Вестерн-блоттинг белков. Особенности

Обновлено: 02.05.2024

Вестерн-блот, аналитическая методика, используемая для точного определения конкретного белка в данном образце, использует способность фермента или меченного флуоресценцией первичного антитела связываться со своим специфическим антигеном. Это трехэтапный процесс, начинающийся с гель-электрофореза, с последующим мембранным блоттингом и зондированием антителами. Обнаружение белка может быть прямым или косвенным, при этом последний использует меченое вторичное антитело, направленное против первичного. Несмотря на то, что вестерн-блоттинг принят в качестве рутинного метода анализа белка, он имеет свои ограничения и преимущества

Преимущество: чувствительность

Одним из главных аргументов в пользу вестерн-блоттинга является его чувствительность. Благодаря своей способности обнаруживать всего 0,1 нанограмма белка в образце, метод теоретически может служить эффективным инструментом ранней диагностики, обнаруживая даже малейший иммуногенный ответ от вируса или бактерии в образце пациента. Непрямое вестерн-блоттинг дополнительно основывается на этой чувствительности благодаря способности вторичного антитела усиливать интенсивность сигнала, обнаруженного системой визуализации. Большая чувствительность означает, что для тестирования требуется меньше антител, что значительно сокращает лабораторные расходы.

Преимущество: Специфика

Техника вестерн-блоттинга обязана своей спецификой двум важным факторам. Во-первых, гель-электрофорез сортирует образец на белки разного размера, заряда и конформации. Этот процесс сам по себе является огромным шагом к обнаружению, поскольку сформированные в геле полосы уже дают представление о размере интересующего белка или полипептида. Специфичность взаимодействия антитело-антиген служит вторым важным фактором. Поскольку специфические антитела проявляют сродство к конкретным белкам, процесс может избирательно обнаруживать целевой белок даже в смеси 300 000 различных белков.

Недостаток: склонность к ложным или субъективным результатам

Несмотря на свою чувствительность и специфичность, вестерн-блот может все же давать ошибочные результаты. Ложноположительный результат возникает, когда антитело реагирует с не предназначенным для этого белком, что часто происходит, когда у пациента, проходящего тестирование на ВИЧ, случается туберкулез или ряд паразитарных инфекций. С другой стороны, ложноотрицательный результат может легко возникнуть, если более крупным белкам не дать достаточно времени для правильной передачи на мембрану. Неправильное блоттинг и обработка часто приводят к перекосу, выцветанию или даже к нескольким полосам, что делает результаты испытаний доступными для интерпретации специалистом.

Недостаток: высокая стоимость и технический спрос

Стоимость вестерн-блоттинга представляет собой совокупность больших индивидуальных расходов на меченые антитела, квалифицированных аналитиков и лабораторного оборудования. Деликатный процесс, вестерн-блоттинг требует точности на каждом этапе для правильной идентификации компонентов образца. Незначительная ошибка в концентрации реагента или в инкубационном периоде может иметь катастрофические последствия для всего процесса. Наконец, оборудование, необходимое для обнаружения и визуализации - хемилюминесцентные, флуоресцентные, радиоактивные или лазерные системы обнаружения - может быть слишком дорогим для среднего подразделения микробиологии.

Вестерн-блоттинг белков. Особенности

Блоттинг и ее техника

Блоттинг — это способ, позволяющий идентифицировать ДНК, РНК или белок но размеру молекулы. Для анализа ДНК применяют Southern блот; РНК идентифицируют с помощью Northern блота; белки разделяют посредством Western блота. Принципы блоттинга довольно просты. Смесь молекул подвергают электрофорезу в геле, с помощью которого анализируемые компоненты разделяются согласно своему размеру и/или электрическому заряду. Обычно используют агарозный гель, на одном конце которого расположены лунки, куда и вносят исследуемую смесь.

Гель помещают в буфер и пропускают электрический ток. Молекулы движутся по электрическому полю. Поскольку ДНК и РНК являются кислотами и несут отрицательный заряд, они мигрируют к положительному электроду. Агарозный матрикс препятствует миграции крупных молекул, поэтому разделение происходит по размеру молекул. По завершении электрофореза гель удаляют из буфера и на него сверху помещают нейлоновый фильтр (мембрану) и сухой абсорбирующий материал.

Буфер из геля впитывается в абсорбирующий материал, перенося за собой разделившиеся молекулы, которые остаются на нейлоновой мембране. Эту мембрану обрабатывают, чтобы зафиксировать молекулы на ее поверхности; при этом получается зеркальное отражение исходного геля. Затем мембрану промывают в растворе со специальны ми молекулами (зондами), которые распознают (гибридизируются) С искомой молекулой, и отмывают для удаления несвязавшегося зонда. При Southern блоттинге и Northern блоттинге в качестве зонда используют небольшой фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, комплементарную исследуемой молекуле.
Нуклеиновую кислоту помечают радиоактивной меткой, определяемой при экспозиции на рентгеновскую пленку или с помощью других методов.

По положению гибридизированного зонда, который проявляется в виде полосы, можно оценить размер фрагмента ДНК или РНК. При одновременном нанесении на соседние дорожки молекулярных маркеров известного размера можно определить точный размер исследуемого фрагмента ДНК или РНК. Для идентификации белка (Western блот) зонд представляет собой антитело, которое распознает искомый белок. При нанесении на гель метчиков с известными размерами можно установить размеры исследуемого белка.

Блоттинг используют и для других целей, включая картирование сайтов рестрикции определенного гена после его обработки рестрикциоппыми ферментами, а также для патогенетического анализа с целью сравнения сайтов геномной ДНК исследуемого и референсного образца.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — процесс амплификации, который осуществляют в пробирке. Фрагмент ДНК или РНК, подлежащий амплификации, помещают в пробирку и добавляют два коротких олигонуклеотидных праймера (химически синтезированные одноцепочечные фрагменты ДНК). Праймеры инициируют процесс амплификации, продолжающийся в виде серии циклов, в которых исходная ДНК, называемая матрицей, разделяется на отдельные цепи. При разделении молекулы ДНК на две цепи происходит связывание, или отжиг, праймеров с соответствующими фрагментами, несущими комплементарные последовательности на другом конце одноцепочечной ДНК.

Устойчивый к действию высоких температур фермент ДНК-иолимераза присоединяет нуклеотидные основания к концам каждого праймера, прочитывая последовательность одноцепочечной ДНК и образуя комплементарную ей копию.

Когда полимераза достигает конца одной цепи, формируется новая двухцепочечная ДНК, и начинается новый цикл, включающий нагревание и разделение двойной спирали (денатурация молекулы ДНК) с последующим отжигом праймеров и наращиванием повой цепи ДНК-полимеразой. Каждый цикл амплификации в ходе полимеразной цепной реакции удваивает количество ДНК-матриц. С помощью ПЦР можно получить миллионы копий того или иного фрагмента ДНК всего за несколько часов, даже если исходно была только одна молекула ДНК.

Полная амплификация выполняется в плотно закрытых пробирках или лунках специальных плашек на приборе, в котором имеется автоматизированная программа нагревания и охлаждения образна. В настоящее время ПЦР стала обычным инструментом получения достаточного количества идентичного генетического материала для исследований и анализов.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Матрицы экспрессии РНК. Практика применения

Как указано ранее, Нозерн-блоттинг позволяет изучать размер и количество небольших наборов транскриптов, выявляемых зондами, специфичными к РНК. Такие болезни, как рак или системные аутоиммунные заболевания, тем не менее могут иметь изменения в сотнях молекул мРНК или управляющих микроРНК, и в таких ситуациях Нозерн-анализ небольшого числа генов не может обеспечить достаточной информации.

В то же время микроматрицы экспрессии РНК как мощный метод анализа предоставляют такую информацию в одном эксперименте, измеряя различия в количестве большого числа, возможно, всех транскриптов в конкретном типе клеток, ткани или стадии болезни относительно другого типа клеток, ткани или стадии болезни. Можно анализировать образцы РНК, полученные от пациентов и от контрольных групп, из клеток гистологически различающихся типов опухолей или линий клеток, обработанных и не обработанных лекарственным препаратом.

РНК для проведения анализа экспрессии сначала выделяют из клеток или тестируемой ткани и из стандартных источников РНК. Каждую РНК подвергают обратной транскрипции в кДНК. Тестируемые и стандартные образцы кДНК помечают отдельно красной и зеленой флюоресцентной краской, смешивают в равных пропорциях и проводят гибридизацию с микроматрицей (биочипом), тем же методом CGH, только что описанным для образцов ДНК.

В этом случае матрица экспрессии содержит нуклеотидные последовательности, однозначно соответствующие каждой РНК. Последовательность, уникальная для конкретной РНК, должна содержать до 25 нуклеотидов и быть частичным или полным аналогом кДНК. Коэффициент интенсивности флюоресценции двух красок в каждой точке матрицы — мера соотношения в двух образцах числа копий РНК, представленной последовательностью в данной точке.

Клинические приложения матриц экспрессии для молекулярного фенотипирования и анализа функций путей метаболизма

Простейшее применение данных матриц экспрессии — рассматривать спектр изменений в тестируемом образце РНК, как если бы он был «отпечатком пальца», характерным для тестируемого источника РНК, не обращая существенного внимания на сущность или функции конкретных генов, число копий которых увеличено, уменьшено или не изменилось по сравнению со стандартным образцом. Такие образцы экспрессии генов представляют собой молекулярные фенотипы, характеризующие различные состояния болезни.

Молекулярное фенотипирование состава мРНК и микроРНК в настоящее время используют в онкологии для разграничения гистологически сходных опухолей, обеспечивая более точный прогноз их клинически важных характеристик, например тенденции к метастазированию или ответа на лечение. Применяют также более сложный анализ матриц экспрессии, когда устанавливают участие, сначала теоретически, затем экспериментально, белков, закодированных соответствующими транскриптами и изменяющихся в течение болезни, в функциях путей метаболизма.

Таким образом, исследователи могут сделать логические выводы относительно молекулярного патогенеза болезни на основе знания того, как повреждаются в процессе болезни транскрипты генов с известными или предполагаемыми функциями. Использование матриц экспрессии РНК коренным образом изменяет исследование рака и все шире используется во всех областях патологии человека.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Школа Молодых Ученых

Институт фундаментальных проблем биологии РАН. Пущино.

Основы вестерн-блоттинга

Суть метода. Вестерн-блоттинг (иммуноблотинг, от англ. Blotting — промокание) — современный высокочувствительный аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков с помощью антител.

Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген/антитело (исследуемый белок)». Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моно- или поликлональных антител. В оптимально подобранных условиях Вестерн-блоттингом можно обнаружить белок в количестве менее 1 нг.

Этапы Вестерн-блоттинга:

Разделение белков методом SDS-электрофореза. Наиболее распространенным способом разделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле, в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS). В присутствии SDS белки подлежащие анализу приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы. Денатурированные белки мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее. Так же на гель наносят маркеры (смесь белков с известными молекулярными массами). Отличия в скорости продвижения (электрофоретической подвижности) приводит к разделению белков на полосы.
Перенос белков из геля на мембрану (изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF) происходит под действием электрического тока. В результате этого процесса белки оказываются в тонком поверхностном слое мембраны, где за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий происходит их связывание с мембраной. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
Блокирование. Для того, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с мембраной, последнюю инкубируют в разбавленном растворе белка — обычно используют бычий сывороточный альбумин или обезжиренное сухое молоко. Белок из разбавленного раствора связывается с мембраной в тех местах, где нет белковых полос. В результате антитела при их добавлении могут связываться только со специфичными сайтами связывания исследуемых белков. Блокирование позволяет достичь чистого фона и исключить получение ложноположительных результатов.
Связывание исследуемого белка с антителами. После блокирования мембраны ее отмывают буфером (3 раза) и последовательно инкубируют с различными антителами методом «сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые, в свою очередь, связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).
Детекция. Визуализации исследуемого белка достигают путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяют колориметрическим, хемилюминесцентным или флюоресцентным методами детекции. Количество белка оценивают с помощью денситометрии.

Иммунный блоттинг в диагностике ВИЧ

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» - как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым.

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).

Читайте также: