагоцитоз апоптотических нейтрофилов.

Участие апоптоза в физиологических и патологических процессах

Запрограммированном разрушении клеток во время эмбриогенеза (включая имплантацию, органогенез). Несмотря на то, что при эмбриогенезе апоптоз не всегда является отражением “запрограммированной смерти клетки”, это определение апоптоза широко используют различные исследователи.

Гормон-зависимой инволюции органов у взрослых, например, отторжение эндометрия во время менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессия молочной железы после прекращения лактации.

Удалении некоторых клеток при пролиферации клеточной популяции.

Гибели отдельных клеток в опухолях, в основном при ее регрессии, но также и в активно растущей опухоли.

Гибели клеток иммунной системы, как В -, так и Т-лимфоцитов, после истощения запасов цитокинов, а также гибели аутореактивных Т-клеток при развитии в тимусе.

Патологической атрофии гормон-зависимых органов, например, атрофии предстательной железы после кастрации и истощении лимфоцитов в тимусе при терапии глюкокортикоидами.

Патологической атрофии паренхиматозных органов после обтурации выводных протоков, что наблюдается в поджелудочной и слюнных железах, почках.

Гибели клеток, вызванных действием цитотоксических Т-клеток, например, при отторжении трансплантата и болезни “трансплантат против хозяина”.

Повреждении клеток при некоторых вирусных заболеваниях, например, при вирусном гепатите, когда фрагменты апоптотических клеток обнаруживаются в печени, как тельца Каунсильмана.

Гибели клеток при действии различных повреждающих факторов, которые способны вызвать некроз, но действующих в небольших дозах, например, при действии высокой температуры, ионизирующего излучения, противоопухолевых препаратов.

Биохимия апоптоза.

Активация цистеиновых (и некоторых других) протеаз — наиболее универсальная черта программируемой клеточной гибели независимо от организма, в котором она происходит. Основные участники программируемой клеточной гибели, каспазы («caspase» от «cysteine aspase») — это семейство эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки по остаткам аспарагиновой кислоты. В настоящее время идентифицировано 10 каспаз. При апоптозе помимо активации цистеиновых протеаз, у растений выявлено возрастание активности сериновой и аспарагиновой протеаз.

Кроме того, в апоптозе принимают участие и другие протеазы, прежде всего, кальпаины, или Са2+-зависимые протеазы и убиквитин (протеаза, ковалентно связывающаяся с белком-мишенью). Эти протеазы — обязательный компонент каскада протеолитических ферментов. Так, ингибиторы кальпаина блокируют апоптоз. Убиквитин-протеосомный путь деградации белков активируется при апоптозе.

Роль каспаз в апоптозе разнообразна. Результатом активности протеаз являются характерные изменения в морфологии клеток при апоптозе.1. Гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к распаду ядерной оболочки и конденсации хроматина. Мишенями протеаз при апоптозе являются также белки ядрышек, гистоны и негистоновые белки и топоизомераза. Топоизомераза — связующее звено между ДНК хроматина и белковыми структурами ядра, с помощью которого хроматин прикрепляется к ядерному матриксу. Расщепление топоизомеразы — это этап образования высокомолекулярных фрагментов ДНК.

2. Расщепление антиапоптозных белков — протеолиз ингибитора ДНКазы, ответственной за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором 1CMiwm DFF (DNA fragmentation factor). При апоптозе ингибитор Гмс участием каспаз 3 и 7 инактивируется и свободная CAD, вызывая нуклеосомные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах — 180-200 пар нуклеотидов. Эти фрагменты и дают характерную лесенку ДНК при электрофоретическом разделении в агарозном геле. Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК. Обнаружен ядерный белок ACCINVS (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), который при комбинированном действии каспазы 3 и неидентифицированной протеазы расщепляется на фрагменты. Один из них в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК. Кроме непосредственной активации нуклеаз, протеазы (путем ограниченного протеолиза) устраняют структурное разобщение между нуклеазами и ДНК в составе хроматина, удаляют белки, защищающие ДНК.3. Угнетение репарации ДНК: инактивирование и нарушение регуляции белка, участвующего в репарации ДНК, а также в сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли-(АДФ-рибозо)-полимераза (ПАРП), которая участвует в репарации ДНК (катализирует полиАДФ-рибозилирование белков, связанных с ДНК). Донором АДФ-рибозы является NAD'. Активность ПАРП-полимеразы возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. ПАРП участвует в репарации поврежденной ДНК, регуляции активности эндонуклеаз, поддержании структуры хроматина посредством АДФ-рибозилирования. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. При массированных разрывах ДНК чрезмерная активация ПАРП, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD*, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по пути некроза.4. Разрушение белков цитоскелета. Деградация структурных и функциональных белков митотического аппарата.5. Участие в экспрессии генов. Эта функция связана с протеолизом репрессоров и с образованием пептидов, регулирующих транскрипцию (модификация факторов транскрипции). Субстратом протеаз является, например, гистон, выступающий репрессором генов.6. Одна из функций протеаз — передача апоптозного сигнала от индукторов апоптоза. Сигналы могут быть трансмембранными, рецептор-зависимыми. Рецепторами служат трансмембранные белки. Протеазы принимают участие либо непосредственно при взаимодействии индукторов апоптоза с рецепторами, либо через активацию протеинкиназ, играющих важную роль в передаче трансмембранного сигнала с целого ряда рецепторов.Локализация протеаз в различных отделах (компартментах) клетки способствует эффективной трансмембранной передаче сигналов программируемой клеточной гибели. Часть протеаз связаны с мембранами (цитоплазматической, ядерной, мембранами органелл или вакуоли) — это мембраносвязанные протеазы. Другие — находятся в матриксе ядра, цитоплазмы или органелл. Аспарагиновая протеаза растений, по всей видимости, локализована в вакуоли. Предполагается, что сериновые протеазы локализуются в цитоплазме и в ядре. Известно, что в ядрах протеазы могут быть прочно ассоциированы с хроматином и, в том числе, непосредственнно с гистонами. Перемещение протеаз в клетке может сопровождаться их активацией. Например, повышение концентрации Ca2+ внутри клетки способствует перемещению Са2+-зависимой протеазы и протеинкиназы из цитоплазмы в мембрану. При этом происходит автокаталитическая активация неактивных форм протеазы.Так, активация некоторых протеаз может быть обусловлена увеличением концентрации кальция в клетках, наблюдаемой при разных типах апоптоза (раздел выше). АФК также могут быть непосредственными индукторами активации протеаз. Появление локальных участков однонитевой ДНК активирует, например, ядерные ДНК-зависимые сериновые протеазы, специфичные к гистону.

Множество ветвей сигнальной трансдукции перепроверяет правильность выбранного алгоритма событий на пути к апоптозу, уберегая клетку от бессмысленной гибели. Выявлено несколько механизмов, ограждающих клетку от случайного самоуничтожения с участием протеаз.

Во-первых, протеазы синтезируются в клетке в неактивной форме, а процессинг неактивных форм протеаз происходит путем автолиза или путем протеолиза другими протеазами. Например, каспазы синтезируются в клетке в виде прокаспазы — неактивного мономера с молекулярной массой 30-50 кДа. Активные формы — тетрамеры, содержащие по две субъединицы: (р 10 — р20)2 (рис. 9.7). Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1-2% активности зрелой каспазы. Механизм протеолитического само- или перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга), а затем пространственного сближения ведет к образованию активных каспаз. От прокаспазы отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (около 20 кДа) и малую (около 10 кДа) субъединицы. Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими центрами, работающими независимо. Первоначально концентрация каспаз в клетке ничтожна. Благодаря свойству автокатализа, концентрация активных каспаз может возрастать лавинообразно.Во-вторых, протеазы обратимо взаимодействуют с эндогенными белковыми ингибиторами, образуя неактивные комплексы (латентные комплексы описаны для цистеиновых, Са2+-зависимых и некоторых других протеаз). При действии различных индукторов апоптоза происходит диссоциация неактивных комплексов протеаза-ингибитор. Обратимое взаимодействие Са2+-зависимых протеаз с эндогенными ингибиторами регулируется кальцием. Цистеиновая протеаза связывается ковалентно с ингибитором через дисульфидную связь. Высвобождение и активация каспазы происходит в результате тиол-дисульфидного обмена и сопряжена с окислительно-восстановительным состоянием клетки и метаболизмом глюкозы.В-третьих, протеазы могут быть компонентами специальных рецептор-зависимых систем. Так, [рецептор + лиганд + адаптер + прокаспаза] формируют специфический агрегат, в котором происходит активация каспаз. Такой агрегат называют апоптосомой или апоптозным шапероном. Самое интересное, что выявлены консервативные области гомологии (в том числе NB-область) белка адаптера у животных и продуктов генов резистентности у растений, включая томат, арабидопсис и табак. Более того, белки похожи структурно. Предполагается, что продукты гена резистентности могут играть роль адаптеров в апоптосоме. Таким образом, при узнавании продукта авирулентности, по всей видимости, происходит диссоциация апоптосомы и развертывание программы апоптоза.

Продукты генов резистентности, по-видимому, ответственны за эффективность гибели клеток при заражении — узнавание факторов и запуск машины самоуничтожения, за первые (самые важные) шаги на пути к стремительной гибели клетки.Существует несколько путей реализации программы ПКГ. Путь передачи сигнала: индукторы — рецепторы — адаптеры — каспазы первого эшелона — регуляторы — каспазы второго эшелона. Рецептор взаимодействует с лигандом. Насколько обратима гибель клетки? На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона. После активации каспазами первого эшелона каспаз второго эшелона путем протеолиза из прокаспаз процесс, запушенный программой смерти, становится необратим. Эти каспазы способны в дальнейшем к самоактивации (автокатализу или автопроцессингу) и активируют фактор фрагментации ДНК на нуклеосомные фрагменты. Вернемся к митохондриям. Апоптотическое изменение митохондрии может индуцироваться окислительным стрессом, повышением концентрации Ca2+. При апоптозе из межмембранного пространства митохондрий высвобождаются белки — апоптогенные факторы:

AIF (Apoptosis Inducing Factor) — флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа. Будучи добавлен к изолированным ядрам, он вызывает конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК, а при добавлении к изолированным митохондриям — высвобождение цитохрома С и каспазы 9. Высвобождаемый цитохром С вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) образует комплекс с прокаспазой. APAF-I играет роль арматуры, на которой происходит аугокаталитический процессинг каспазы 9 (мультимерная арматура APAF1-цитохром-С-комплексов напоминает пропеллер). Обнаружены ингибиторы высвобождения цитохрома С, блокирующие апоптоз, например, белок Bel.

Список используемой литературы:

Гордеева А.В., Лабас Ю.А., Звягильская Р.А.Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция Биохимия, 2004, том 69, вып. 10, с. 1301—1313

Голубев А.М., Москалева Е. Ю., Северин С.Е., Веснянко Т.П., Кузовлев А.Н., Алкадарский А.С., Порошенко Г.Г. Апоптоз при критических состояниях

Апоптоз - базовая причина неврологических и кардиоваскулярных патологий

Концепция апоптоза как явления "запрограммированной" гибели клеток приобретает в последнее время все больше фактов и вариантов ее приложения к базовым вопросам современной медицины.

Термин "апоптоз" впервые был предложен в 1972 г. для обозначения генетически обусловленного процесса разрушения клетки и характеризуемого ее сжатием, агрегацией хроматина и деструкцией клеточного ядра. Апоптоз рассматривается как естественный биологический механизм, который способствует ликвидации "ненужных" клеток и тканей. Биологическая "цель" этого явления состоит в удалении нежелательных клеток в процессе индивидуального развития, при защитных реакциях, старении. Физиологическое назначение апоптоза состоит в селекции разновидностей и качества клеток внутри популяции, в том числе удалении клеток с генетическими дефектами, а также поддержании численности клеток тканевой популяции на функционально необходимом уровне.

Эмбриональное и постэмбриональное развитие мозга сопровождается изменениями числа, структуры и функциональных "качеств" нервных клеток. Соотношение процессов возникновения новых структур и ликвидации "ненужных" клеток регулируется апоптическими процессами. Закономерный характер апоптозных реакций прослеживается как на субклеточном уровне (митоптоз - ликвидация митохондрий), так и в целом организме - в процессе индивидуального развития, когда наблюдаются регрессия рудиментарных органов, перестройка клеточного пула при росте и дифференцировке тканей.

В "нормальной" ткани механизмы апоптоза пребывают под регулируемым генетическим контролем. Как было недавно установлено, ограничение апоптозного механизма в нейронах эмбрионального мозга, регулируемое нейротрофическими ростовыми факторами и особыми белками, ведет к увеличению числа синапс - образующих клеток нейрональной популяции в целом.

Однако помимо общебиологического (общефизиологического) значения это явление оказывается значимым в процессах онкообразования, аутоиммунных патологиях, вирусных инфекциях, сердечно-сосудистых заболеваниях. Это представление получает также все большее число иллюстраций при изучении неврологических патологий. За последние пять лет, согласно информации Medline, по проблеме апоптоза опубликовано около 40 тыс. экспериментальных и клинических статей.

НЕЙРОАПОПТОЗ

Биохимические и морфоцитологические признаки апоптоза выявляются в большом спектре экспериментальных нейродегенеративных расстройств: транзиторной церебральной ишемии, вызванной окклюзией церебральной артерии; интрацеребральной геморрагии; на моделях эпилептогенных судорог, локальном термическом повреждении мозга. Апоптоз включается в патологии любых проявлений ишемических и травматических повреждений нервной ткани, включая нарушения спинного мозга, деменциальные изменения, связанные с развитием болезней Альцгеймера, Паркинсона, сенильной деменцией, врожденными патологиями мозга и др. Таким образом, можно говорить о нейроапоптозе как новом патобиохимическом механизме нейродегенеративных расстройств широкого спектра.

Основное для понимания апоптоза как принципиально нового морфо-биохимического процесса, отличного от некроза, - включение специализированных биохимических механизмов, в результате которых происходит разрыв молекулы ДНК и уничтожение белоксинтезирующих структур. Апоптоз развивается как каскадный процесс, который сопровождается активацией (индукцией образования) специфических про- или антиапоптических белков, а также особых протеолитических ферментов - каспаз.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА

1. Нарушение энергетического потенциала митохондрий.

2. Образование активных форм кислорода (АФК).

3. Запуск "специализированных" биохимических систем.

4. Деструкция ДНК.

5. Морфологическая гибель клетки, ткани, организма.

Среди факторов запуска апоптоза следует отметить образование активных форм кислорода как "извращенного" пути окислительного метаболизма в клетке. Считается, что повреждения, развивающиеся в результате аноксии или ишемии ткани любого уровня, обязаны в первую очередь образованию АФК. Первичным источником АФК оказываются митохондрии, которые играют ключевую роль в энергетическом обеспечении клетки. Ныне существует обобщенное клиническое понятие "митохондриальная патология": повреждение мембран митохондрий ведет к образованию супероксидных радикалов, которые, реагируя с NO, образуют пероксинитриты, "повреждающие" молекулы АФК.

В точных биохимических исследованиях было установлено, что нарушение "нормальной" аккумуляции Са++ митохондриями, высвобождение апоптогенных белков из поврежденных митохондрий в цитозоль служат механизмами, ответственными за индукцию апоптоза. В этом контексте существенна роль одного из нейротрофических факторов - фактора некроза опухоли (TNF-(), с которым связаны открытие пор в митохондриях, последующий разрыв их мембраны и высвобождение проапоптических белков в цитозоль клетки.

Факторы, последовательно включающиеся в апоптоз:

1.Гиперпродукция экзайтоксических (excitoxic - возбуждающие) аминокислот и длительная активация глутаматных рецепторов, выраженные при нарушении функции нервных клеток вследствие возрастных нейродеструктивных процессов, болезни Альцгеймера, паркинсонизме, при остром нарушении мозгового кровообращения.

2.Образование АФК, которые стимулируют синтез провоспалительных цитокинов, включающихся в каскад апоптических процессов.

3. Экспрессия группы рецепторов и проапоптических белков (FAS, APO-1 и др.). Один из наиболее значимых в этой группе - белок p53.

4. Включение каскада протеолитических реакций, приводящих к расщеплению белков ядерного матрикса, дестабилизации структуры хроматина ядер, фрагментации ДНК, нарушению репликационной и метаболической функций клетки. Среди ферментов, причастных к разветвленной цепи апоптоза, ведущее место принадлежит каспазам, относящимся к семейству 1-интерлейкин-конвертирующих протеаз.

5. Участие специфических регуляторных белков, препятствующих реализации апоптозной программы. Один из них - белок bcl-2 оказывает защитное действие на многие типы клеток, пребывающие в неблагоприятных условиях. В исследованиях in vitro для оценки апоптоза используется отношение белков bcl-2/Bax; избыток первого способствует выживанию клетки, избыток второго - ее гибели.

Баланс про- и антиапоптических механизмов связан с оксидом азота (NO), различные пути образования которого могут определять как цитотоксическое, так и цитопротекторное его действие. Длительная генерация NO провоцирует развитие апоптоза: усиливается синтез белка р53 и активируются протеазы из семейства каспаз.

Принято считать, что каскад апоптозных процессов может быть спровоцирован либо прямым действием на геном клетки (вирусы), либо через нейромедиаторы (глутамат), либо причинами, связанными с ишемией клетки, ее физическим повреждением, реперфузией, токсическим воздействием. Биохимические процессы, сопровождающие апоптоз, проявляются экспрессией специфических генов и синтезом особых белков клетки, запускающих реакции апоптоза. Число таких "инициаторов", связанных с патологиями различной этиологии, оказывается значительным. Такая полиэтиологичность предопределяет инициацию апоптоза при многих патологических состояниях - как всего организма, так и отдельных его органов или клеточных популяций (см. рис.).

Биохимические и цитоморфологические исследования апоптоза выявляют несколько стадий его развития в поврежденной нервной ткани: непосредственную и отсроченную. Как правило, исходное повреждение ткани не ограничивается областью воздействия разрушающей силы, а, продолжаясь во времени, захватывает первично интактные клетки и приводит к расширению очага повреждения.

Поскольку апоптоз рассматривается в качестве патохимического механизма клеточной гибели, представляет собой фазный процесс и, следовательно, имеет обратимые этапы, возможно рассмотрение подходов к фармакологическому вмешательству в его регуляцию. Существенной оказывается оценка условий, благодаря которым, переходя необратимую грань, апоптоз приводит к тотальным последствиям, гибели большого массива функционально значимых клеток и смерти всего организма. К этим условиям относятся характер и величина травмирующего воздействия, степень сбалансированности клеточных биохимических систем, противостоящих необратимому развитию апоптоза, возможность своевременного применения реабилитационных мероприятий защиты структур мозга, кардиоваскулярной системы и организма в целом.

РОЛЬ НЕЙРОПЕПТИДОВ И НЕЙРОТРОФИНОВ

Существует определенная параллель между информацией об участии нейропептидов и нейротрофических факторов роста в патогенезе неврологических расстройств и причастностью этих химических регуляторов к нейроапоптозу. Среди нейротрофических ростовых факторов (см. "МГ" № 30 от 17.04.02) выявляются те, которые играют роль индукторов апоптических процессов или, наоборот, противодействующих развитию нейроапоптоза. Например, в исследованиях последних месяцев подтверждено участие фактора некроза опухоли (TNF-() в апоптозе глиальных и нейрональных клеток как следствии аутоиммунной нейропатологии и патологии мультисклероза. Ассоциируемое с болезнью Гентингтона образование свободнорадикальных продуктов, провоцируемое в эксперименте внесением дофамина, ингибировалось в нейронах стриатума нейротрофическим фактором мозга (BDNF).

Новым направлением в исследовании нейропептидов стало определение их роли в регуляции апоптоза. Наряду с данными, свидетельствующими об участии вазоактивного пептида эндотелина-1 и его рецепторов (ЕТА) в ишемической патологии мозга, получена информация об антиапоптической активности этого пептида. На ряде моделей нейроапоптоза было также продемонстрировано защитное действие кальцитонинового нейропептида (CGRP) и пептидного фрагмента ангиотензина IV. В то же время было установлено, что сам ангиотензин II, также как и пептид кальцийнейрин, напротив, способствует индукции проапоптического каскада. Эти факты, демонстрирующие значимость нейропептидов и ростовых факторов в нормальной и патологической деятельности мозга, отражают организацию поливариантной системы химической регуляции, обеспечивающей как жизнеспособность и защиту нейронов от неблагоприятных влияний, так и программируемую гибель определенной части клеточной популяции в случае повреждения мозга. Открытие нейротрофических пептидных факторов побудило к формированию новой стратегии - пептидергической, или нейротрофной терапии нейродегенеративных патологий. Исходная идеология связывает нейродегенеративные патологии, включая болезнь Альцгеймера, с активностью различных нейротрофических факторов мозга и нейропептидов. На этой основе был разработан ряд препаратов, успешно применяемых в терапии большого спектра неврологических расстройств. Наибольший успех здесь выпал на долю церебролизина, уже в течение двух десятков лет успешно используемого в клинике неврологических и психиатрических заболеваний.

АПОПТОЗ В КАРДИОВАСКУЛЯРНЫХ КЛЕТКАХ

Признаки апоптоза выявляются также при различных формах сердечно-сосудистых патологий: дисфункции эндотелия, "чрезмерном" напряжении сосудистой стенки, ишемических и реперфузионных ее нарушениях, атеросклеротических изменениях, инфаркте миокарда, ишемическом инсульте и др. В перикардиальной жидкости пациентов с ишемической патологией миокарда обнаружен митогенактивирующий белок р38, участвующий в запуске апоптических процессов. Известно также, что при кардиоваскулярных расстройствах, сочетающихся с диабетом, в миоцитах и эндотелиоцитах обнаруживаются активированные апоптозные продукты. Недавно были опубликованы клинические результаты, согласно которым определенные белки апоптозного каскада могут быть использованы как маркеры повреждения миокарда при стадийной ИБС.

Физиологически активные пептиды (ангиотензин II, эндотелин-1, брадикинин, адреномедуллин и натрийуретические факторы) вносят свой "вклад" в развитие процессов, связанных с дисфункцией эндотелия и развитием клеточного апоптоза. Очевидно, немаловажная роль принадлежит также нейротрофическим ростовым полипептидам (фактору опухолевого роста, трансформирующему ростовому фактору, фактору роста фибробластов, эндотелиальному фактору роста сосудов, инсулиноподобному фактору роста и др.), а также специфическим белкам клеточной адгезии и мембранного взаимодействия - интегринам и селектинам. Регуляторные пептиды и нейротрофические ростовые факторы могут выполнять функцию как проапоптических (провоцирующих, индуцирующих), так и антиапоптических агентов при кардиоваскулярной патологии. Их соотношение играет ключевую роль в стадийном формировании необратимых повреждений миоцитов, эндотелиальных и васкулярных клеток и превращения патологии в глобальный феноптический процесс.

Как известно, патология "гипертонического сердца" сопровождается гипертрофией левого желудочка, ведущей к ремоделированию миокарда, недостаточной васкуляризации, фиброзу, уменьшению числа функциональных кардиомиоцитов и сократительной способности сердца в целом. За все эти явления ответствены апоптозные процессы, спровоцированные хронической ишемией и перегрузкой больного сердца. Исследования последнего периода показывают, что апоптозная гибель кардиомиоцитов служит решающим фактором в переходе к компенсаторной гипертрофии и нарушению насосной функции сердца при артериальной гипертензии. Условия, провоцирующие экспрессию химических механизмов апоптоза в "перегруженном" сердце, включают чрезмерное механическое напряжение миоцитов, гипоксию и окислительный стресс, активацию нейрогуморальных факторов и цитокинов. Все эти явления сопряжены между собой и составляют звенья единого патогенетического процесса.

Особенно значимы исследования, связанные с ангиотензином II и образующим его ферментом АПФ. Исследования роли ангиотензина II в механизмах окислительного стресса и эндотелиальной дисфункции логично привели к рассмотрению роли этого пептида в индукции апоптоза кардиальных, васкулярных и эндотелиальных клеток. Принципиальным оказывается вывод, что повышенный уровень ангиотензина II сопряжен с активностью некротического и трансформирующего ростовых факторов, а также специфических апоптозных белков (bcl-2, p53), особых ферментов (каспаз), каскадная динамика которых приводит к деградации молекулы ДНК на фрагменты и последующей "запрограммированной" гибели клетки.

Проапоптозный, патогенетический, эффект ангиотензина II может быть заблокирован использованием соответствующих препаратов.

Рассматривая проблему апоптоза как сложный биологический и патохимический феномен, можно определить, что как нейропептиды, так и нейротрофические факторы представляют в данном случае показательный пример участия в поливариантной системе контроля функций на всех "этажах" физиолого-биохимической организации. Эти химические соединения служат элементами глобальной информационно-регуляторной сети организма, определяющей его жизнь и смерть.

В настоящее время открыт, по сути, базовый биохимический механизм неврологических, кардиоваскулярных, онкологических и других патологий. Очевидно, последующие работы и исследования специфической роли систем химических регуляторов представят новые возможности диагностики и терапии этих заболеваний.

Типы каспаз и их участие в регуляции апоптоза

Онкология:

Роль каспаз в апоптозе клетки. Функции каспаз

Центральная роль в исполнении программы апоптоза принадлежит специфическим протеолитическим ферментам каспазам — семейству цистеиновых протеиназ, расщепляющих субстрат в сайтах, следующих за остатками аспарагиновой кислоты (CASPASE — Cysteinyl Aspartat specific proteinase). Вне апоптогенного сигнала каспазы предсуществуют в клетке в форме проэнзимов с незначительной протеолитической активностью.

Наличие готовых к использованию белковых молекул позволяет в нужный момент даже в условиях подавления транскрипции и белкового синтеза быстро подготовить их для выполнения программы апоптоза. Несмотря на различное предназначение, все каспазы обладают значительной структурной гомологией и активируются по одной схеме: малоактивный проэнзим, состоящий из одной полипептидной цепи, подвергается протеолитическому процессингу, в результате которого от молекулы отщепляется N-концевой регуляторный домен, а оставшаяся часть разрезается на две неравные субъединицы, образующие функционально активный гетеродимер; два гетеродимера объединяются в тетрамер активного фермента.

Было бы неверным полагать, что каспазы существуют в клетке исключительно в латентном состоянии в ожидании сигнала к исполнению суицидного акта. Функции активных каспаз в клетке не ограничены исключительно исполнением программы гибели: каспазы-1, -4, -5 и -13 (нумерация соответствует хронологии открытия отдельных ферментов) принимают участие в биосинтезе цитокинов, т. е. участвуют в процессах межклеточной сигнализации.

Например, прежнее наименование каспазы-1 — ICE прямо свидетельствует об этой роли фермента — ИЛ-1-b конвертаза (Interleukin-1b converting enzyme).

апоптоз и каспазы

Непосредственно с реализацией программы клеточной гибели связывают действие нескольких ферментов класса каспаз. Принято выделять инициирующие (каспазы-2, -8, -9, -10, -12), участвующие в трансдукции сигнала апоптоза путем трансактивации «нижестоящих» каспаз, и собственно «нижестоящие» эффекторные (или «казнящие») ферменты (каспазы-3, -6, -7), активация которых означает наступление финальной и быстрой стадии «исполнения приговора»: субстратами эффекторных каспаз (в настоящее время известно более 80 таких субстратов) являются жизненно важные для клетки белки — ICAD, PARP, топоизомераза-I, ламины ядерной стенки, микрофиламенты цитоскелета, антиапоптозные белки семейства Вс1-2, гистон HI и др..

Так, в результате деградации PARP [poly-(ADP-ribose)polymerase] прекращается репаративный синтез ДНК; гидролиз гистона HI открывает доступ к межнуклеосомным участкам ДНК для ДНК-фрагментирующего фактора DFF (он же CAD — Caspase-Activated DNase) при каспазазависимом разрушении ICAD (Inhibitor of CAD). Результатом межнуклеосомной фрагментации ДНК является формирование «лестницы ДНК» на электрофореграммах — характерный биохимический признак апоптоза.

Финальной стадии «исполнения приговора» предшествуют минимум две стадии развития событий: акцепция сигнала апоптоза (апоптогенного стимула) и анализ его на соответствие прочим сигналам, в том числе сигналам выживания, совокупность которых часто называют «клеточным контекстом».

Читайте также: