ИФА в диагностике вирусных гепатитов. Возможности иммуноферментного анализа

Обновлено: 17.05.2024

Anti-HCV - специфические иммуноглобулины классов IgM и IgG к белкам вируса гепатита С, свидетельствующие о возможной инфицированности или ранее перенесенной инфекции.

Синонимы русские

Суммарные антитела к вирусу гепатита С.

Синонимы английские

Antibodies to Hepatitis C Virus, IgM, IgG; HCVAb, Total.

Метод исследования

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Вирус гепатита С (ВГС) - РНКсодержащий вирус из семейства Flaviviridae, который поражает клетки печени и вызывает гепатит. Он способен размножаться в клетках крови (нейтрофилах, моноцитах и макрофагах, В-лимфоцитах) и ассоциирован с развитием криоглобулинемии, болезни Шегрена и В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний. Среди всех возбудителей вирусных гепатитов у ВГС наибольшее количество вариаций, а благодаря высокой мутационной активности он способен избегать защитных механизмов иммунной системы человека. Существует 6 генотипов и множество субтипов вируса, которые имеют разные значения для прогноза заболевания и эффективности противовирусной терапии.

Основной путь передачи инфекции - через кровь (при переливании элементов крови и плазмы, пересадке донорских органов, через нестерильные шприцы, иглы, инструменты для татуирования, пирсинга). Вероятна передача вируса при половом контакте и от матери ребенку во время родов, но это происходит реже.

Острый вирусный гепатит, как правило, протекает бессимптомно и остается невыявленным в большинстве случаев. Только у 15 % инфицированных заболевание протекает остро, с тошнотой, ломотой в теле, отсутствием аппетита и потерей веса, редко оно сопровождается желтухой. У 60-85 % зараженных развивается хроническая инфекция, что в 15 раз превышает частоту хронизации при гепатите В. Для хронического вирусного гепатита С характерна "волнообразность" с повышением печеночных ферментов и слабовыраженными симптомами. У 20-30 % больных заболевание приводит к циррозу печени, увеличивая риск развития печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы.

Специфические иммуноглобулины вырабатываются к ядру вируса (нуклеокапсидному белку core), оболочке вируса (нуклеопротеинам Е1-Е2) и фрагментам генома вируса гепатита С (неструктурным белкам NS). У большинства больных ВГС первые антитела появляются через 1-3 месяца после инфицирования, но иногда могут отсутствовать в крови больше года. В 5 % случаев антитела к вирусу так никогда и не обнаруживаются. При этом о ВГC будет свидетельствовать выявление суммарных антител к антигенам вируса гепатита С.

В острый период болезни образуются антитела классов IgM и IgG к нуклеокапсидному белку core. В период латентного течения инфекции и при ее реактивации в крови присутствуют антитела класса IgG к неструктурным белкам NS и нуклеокапсидному белку core.

Антитела к вирусу гепатита В

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Для корректной оценки результатов ваших анализов в динамике предпочтительно делать исследования в одной и той же лаборатории, так как в разных лабораториях для выполнения одноименных анализов могут применяться разные методы исследования и единицы измерения.

Напоминаем вам, что самостоятельная интерпретация результатов недопустима, приведенная ниже информация носит исключительно справочный характер

Антитела к вирусу гепатита В: показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Показания к назначению исследования

Основным показанием к назначению исследования служит гепатит В - инфекционное заболевание, вызываемое ДНК-содержащим вирусом, относящимся к семейству Hepadnaviridae. Вирус гепатита В высококонтагиозен и устойчив к действию факторов окружающей среды.

Источником инфекции являются больные любой формой острого или хронического гепатита, а также вирусоносители. Инкубационный период составляет от 60 до 120 дней.

Непосредственно сам вирус не повреждает клетки печени (гепатоциты). Поражение клеток печени происходит в результате иммунного ответа организма через повреждающее действие Т-лимфоцитов, в меньшей степени за счет образования антител.

Болезнь начинается постепенно и характеризуется наличием у пациента слабости, повышенной утомляемости, редкой головной болью, нарушением сна, снижением аппетита, тошнотой, иногда рвотой, горечью во рту, тяжестью и тупыми болями в правом подреберье. Примерно у 20-30% больных отмечаются боли в крупных суставах, сыпь, реже кожный зуд.

Затем увеличивается печень, появляются темная моча и недостаточно окрашенный кал, желтушность кожных покровов (хотя безжелтушный вариант течения вирусного гепатита В встречается в 20-40 раз чаще желтушного). Период выздоровления может продолжаться до 6 месяцев.

Гепатит В у беременных нередко протекает тяжелее, особенно во второй половине беременности, осложняясь острой печеночной недостаточностью, отслойкой плаценты, гибелью плода и др.

У новорожденных и детей вирусный гепатит, как правило, протекает бессимптомно, без классической желтухи, но в 70-90% случаев переходит в хроническую форму.

Гепатит В у пожилых людей часто имеет тяжелое течение, значительную продолжительность болезни и признаки холестаза (нарушение выработки желчи или ее оттока в двенадцатиперстную кишку с повышением в крови экскретируемых с желчью веществ, появлением кожного зуда, тяжести в правом подреберье, желтушности кожных покровов, потемнение мочи и обесцвечивание кала).

Выделяют острый и хронический гепатит В. Хроническая форма гепатита В диагностируется при обнаружении HBsAg (поверхностного антигена вируса гепатита В) в сыворотке крови в течение 6 и более месяцев.

В структуре вируса выделяют следующие антигенные структуры:

поверхностный антиген (HBsAg), входит в состав оболочки вируса, его обнаружение в крови пациента указывает на наличие инфекции;
ядерный антиген (HBсAg) - белок внутренней оболочки вируса гепатита В, синтезируется в зараженной клетке, не проникает через клеточную мембрану и поэтому не обнаруживается в сыворотке крови больного человека;
HBеAg - входит в состав ядра вируса гепатита В, наличие его в крови указывает на активное размножение вируса;
HBхAg -расположен около оболочки вируса, его роль изучается.

антитела к HBsAg - анти-HBsAg;
антитела к HBсAg обнаруживаются двух видов: анти-HBсAg IgМ и анти-HBсAg IgG;
антитела к HBеAg - анти-HBеAg.

диагностика вирусного гепатита В (в процессе первичного клинико-лабораторного обследования; перед плановыми хирургическими операциями; беременные женщины в I и III триместрах беременности; реципиенты и доноры крови и ее компонентов, органов и тканей; персонал медицинских организаций; пациенты перед проведением химиотерапии; больные с хроническими заболеваниями, пациенты наркологических и кожно-венерологических диспансеров; персонал учреждений с круглосуточным пребыванием; контактные лица в очагах острого и хронического гепатита В; дети в возрасте до 12 месяцев, рожденные от инфицированных ВГВ матерей; больные с онкологическими заболеваниями, пациенты на гемодиализе, пациенты на лечении иммунодепрессантами и др.);
подготовка к вакцинации и оценка иммунитета после вакцинации.

Подготовка к процедуре

Рекомендуется сдавать кровь утром с 8 до 11 часов, натощак (не менее 8 часов голода, пить воду можно в обычном режиме).
Предварительно проконсультируйтесь с врачом по поводу целесообразности проведения исследования на фоне принимаемых лекарств или возможности отмены приема препарата перед исследованием.
Исключить прием алкоголя накануне исследования, не курить в течение 1 часа до исследования.
Исключить физические и эмоциональные перегрузки накануне исследования.
После прихода в лабораторию отдохнуть 10-20 минут перед взятием крови.
Нежелательно сдавать кровь для лабораторного исследования вскоре после физиотерапевтических процедур, инструментального обследования и других медицинских вмешательств.
При контроле лабораторных показателей в динамике рекомендуется проводить повторные исследования в одинаковых условиях: в одной лаборатории (тем же методом), сдавать кровь примерно в одинаковое время суток и т. п.

Сроки исполнения

1 рабочий день, исключая день взятия крови.

Что может повлиять на результат

Кроме того, ложноположительный результат может быть у пациентов после переливания крови или компонентов плазмы.

Кровь на анализ берется из вены.

Метод определения: иммуноферментный анализ (ИФА).

Исследуемый материал: сыворотка крови.

Единицы измерения в лаборатории ИНВИТРО: мМЕ/мл.

Анализ крови на антитела к вирусу гепатита В может включать определение следующих показателей:

Показатель наличия защитного иммунитета против вируса гепатита В. Anti-HBs-антитела появляются в фазе выздоровления после острого гепатита В, обычно через 3 - 4 месяц.

Серологический маркёр острого процесса. Определяет присутствие антител класса M к HBcoreAg Антитела к HBсore антигену класса М начинают вырабатываться в период первог.

Свидетельство перенесённого острого гепатита В, показатель ремиссии. Определяет присутствие антител к HBеAg. Синтез антител к HBeAg в организме начинается после эл�.

Определяет присутствие антител к HB-core Ag, независимо от класса M или G. Функции. Антитела к HB-core антигену появляются при остром гепатите В в крови вскоре после появле�.

Сдать анализ крови на антитела к вирусу гепатита В можно в ближайшем медицинском офисе ИНВИТРО. Список офисов, где принимается биоматериал для лабораторного исследования, представлен в разделе «Адреса».

Интерпретация результатов исследования содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т. д.

Нормальные показатели

Антитела к вирусу гепатита В (анти-HBsAg, анти-HBсAg IgМ, анти-HBсAg IgG, анти-HBеAg) в сыворотке крови в норме отсутствуют и ответ выдается «отрицательно» (качественный тест) по каждому показателю.

Для контроля эффективности иммунитета при вакцинации против гепатита В используют количественное определение анти-HBs Ag.

Расшифровка показателей

Антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В (Anti-HBs Ag) можно обнаружить в конце острого периода, чаще через 3 месяца от начала инфекции, но иногда и позже (до года). Антитела к поверхностному антигену нейтрализуют вирус, их наличие рассматривают как признак иммунитета.

Anti-HBs Ag выявляются длительное время, могут сохраняться пожизненно и свидетельствуют о наличии инфекции (текущей или перенесенной ранее) или поствакцинальном иммунитете.

При количественном определении анти-HBs Ag:

Anti-HBs ниже 10 мМЕ/л - показана вакцинация против гепатита В;
Anti-HBs 10-100 мМЕ/л - вакцинацию следует отложить на 1 год;
Anti-HBs более 100 мМЕ/л - вакцинация не показана, рекомендовано повторное обследование через 5 лет.

Выявление анти-HBс IgМ свидетельствует об активном размножении вируса, о наличии острой инфекции, особенно при отрицательном результате на HBsAg, в некоторых случаях - о хроническом гепатите В.

При обнаружении анти-HBc IgM выдается ответ «положительно», в случае их отсутствия - «отрицательно», при очень низких значениях («серая зона») - «сомнительно, рекомендуем повторить через 10-14 дней».
Отрицательный результат на анти-HBc IgM не исключает наличия острого или хронического гепатита.

Антитела к HBсAg класса IgG появляются в острый период практически одновременно с анти-HBс IgМ, достигают максимальных значений через 5-6 месяцев от момента обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении всей жизни. Анти-HBс IgG - маркер хронической или перенесенной инфекции, вызванной вирусом гепатита В.

При обнаружении суммарных анти-HBc антител выдается ответ «положительно», в случае их отсутствия - «отрицательно». Положительный результат свидетельствует о наличии гепатита В. Отрицательный результат на суммарные анти-HBc не исключает гепатит B.

Анти-HBе появляются в острый период, сохраняются до 5 лет после перенесенной инфекции и указывают на активное выведение вируса гепатита В из организма и незначительное инфицирование. Их появление считается признаком благоприятного течения болезни, свидетельствуя о снижении скорости размножения вируса.

При обнаружении анти-HBе в сыворотке крови выдается ответ «положительно», в случае их отсутствия - «отрицательно» (качественный тест). Положительный результат свидетельствует о наличии инфекции (острый гепатит В фаза выздоровления или хронический гепатит В, а также хроническое бессимптомное носительство вируса гепатита В).

Отрицательный результат на анти-HBе не исключает наличия острого или хронического гепатита.

Расшифровку результатов лабораторных исследований на антитела к вирусу гепатита В проводят только с учетом выявления других маркеров гепатита. В таблице представлены некоторые критерии лабораторной диагностики нескольких вариантов течения инфекции, вызванной вирусом гепатита В.

Маркер	Острый гепатит В	Хронический гепатит В	Перенесенный гепатит В	Носительство гепатита В	Иммунитет после вакцинации
HBsAg	+	+	-	+	-
Anti-HBs Ag	-	-	+	-	+
анти-HBс Ag IgG	+	+	+	+	-
анти-HBс Ag IgМ	+	-	-	-	-
HBеAg	+/-	+/-	-	-	-
анти-HBеAg	-/+	-/+	+	-	-
ДНК вируса гепатита В	+	+	-	+/-	-
Активность АЛТ (аланинамино- трансфераза)	↑	норма	норма	норма	норма

Дополнительное обследование

При наличии антител к вирусу гепатита В в крови для уточнения диагноза и определения дальнейшей тактики лечения может быть назначено дополнительное обследование:

Синонимы: Анализ крови на австралийский антиген гепатита В; Поверхностный антиген гепатита В. Australia antigen (Au(1)); Australian antigen; Australia-Antigen. Краткое описание иссл�.

Методы исследования вирусов гепатита

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела.

Метод обнаружения с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого .

В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, соответствующих применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых.

Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой вначале заболевания (3-7 день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и более повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (JgM и JgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеинов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется.

Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, т. е. одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например вирус гепатита С.

ПЦР — это трехступенчатый процесс , повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в том числе и в материале, получаемом при биопсии;
возможна диагностика инфекционных болезней на самых разных стадиях заболевания;
возможность количественной оценки результатов исследований ( сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
высокая чувствительность метода.

Исследования вирусов гепатита

В настоящее время выделяют следующие формы вирусных гепатитов: гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, гепатит G и гепатит ТТ. Для диагностики каждой из перечисленных форм вирусных гепатитов используется определенный перечень маркеров.

Вирусный гепатит А

Гепатит А — острая энтеровирусная инфекция. Возбудитель — вирус гепатита А (ВГА,HAV) — энтеровирус типа 72. Геном вируса представлен однонитчатой РНК. Вирус гепатита А содержит единственный антиген (HA-Ag). Удельный вес гепатита А в суммарной заболеваемости вирусными гепатитами составляет 70-80%. В структуре заболеваемости гепатитом А дети составляют до 80%, причем основная масса — дошкольники и школьники начальных классов.

Вирусный гепатит В

Гепатит В - вирусная антропонозная инфекция. Возбудитель вирус гепатита В (ВГВ, HBV) - относится к семейству гепаднавирусов, ДНК-содержащих вирусов, поражающих клетки печени. Вирионы ВГВ имеют наружную липопротеидную оболочку и нуклеокапсид, содержащий двунитчатую ДНК и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу.

поверхностный («австралийский») антиген, HBsAg, находящийся в составе липопротеидной оболочки ВГВ, является маркером ВГВ, указывая на инфицированность вирусом;
ядерный (core), HBcAg - обнаруживается в составе нуклеокапсида вирионов, свидетельствует об активной репродукции вируса;
HBeAg - входит в состав ядра ВГВ, указывая на активность вируса и, кроме того, на его высокую вирулентность и инфицированность;
HBxAg - расположен вблизи оболочки вириона, его роль в генезе инфекции изучается.

В диагностике вирусного гепатита В ведущее значение имеет определение комплекса маркеров гепатита. Свыше 5% населения планеты охвачено этой инфекцией, а частота безжелтушных форм ВГВ составляет, по данным разных авторов, от 60 до 82%.

Вирус гепатита С, генотипы

Гепатит С (ВГС) - вирусное заболевание, наиболее часто протекающее в виде посттрансфузионного гепатита с преобладанием безжелтушных и легких форм и склонное к хронизации процесса.

Возбудитель - вирус гепатита С - имеет сходство с флавовирусами, содержит РНК. На основе филогенетического анализа выделено 6 генотипов ВГС и более 80 субтипов.

Генотип 1 - наиболее распространенный генотип во всем мире (от 40 до 80%). Генотип 1а является доминирующим для США, а 1b преобладает в Западной Европе и Южной Азии.

Генотип 2 распространен во всем мире, однако встречается с меньшей частотой, чем генотип 1 (от 10 до 40%).

ВГС тип 3 характерен для Индии, Пакистана, Австралии и Шотландии. Генотип 4 распространен преимущественно в Средней Азии и Египте, генотип 5 - в Южной Африке, а генотип 6 - в Гонконге и Мокао.

Примерно 90% всех случаев посттрансфузионных гепатитов связано с ВГС. Среди доноров антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) обнаруживают в 0,2-5% случаев.

У 40-75% пациентов регистрируется бессимптомная форма болезни, у 50-75% больных острым ВГС формируется хронический гепатит, у 20% из них развивается цирроз печени. Важная роль ВГС отводится и в этиологии гепатоклеточной карциномы.

Геном вируса гепатита С представлен одноцепочечной положительно заряженной РНК, которая кодирует 3 структурных и 5 неструктурных белков. К каждому из этих белков вырабатываются антитела, обнаруживаемые в крови больных гепатитом С.

Отличительной чертой ВГС является волнообразное течение заболевания, в котором разграничивают 3 фазы: острую, латентную и фазу реактивации.
Для острой фазы характерно повышение активности печеночных ферментов в сыворотке крови, уровня антител класса IgM и IgG к ВГС с нарастанием титров, а также РНК ВГС.

Латентная фаза характеризуется отсутствием клинических проявлений, наличием в крови антител класса IgG к ВГС в высоких титрах, отсутствием антител класса IgM и РНК ВГС либо их присутствием в низких концентрациях на фоне незначительного повышения активности печеночных ферментов в периоды обострения.
Для фазы реактивации характерно появление клинических признаков, повышение активности печеночных ферментов, наличие антител класса IgG (к нуклеокапсидному белку core и неструктурным белкам NS) в высоких титрах, присутствие РНК ВГС и нарастание титров антител класса IgM к ВГС в динамике.

Вирусный гепатит D

Гепатит D - вирусная инфекция, вследствие биологических особенностей вируса протекающая исключительно в виде ко- или суперифекции при гепатите В, характеризующаяся тяжелым течением,
часто неблагоприятным исходом.

Самостоятельно, без вируса В, вирус гепатита D не может попасть в организм человека

Возбудитель - вирус гепатита D (ВГD), по своим биологическим свойствам приближается к вироидам - обнаруженным молекулам нуклеиновых кислот. Печень человека - единственное место размножения (репликации) ВГD.

Известно существование двух вариантов инфекции: коинфекция (одновременное заражение ВГВ и ВГD) и суперинфекция (заражение HBsAg-позитивных пациентов). Сочетание ВГВ и ВГD сопровождается развитием более тяжелых форм патологического процесса, что определяется главным образом действием ВГD.

Летальность при суперинфекции достигает 15-20%. Инфицирование дельта-вирусом может вызывать острое заболевание, заканчивающееся выздоровлением, или формировать хроническое носительство ВГD.

При гепатите D могут отсутствовать в крови маркеры гепатита В - анти НВс и НВs-антиген - и наблюдается угнетение ДНК-полимеразной активности, так как ВГD ингибирует репликацию вируса гепатита В.

Исследования на вирус гепатита В (ИФА и ПЦР)

Поверхностный антиген гепатита В в сыворотке крови в норме отсутствует.
Обнаружение поверхностного антигена (HBsAg) гепатита В в сыворотке подтверждает острое или хроническое инфицирование вирусом гепатита В.

При остром заболевании HBsAg выявляется в сыворотке крови в последние 1-2 недели инкубационного периода и первые 2-3 недели клинического периода. Циркуляция HBsAg в крови может ограничиваться несколькими днями, поэтому следует стремиться к раннему первичному обследованию больных. Метод ИФА позволяет выявить HBsAg более чем у 90% больных. Почти у 5% больных самые чувствительные методы исследования не обнаруживают HBsAg, в таких случаях этиология вирусного гепатита В подтверждается наличием анти-HBсAg JgM или ПЦР.

Концентрация HBsAg в сыворотке крови при всех формах тяжести гепатита В в разгар заболевания имеет значительный диапазон колебаний, вместе с тем имеется определенная закономерность: в остром периоде существует обратная связь между концентрацией HBsAg в сыворотке и тяжестью болезни.

Высокая концентрация HBsAg чаще наблюдается при легких и среднетяжелых формах болезни. При тяжелых и злокачественных формах концентрация HBsAg в крови чаще низкая, причем у 20% больных с тяжелой формой и у 30% со злокачественной антиген в крови может вообще не обнаруживаться. Появление на этом фоне у больных антител к HBsAg расценивается как неблагоприятный диагностический признак; он определяется при злокачественных формах гепатита В.

При остром течении гепатита В концентрация HBsAg в крови постепенно снижается вплоть до полного исчезновения этого антигена. HBsAg исчезает у большинства больных в течение 3 месяцев от начала острой инфекции.

Снижение концентрации HBsAg более чем на 50% к концу 3-й недели острого периода, как правило, свидетельствует о близком завершении инфекционного процесса. Обычно у больных с высокой концентрацией HBsAg в разгар болезни он обнаруживается в крови в течение нескольких месяцев.
У больных с низкой концентрацией HBsAg исчезает значительно раньше (иногда через несколько дней после начала заболевания). В целом срок обнаружения HBsAg колеблется от нескольких дней до 4-5 мес. Максимальный срок обнаружения HBsAg при гладком течении острого гепатита В не превышает 6 месяцев от начала заболевания.

HBsAg может быть обнаружен у практически здоровых людей, как правило, при профилактических или случайных исследованиях. В таких случаях исследуют другие маркеры вирусного гепатита В - анти HBсAg JgM, анти- HBсAg JgG, анти HBеAg и изучают функцию печени.

При отрицательных результатах необходимы повторные исследования на HBsAg.
Если повторные исследования крови в течение более 3 месяцев выявляют HBsAg, такого пациента относят к хроническим больным вирусным гепатитом В.
Наличие HBsAg - довольно распространенное явление. В мире насчитывается более 300 млн. носителей, а у нас в стране - около 10 млн. носителей.
Прекращение циркуляции HBsAg с последующей сероконверсией (образование анти-HBs) всегда свидетельствует о выздоровлении - санации организма.

Исследование крови на наличие HBsAg применяется в следующих целях:

для диагностики острого гепатита В:

инкубационный период;
острый период заболевания;
ранняя стадия реконвалесценции;

для диагностики хронического вирусного гепатита В;

персистирующем хроническом гепатите;
циррозе печени;

для скрининга и выявления больных в группах риска:

больные с частыми гемотрансфузиями;
больные с хронической почечной недостаточностью;
больные с множественным гемодиализом;
больные с иммунодефицитными состояниями, в том числе СПИДом.

Оценка результатов исследования

Результаты исследования выражаются качественно - положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие HBsAg в сыворотке крови. Положительный результат - выявление HBsAg свидетельствует об инкубационном или остром периоде острого вирусного гепатита В, а также при хроническом вирусном гепатите В.

Антитела к ядерному антигену вируса гепатита В JgG (анти- HBcAg JgG )

В норме анти-HBcAg JgG в сыворотке отсутствует.
У больных анти-HBcAg JgG появляются в острый период вирусного гепатита В и сохраняются на протяжении всей жизни. Анти-HBcAg JgG - ведущий маркер перенесенного ВГВ.

Исследование крови на наличие анти-HBcAg JgG применяются для диагностики:

Результат исследования выражается качественно - положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие анти-HBcAg JgG в сыворотке крови. Положительный результат - выявление анти-HBcAg JgG свидетельствует об острой инфекции, реконвалесценции или ранее перенесенном вирусном гепатите В.

Антиген «е» вируса гепатита В (HBeAg)

В норме HBeAg в сыворотке крови отсутствует.
HBeAg можно обнаружить в сыворотке крови большинства больных острым вирусным гепатитом В. Он обычно исчезает в крови раньше HBs-антигена. Высокий уровень HBeAg в первые недели заболевания или обнаружение его на протяжении более 8 недель дает основание заподозрить хроническую инфекцию.

Этот антиген часто обнаруживается при хроническом активном гепатите вирусной этиологии. Особый интерес к определению HBeAg связан с тем, что его обнаружение характеризует активную репликативную фазу инфекционного процесса . Установлено, что высокие концентрации HBeAg соответствуют высокой ДНК-полимеразной активности и характеризуют активную репликацию вируса.

Наличие HBeAg в крови свидетельствует о высокой ее инфекциозности, т.е. присутствии в организме обследуемого активной инфекции гепатита В, и обнаруживается только в случае присутствия в крови HBs-антигена. У больных хроническим активным гепатитом противовирусные препараты применяются только при обнаружении в крови HBeAg. HBeAg - антиген - маркер острой фазы и репликации вируса гепатита В.

Исследование крови на наличие HBe-антигена применяется для диагностики:

Результат исследования выражается качественно - положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие HBeAg в сыворотке крови. Положительный результат - выявление HBeAg свидетельствует об инкубационном или остром периоде острого вирусного гепатита В или продолжающейся репликации вируса и инфекциозности больного.

Антитела к антигену «е» вируса гепатита В (anti-HBeAg)

Анти-HBeAg в сыворотке в норме отсутствует. Появление анти-НВeAg антител указывает обычно на интенсивное выведение из организма вируса гепатита В и незначительное инфицирование больного.

Эти антитела появляются в острый период и сохраняются до 5 лет после перенесенной инфекции. При хроническом персистирующем гепатите анти-НВeAg обнаруживаются в крови больного вместе с НВsAg. Сероконверсия, т.е. переход HBeAg в анти-НВeAg, при хроническом активном гепатите, чаще прогностически благоприятна, но такая же сероконверсия при выраженной цирротической трансформации печени прогноза не улучшает.

Исследование крови на наличие анти-НВeAg применяются в следующих случаях при диагностике вирусного гепатита В:

Результат исследования выражается качественно - положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к HBeAg в сыворотке крови. Положительный результат - выявление антител к HBeAg, которые могут свидетельствовать о начальной стадии острого вирусного гепатита В, остром периоде инфекции, ранней стадии реконвалесценции, реконвалесценции, перенесенном недавно вирусном гепатите В или персистирующем вирусном гепатите В.

Критериями наличия хронического гепатита В являются:

Обнаружение вируса гепатита В методом ПЦР (качественно)

Вирус гепатита В в крови в норме отсутствует.
Качественное определение вируса гепатита В методом ПЦР в крови позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает этиологию заболевания.

Данное исследование дает полезную информацию для диагностики острого вирусного гепатита В в инкубационном и раннем периоде развития заболевания, когда основные серологические маркеры в крови у пациента могут отсутствовать. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Аналитическая чувствительность метода ПЦР составляет не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл, прошедшей выявление ДНК пробы, специфичность - 98%.

Этот метод имеет важное значение для диагностики и мониторинга течения хронического ВГВ. Примерно 5-10% случаев цирроза и других хронических заболеваний печени обусловлены хроническим носительством вируса гепатита В. Маркерами активности таких заболеваний является наличие HBeAg и ДНК вируса гепатита В в крови.

Метод ПЦР позволяет определять в крови ДНК вируса гепатита В как качественно, так и количественно. Определяемым фрагментом в обоих случаях служит уникальная последовательность ДНК гена структурного белка вируса гепатита В.

Обнаружение ДНК вируса гепатита В в биоматериале с помощью ПЦР необходимо для:

Исчезновение ДНК вируса гепатита В из крови - признак эффективности терапии

Обнаружение вируса гепатита В методом ПЦР (количественно)

Этот метод дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, об эффективности лечения и о развитии резистентности к активным препаратам.
Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови применяются тест-системы, чувствительность которых составляет 50-100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5 Х 10^3 -10^4 копий/мл. ПЦР при вирусном гепатите В безусловно необходима для суждения о вирусной репликации.

Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК вируса гепатита В могут служить сыворотка крови, лимфоциты, гепатобиоптаты.

Оценку уровня виремии осуществляют следующим образом:
менее 2.10^5 копий/мл (менее 2.10^5 МЕ/мл) - низкая виремия ;
от 2.10^5 копий/мл (2.10^5 МЕ/мл) до 2.10^6 копий/мл (8.10^5 МЕ/мл) - средняя виремия;
более 2.10^6 копий/мл - высокая виремия.

Существует зависимость между исходом острого вирусного гепатита В и концентрацией ДНК ВГВ в крови больного. При низком уровне виремии процесс хронизации инфекции близок к нулю, при средней - хронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии острый вирусный гепатит В чаще всего переходит в хронический.

Показаниями для лечения хронического ВГВ интерфероном-альфа следует считать наличие маркеров активной репликации вируса (выявление HBsAg, HBeAg и ДНК ВГВ в сыворотке крови в течение предшествующих 6 месяцев.).

Критериями оценки эффективности лечения служат исчезновение HBeAg и ДНК ВГВ в крови, что обычно сопровождается нормализацией уровня трансаминаз и долговременной ремиссией заболевания, ДНК ВГВ исчезает из крови к 5-му месяцу лечения у 60%, к 9-му месяцу - у 80% больных. Снижение уровня виремии на 85% и более к третьему дню от начала лечения по сравнению с исходным служит быстрым и достаточно точным критерием для прогнозирования эффективности терапии.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) — один из видов иммунохимического анализа. Он основан на высокоспецифической иммунологической реакции антигена (АГ) с соответствующим антителом (АТ) с образованием иммунного комплекса. При этом один из компонентов конъюгирован с ферментом. В результате реакции фермента с хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

Стадия узнавания исследуемого соединения специфическим антителом;
Стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
Стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

В реакции участвуют:

Твердая фаза;
АГ и АТ;
Конъюгат (антиген или антитело, меченые ферментом);
Ферментный маркер;
Субстрат;
Стоп-реагент (чаще всего применяют серную кислоту).

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Антигены и антитела

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант.
Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые АТ могут быть поли- или моноклональными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgG1, IgG2).
Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в образцах.

Ферментные маркеры: наибольшее применение нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза.

Субстраты

Выбор субстрата, в первую очередь, определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция «фермент-субстрат» высокоспецифична.

Для ПХ в качестве субстрата используют 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ хромоген). Происходит цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанного определяемого вещества;
Для ЩФ субстратом является 4-нитрофенилфосфат;
β-D-галактозидаза катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы.

Классификация ИФА

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1 — по типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА:

В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним;
Для неконкурентных методов характерно присутствие на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2 — по принципу определения исследуемого вещества:

Прямое определение концентрации вещества (АГ или АТ). Используют антитела к исследуемому веществу, соединенные со специфической меткой. В этом случае метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу;

Непрямое определение концентрации вещества - по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

3 — по типу результатов:

Конкурентный ИФА

На твердой фазе иммобилизованы специфические моноклональные антитела;
В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях. Проводят инкубацию и отмывку;
Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем;
Проводят учет результатов на ИФА-ридере. Концентрация определяемого вещества обратно пропорциональна оптической плотности.

Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Неконкурентный «сэндвич» - вариант ИФА

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА.

На твердой фазе иммобилизованы моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела;
В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают;
В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела —конъюгат. После инкубации проводят отмывку для удаления несвязавшихся антител;
Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем;
Проводят учет результатов на ИФА-ридере. Концентрация определяемого вещества прямо пропорциональна оптической плотности.

Качественный анализ часто используют при скрининговых исследованиях и диагностике инфекционных заболеваний. Результат исследования определяется при сравнении его оптической плотности с расчетной величиной критической оптической плотности (ОПкрит., «Cut-off»).

Формулу для расчета «Cut-off» указывают в инструкции к тест-системе. В расчете «Cut-off» могут участвовать как усредненные значения оптических плотностей положительных и отрицательных контролей, так и оптическая плотность специального контрольного образца — контроля уровня среза.
Если оптическая плотность образца выше, чем Cut-off, образец считается положительным на специфические антитела.

Для полуколичественного варианта проведения методики рассчитывают отношение между средней оптической плотностью образца и оптической плотностью Cut-off.

Образцы рассматриваются как:

положительные, если отношение более 1,1;
сомнительные, если отношение 0,9-1,1;
отрицательные, если отношение менее 0,9.

Сомнительные результаты анализа нельзя однозначно интерпретировать и для уточнения результата необходимо повторить обследование через 1-2 недели.

Читайте также: