Современная молекулярная диагностика в стоматологии. Ценность молекулярной диагностики

Обновлено: 14.05.2024

Целью любого лабораторного анализа является идентификация и определение концентрации искомого вещества. В современной медицине для этого широко используются методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК. К иммунологическим методам в первую очередь относят иммуноферментный анализ (ИФА). В плане обнаружения ДНК наибольшее распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Эти распространенные методы широко используются для определения антител, антигенов, ДНК.

Открытие ИФА и ПЦР стало возможно благодаря ряду открытий в области иммунологии и молекулярной биологии в 60-80-годы прошлого века.

ИФА — метод выявления антигенов или антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет:

предварительной фиксации антигена или антитела на подложке;
добавления исследуемого образца и связывание фиксированных антигена или антитела с антигеном-мишенью или антителом-мишенью;
последующего добавления антигена или антитела, меченного ферментативной меткой с ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску под действием фермента. Изменение цвета реакционной смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.Определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов проводят в сравнении с контрольными пробами.

В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях. На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ провели в 1971 году Е. Энгвал и П. Перлман для детекции IgG фракции иммуноглобулинов, К. Ван Веемен и А. Шурс для обнаружения эстрогенов.

Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются устойчивость к растворам, используемым в реакции, и высокая специфическая емкость (т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов). Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей, присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики.

Для ферментативной метки коньюгата могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, бета-галактозидаза, глюкозооксидаза и др. В качестве субстратного реагента также применяются разнообразные хромогенные вещества, продукты окисления которых как раз и регистрируются фотометрически при определенных длинах волн (волновой диапазон 340-750 нм).

Широкое использование стандартной конфигурации 96-луночного планшета позволило унифицировать оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа.

В 1972 г. К. Рубенштейн с сотр. разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. В дальнейшем термин «гомогенный иммуноанализ» стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе.

Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс-определения биологически активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии.

Основной принцип ИФА - специфическое связывание антитела с мишенью. Для получения антител первоначально использовали иммунизацию животных (обычно кролика) очищенным белком. Однако в этом случае получали смесь антител к разным антигенным детерминантам молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлонильным препаратом. Использование поликлональных антител имело два существенных недостатка: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различать сходные мишени, т.е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой.

Этим объясняются многочисленные «перекрестные» положительные реакции, которые приводят к ошибочным диагнозам.

Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выделенную сыворотку. Это стоит немалых денег.

Благодаря разработке метода получения моноклональных антител (МАТ) с помощью техники гибридом стало возможно получение препаратов антител к одной антигенной детерминанте.

С.Мильштейн и Г.Келер за разработку техники получения гибридом, вырабатывающих МАТ с запрограммированной специфичностью, получили в 1984 году Нобелевскую премию в области медицины и физиологии. Они рассчитывали использовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат привел к подлинному буму. В основу метода положен давно известный принцип гибридизации (слияния) соматических, неполовых, клеток с последующим выделением и культивированием необходимого гибридного клона. Для слияния используют клетки двух видов. Первые — плазмоцитомы (опухолевые плазмоциты) из линий, культивируемых в искусственных условиях, invitro. Как и все злокачественные клетки они интенсивно размножаются без всякого внешнего стимула. Другие клетки —иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезировать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти клетки существуют лишь несколько дней.

Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует признаки обоих «родителей».

К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, несколько тысяч гибридом, в т.ч. на 600 вирусных антигенов.

Преимущества МАТ:

Главная особенность МАТ — чрезвычайная моноспецифичность (против одной антигенной детерминанты) и абсолютная однородность.
Возможность многократного получения в течение длительного времени (воспроизводимость).
Неограниченное количество получаемых антител.

По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы. Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты.

Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА.

Еще одним из важнейших современных методов диагностики заболеваний внутренних органов является ДНК-диагностика методом полимеразной цепной реакции.

ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его. ПЦР - это "in vitro" аналог биохимической реакции синтеза ДНК в клетке.

ПЦР — это циклический процесс, в каждом цикле которого происходит тепловая денатурация двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение коротких олигонуклеотидов-праймеров и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы путем присоединения нуклеотидов. В результате накапливается большое количество копии исходной ДНК-мишени, которые легко подаются детекции.

Открытию полимеразной цепной реакции сопутствовало развитие молекулярно-биологических технологий.

Первые данные о химических своиствах ДНК появились в 1868 г. К началу 50-годов ХХ в. было установлено, что ДНК - это линейный полимер, состоящий из нуклеотидов, состоящие из азотистого основания, пентозы и фосфатной группы. Основания бывают двух типов: пуриновые - аденин и гуанин и пиримидиновые - цитозин и тимин.

В 1953 г. Д. Уотсон и Ф. Крик пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух комплиментарных полимерных цепей, образующих двойную спираль. Согласно модели Уотсона навитые одна на другую цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин - с цитозином. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой (растущей цепи) задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. В 1955 г. А. Корнберг открыл в клетках фермент, который назвал ДНК-полимеразой. ДНК-полимеразы обеспечивают репарацию и репликацию ДНК.

Эти ферменты способны удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3'-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был гибридизован, т. е. связан с комплементарной цепью ДНК, которая называется матрицей. Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (они используются в качестве строительных блоков).

Нуклеотид, который присоединяет ДНК-полимераза, комплементарен основанию в соответствующем положении матричной цепи. Многократно повторяя эту реакцию, полимераза способна удлинять 3'-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5 ' -конца матрицы. В ходе репарации и репликации двойной спирали ДНК каждая цепь служит матрицей для синтеза другой цепи.

В 1962 г. американские ученные Дж.Уотсон, Ф.Крик и М.Уилкинс получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за установление молекулярной структуры нуклеиновых кислот и ее роли в передаче информации в живой материи.

В 1971 г. Клеппе и соавт. представили данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако возможность использования ПЦР в плане наработки огромного количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Возможно, это было связано с техническими трудностями связанными с необходимостью трудоемкого синтеза праймеров.

В 70-х годах были открыты специальные ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, которые расщепляют ДНК в специфических точках. Исследователи получили возможность "разрезать" ДНК на более короткие и более стабильные фрагменты, которые просто идентифицировать. При этом стало проще выделять и изучать фрагменты ДНК с находящимися в них генами.

В начале 80-х годов проблема с синтезом праймеров была разрешена благодаря разработке автоматических синтезаторов ДНК.

В 1966 г. был открыт новый вид термофильной бактерии Thermusaquaticus (Taq), содержащий термостабильную Taq-ДНК-полимеразу. К. Мюллис в 1983-1984 гг. провел ряд экспериментов по разработке ПЦР и первый начал использовать Taq-ДНК-полимеразу вместо ранее использовавшейся неустойчивой к высоким температуры ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис совместно с Ф. Фалуном разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет. За разработку ПЦР-анализа К.Мюллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.

Результатом открытия ПЦР стало немедленное практическое использование метода. В 1985 г. была опубликована статья, в которой была описана тест-система для диагностики серповидно-клеточной анемии на основе ПЦР. Начиная с 1986 г. К настоящему времени ПЦР посвящено более 10000 научных публикаций. Перспективы использования ПЦР представляются более чем впечатляющими.

В заключение хотелось бы сказать, что создатели любого диагностического метода должны стремиться к тому, чтобы он был: высокоспецифичным; высокочувствительным; достаточно простым и позволяющим получать однозначные результаты; иметь приемлемую стоимость исследования. ИФА и ПЦР сочетают эти качества в высокой степени.

Современная молекулярная диагностика в стоматологии. Ценность молекулярной диагностики

Научно-исследовательский медико-стоматологический институт, ФБГУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, Москва

Медицинский центр Училища Олимпийского Резерва №2, Москва

ГКУ «Центр спортивных инновационных технологий и подготовки сборных команд» Москомспорта, Москва

Методы молекулярной диагностики при выявлении особенностей патологии полости рта у спортсменов

Журнал: Российская стоматология. 2014;7(2): 47‑49

Пономарева А.Г., Костюк З.М., Кривощапов М.В., Царёва Т.В. Методы молекулярной диагностики при выявлении особенностей патологии полости рта у спортсменов. Российская стоматология. 2014;7(2):47‑49.
Ponomareva AG, Kostyuk ZM, Krivosheev MV, Tsareva TV. The methods of molecular diagnostics for the elucidation of specific features of oral cavity pathology in the athletes. Russian Stomatology. 2014;7(2):47‑49. (In Russ.).

Цель работы: определение частоты встречаемости кариеса зубов и пародонтита у спортсменов, занимающихся разными видами спорта с использованием молекулярной ПЦР-диагностики. Материал и методы. Выявляли частоту встречаемости и массивность повреждения тканей полости рта у 98 спортсменов различных видов спорта методами молекулярной диагностики наряду с определением традиционных индексов гигиены, интенсивности кариеса зубов и выраженности воспаления и степени кровоточивости. Результаты и их обсуждение. Установлено, что ПЦР-диагностика позволяет выявить развитие патологий полости рта на ранней стадии и в большей части случаев, что позволяет своевременно проводить санацию, реабилитацию и лечение спортсменов для сохранения их спортивной формы и достижения спортивных результатов.

Заболеваемость пародонтитом повышается с возрастом: в группе 6 лет он встречается в 22,34% случаев, в группе 12 лет уже в 37, 85%, в группе 15 лет в 57,69% [2]. Существенное увеличение частоты выявления пародонтопатогенов отмечено в группе курильщиков табака [7]. Спортсмены в старшем подростковом возрасте особенно уязвимы, так как в большей степени испытывают на себе негативное воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды при высоких физических нагрузках на фоне резкого изменения гормонального фона, которое влияет на развитие пародонтопатогенов [5].

Профессиональная спортивная подготовка и спорт высоких достижений истощают организм, приводят к снижению иммунитета и развитию различного рода патологий [3]. Спортивные нагрузки как мощный физический, так и стрессогенный фактор оказывают влияние на иммунную систему организма и уровень метаболизма [4].

Это может являться дополнительным патогенетическим механизмом развития стоматологических заболеваний, так, известно, что у спортсменов чаще выявляют кариес зубов и пародонтит. Вместе с тем патогенетические факторы, ведущие к развитию пародонтита, и их взаимосвязь с занятиями спортом остаются малоизученными. По данным отечественной литературы, заболевания пародонта среди разных возрастных групп выявляются с частотой от 80 до 94% взрослого населения [8].

Как показывают исследования последних лет, все большее значение в литературе уделяется генетической предрасположенности, в частности полиморфизму генов, кодирующих синтез интерлейкинов [5, 6].

Определенные пародонтопатогены вызывают различные реакции по синтезу интерлейкинов, которые обусловливают различную выраженность воспаления тканей [9].

Цель работы — определение частоты кариеса зубов и пародонтита спортсменов, занимающихся разными видами спорта с использованием молекулярной ПЦР-диагностики.

Материал и методы

В исследовании участвовали 98 спортсменов в возрасте от 15 до 20 лет (студенты училища Олимпийского резерва), в том числе:

— 10 спортсменов по гандболу (летний вид спорта),

— 11 спортсменов по другим летним видам спорта (велосипедисты, легкая атлетика),

— 47 спортсменов по гребле (водные виды спорта),

— 30 спортсменов зимних наземных видов спорта (лыжные гонки, конькобежный спорт).

У студентов-спортсменов для оценки стоматологического статуса определяли интенсивность кариеса зубов (индексы КПУз, КПУп), гигиеническое состояние полости рта (индекс гигиены), состояние тканей пародонта — выраженность воспаления и степень кровоточивости десны (индексы PMA и SBI), пародонтальный индекс (ПИ) по Russel. Молекулярные методы диагностики включали проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР-диагностика) с использованием отечественной диагностической системы МультиДент-5 в соответствии с существующими рекомендациями (ФС-2006/043-У от 10 апреля 2006 г.) [1]. Результаты исследования обработаны методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы Biostat MS.

Результаты и обсуждение

Проведение ПЦР-диагностики пародонтальной инфекции у спортсменов, занимающихся гандболом, позволило выявить пародонтопатогены 1-го порядка (A. actinomycetemcommitans, P. gingivalis, T. forsythia) у всех пациентов с диагнозами гингивит и пародонтит легкой/средней степени, т. е. у 70% обследованных. Кроме того, у 4 больных спортсменов и у 3 здоровых выявлены пародонтопатогены 2-го порядка — P. intermedia, T. denticola, что составило 40 и 30% соответственно.

В этой группе у всех 10 обследованных спортсменов выявлен множественный кариес с очень высокой интенсивностью (КПУз/КПУп до 16/20) и выраженный гингивит (у 3) или пародонтит легкой и средней степени (у 4) — индекс PMA и ПИ соответствовали легкой или средней степени заболевания пародонта. Индекс кровоточивости SBI в пределах средних значений (1,5±0,21).

Т.е. наиболее выраженные повреждения тканей зубов и слизистых выявлены у спортсменов, занимающихся гандболом. Гандбол — вид спорта, сочетающий в себе выносливость, координацию движений в условиях низкого содержания кислорода, в плохо проветриваемых помещениях, возможно загрязненных грибами и токсическим воздействием лакокрасочного покрытия полов и стен. Кроме того при отсутствии кондиционеров у спортсменов возникают нарушения терморегуляции, перегрев организма и тепловые удары (в летнее время года), что способствует нарушениям функции слизистой полости рта и развитию стоматологических заболеваний.

Спортсмены других наземных летних видов спорта — в нашем исследовании это велосипедисты и спортсмены, занимающиеся легкой атлетикой, реже страдали кариесом зубов (45,5%). КПУ был довольно низким — 4/4. Частота выявления пародонтита составляла 18,2%, гингивита — 27,3%.

Спортсмены, занимающиеся легкой атлетикой в более комфортных условиях по сравнению с гандболистами, имеют меньшую тенденцию к развитию как простудных заболеваний, так и стоматологических. Меньше всего оказались повреждены ткани полости рта у велосипедистов, которые хотя и имеют вредные токсические воздействия трекового или асфальтового покрытия, но значительную часть тренировок и соревнований осуществляют в условиях естественной инсоляции, больше контактируют с кислородом, оказывающим бактерицидное и благоприятное метаболическое воздействие.

ПЦР-диагностика пародонтальной инфекции в этой группе спортсменов позволила выявить пародонтопатогены 1-го и 2-го порядка у 54,5%, что достоверно ниже, чем у спортсменов, занимающихся гандболом (р<0,05), однако свидетельствовало о достаточно высоком уровне инфицированности даже при отсутствии клинических признаков заболевания.

Спортсмены-гребцы также реже страдали кариесом зубов — в 55,3% случаев (26 из 47) и индекс КПУ у них был существенно ниже — до 6/10. Пародонтит клинически диагностировали у 30% спортсменов (14 человек). Показатели П.И. соответствовали пародонтиту легкой степени. Индекс кровоточивости SBI составлял 2,0±0,3.

ПЦР-диагностика пародонтальной инфекции 1-го порядка подтвердила диагноз пародонтита у 13 из 14 спортсменов с клиническим диагнозом и еще у 3 с отсутствием такового, т. е. всего у 16 (34,1%) из 47 человек. Пародонтопатогены 2-го порядка выявлены у 7 спортсменов с клиническим диагнозом и у 6 — без такового, т. е. у 13 (27,7%). Таким образом, частота выявления пародонтопатогенов была несколько ниже по сравнению с гандболистами.

У спортсменов зимних видов спорта частота выявления кариеса зубов составляла 75% случаев с высокими показателями КПУз/КПУп (до 8/12). При этом более чем у половины спортсменов — у 16 (53,3%) — выявляли пародонтит легкой и средней степени тяжести с высокой кровоточивостью десен. Показатели индекса PMA и ПИ соответствовали преимущественно средней степени тяжести пародонтита. Индекс кровоточивости SBI (2,2±0,21) был достоверно выше, чем в предыдущих группах, но не отличался от такового в группе гандболистов.

Проведение ПЦР-диагностики пародонтальной инфекции у спортсменов, занимающихся зимними видами спорта, позволило выявить пародонтопатогены 1-го порядка (A. actinomycetemcommitans, P. gingivalis, T. forsythia) у всех пациентов с диагнозами гингивит и пародонтит легкой/средней степени, т. е. у 53,3% обследованных. Кроме того, у 6 (20%) здоровых также выявлены пародонтопатогены 1-го порядка. Суммарная частота выявления пародонтопатогенов 1-го порядка составила в этой группе 73,3%, т. е. не отличалась от группы гандболистов. Но была достоверно ниже, чем в других обследованных группах (р<0,05). Кроме того, у 14 (46,7%) больных спортсменов и у 9 (30%) клинически здоровых спортсменов выявлены пародонтопатогены 2-го порядка — P. intermedia, T. denticola.

Спортсмены зимних видов спорта (лыжные гонки и конькобежный спорт) часто болеют респираторными заболеваниями, поскольку в полость рта попадает холодный, сухой воздух. Из-за резкого перепада температур возникают микротрещины зубной эмали, что влечет за собой развитие кариеса зубов и размножение патогенной микрофлоры, в частности стрептококков и пародонтопатогенов. У этого контингента лиц часто возникают тонзиллиты стрептококковой этиологии и воспалительные процессы в пародонте (обострения хронического пародонтита и хронического апикального периодонтита).

Полученные данные мы рассматриваем как результаты пилотного исследования. Для более обоснованного ответа на вопрос о достоверности различий частоты пародонтальной инфекции у спортсменов, занимающихся различными видами спорта, на наш взгляд, необходима более значительная выборка, корректная тщательная дифференциальная диагностика гингивита и пародонтита легкой степени тяжести в процессе проведения дальнейших исследований. Вместе с тем персистенция бактерий пародонтопатогенных видов, выявленная нами у спортсменов, представляет серьезную опасность в аспекте роста числа антибиотикорезистентных штаммов этих микроорганизмов [10].

Таким образом, на примере локальных повреждений в полости рта у спортсменов, с учетом возможного негативного воздействия ряда факторов окружающей среды на ткани зубов и пародонта можно наметить направления совершенствования диагностики пародонтальной инфекции с применением современных молекулярных методов исследования. Рост чужеродной антигенной нагрузки в условиях резкого снижения иммунологического потенциала при физических нагрузках создает условия для развития общесоматической и стоматологической патологии у спортсменов, что весьма неблагоприятно как для получения ими высоких результатов на Олимпийских играх, так и для качества жизни их собственной. Своевременная ПЦР-диагностика позволяет достичь раннего выявления развития патогенных возбудителей в поврежденных тканях и начать своевременное лечение и реабилитацию.

Воронежский государственный университет

Воронежский государственный университет, Воронеж, Россия

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко Минздрава России, 394036, Воронеж, Россия

Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Минздрава РФ, Москва

Спектроскопические исследования изменений в молекулярном составе ротовой жидкости у людей с множественным кариесом зубов

Цель исследования — с использованием спектроскопических методов анализа изучены изменения, происходящие в молекулярном составе смешанной слюны (ротовой жидкости) у людей с множественным кариесом. Материал и методы. Методом инфракрасной спектроскопии, в том числе с использованием синхротронного излучения, определены особенности ротовой жидкости в инфракрасных спектрах, а также рассчитаны минерал-органическое, углерод-фосфатное, Амид II/Амид I и протеин/тиоцианатное соотношения для группы больных с множественным кариесом и пациентов контрольной группы. Результаты. Комплексный анализ полученных экспериментальных данных позволил установить, что в ротовой жидкости у лиц, страдающих множественным кариесом, по сравнению с контрольной группой уменьшается содержание минеральных групп и комплексов, увеличивается доля органической составляющей, более чем в 2 раза увеличивается содержание тиоционатов, а также появляются карбоновые группы сложных эфиров, липидов и углеводов. Заключение. Обнаруженные особенности в инфракрасных спектрах смешанной слюны, а также найденные изменения в ее молекулярном составе на основе рассчитанных соотношений между органической и минеральной составляющими могут выступить в роли биомаркеров кариесогенной ситуации и использоваться в качестве диагностического критерия при анализе образцов ротовой жидкости пациентов.

Как известно, слюна представляет собой одну из наиболее информативных жидкостей человеческого организма для диагностики различных заболеваний [1, 2]. По сравнению с двумя другими жидкостями человеческого организма, а именно мочой и кровью, при проведении клинической диагностики слюна имеет ряд неоспоримых преимуществ: забор слюны прост и неинвазивен, а пробоподготовка содержит меньшее число операций [3]. При этом следует отметить, что большинство биомаркеров, которые содержатся в крови и моче, могут быть обнаружены в образцах слюны [4, 5]. Поэтому слюна обладает высоким диагностическим потенциалом для исследований патологий организма человека [6—10].

В настоящее время большое внимание уделяется использованию слюны в диагностике системных заболеваний органов полости рта: десен, зубов, слюнных желез [4, 6, 8, 11]. Ассоциированные с кариесогенной ситуацией изменения в молекулярном составе слюны могут выступить в роли эффективных биомаркеров развития кариеса зубов [4, 11, 12]. Оптимальным методом, зарекомендовавшим себя в области различных задач по исследованию изменений в молекулярном составе как слюны, так и биологических жидкостей человеческого организма, является инфракрасная (ИК) спектроскопия (Fourier-transform infrared spectroscopy — FTIR) [6, 13]. ИК-спектроскопия успешно используется для выявления биомаркеров патологий в слюне [6], а с развитием спектроскопических экспресс-методик анализа слюны человека скрининг заболеваний на молекулярном уровне стал возможным на еще более ранней стадии [13].

Цель исследования — изучение изменений в молекулярном составе слюны у людей с множественным кариесом с использованием спектроскопических методов анализа, а также поиск потенциальных биомаркеров кариозного процесса.

В исследовании приняли участие 20 человек (10 мужчин и 10 женщин) в возрасте 22—28 лет, предоставивших для исследований свою ротовую жидкость. Все участники исследования не принимали лекарственные препараты, не курили и не употребляли алкоголь.

В 1-ю группу эксперимента включили физически здоровых, без вредных привычек (не курящие сигареты), без кариеса зубов и заболеваний десен 5 мужчин и 5 женщин. Во 2-ю группу вошли условно здоровые (не курящие сигареты) 5 мужчин и 5 женщин. Участники этой группы в своей повседневной жизни не соблюдали режим питания, употребляя между основными приемами пищи легкоусвояемые углеводы. На момент обследования у каждого участника этой группы имелись зубы с очагами первичного и вторичного кариозного процесса в стадии, соответствующей III степени по шкале ICDAS.

Образцы нестимулированной смешанной слюны брали спустя 5 мин после предварительного ополаскивания ротовой полости с использованием чистой воды в стерильные 15 мл пробирки в период с 10 до 12 ч дня для минимизации влияния циркадного ритма в лабораторных условиях по стандартной методике [13]. Схема исследования изображена на рис. 1. Рис. 1. Инфракрасные спектры образцов ротовой жидкости, усредненные по группам участников исследования: с множественным кариесом (кривая 1) и группы здоровых пациентов (кривая 2). Остальные объяснения в тексте. После этого образцы ротовой жидкости охлаждали до температуры 4 °C, центрифугировали при той же температуре и затем сушили в духовом шкафу при температуре 36 °C с целью удаления излишков влаги.

Исследования молекулярного состава образцов смешанной слюны человека, а также изменений в нем в зависимости от группы участников были выполнены с использованием методики ИК-спектроскопии [13]. Анализ образцов смешанной слюны был выполнен на приборе Vertex-70 («Bruker», Германия) по методике, описанной нами ранее [13].

Кроме того, для исследования было привлечено оборудование канала инфракрасной микроспектроскопии австралийского синхротрона. Использовались ИК-микроскоп Hyperion 3000 IR (фирмы «Bruker», Германия) и алмазная ячейка высокого давления для анализа микропроб образцов.

Предварительный анализ данных, полученных методом FTIR, показал, что спектры всех образцов внутри конкретной экспериментальной группы содержат абсолютно один и тот же набор колебательных мод, что совпадает с данными известных работ по исследованию биологических жидкостей [6, 13].

На рис. 1, б представлены усредненные ИК-спектры образцов смешанной слюны, полученных как от людей с множественным кариесом (кривая 1), так и от здоровых лиц (кривая 2). Список активных колебаний в спектрах, полученных в 1-й и 2-й группах, частоты этих колебательных мод, а также их принадлежность к конкретной молекулярной группе приведены в таблице. Активные колебания в инфракрасных спектрах в соответствии с международными стандартами Анализ полученных данных был проведен на основе ряда источников литературы [6, 13, 14].

Из полученных нами экспериментальных данных (см. рис. 1; см. таблицу) следует, что основные интенсивные колебательные полосы в ИК-спектрах пропускания слюны и содержащиеся во всех спектрах принадлежат следующим группам и комплексам.

Первая и наиболее интенсивная группа колебаний, расположенная в области 1078—900 см -1 , принадлежит молекулярным связям, относимым к производным фосфора, таким как фосфаты, глицерофосфаты и фосфолипиды [13]. Следующая большая группа колебательных полос, локализованных в области 1725—1190 см -1 , принадлежит протеинам. Среди этой группы могут быть выделены полосы вторичных амидов: Амид I, Амид II и Амид III, а также колебания групп CH₂/CH₃.

Наряду с описанными выше модами колебаний в спектрах обнаруживаются полосы, интенсивность которых зависит от наличия заболевания кариесом зубов. Наиболее интенсивным колебанием в этой группе полос является мода в области 2150—1950 см -1 . Эту моду в ИК-спектре можно отнести к связи -N=C=S анионов тиоцианатов, содержащихся в смешанной слюне. Визуальный анализ интенсивности этого колебания показывает, что в спектре образцов ротовой жидкости, полученных от пациентов с множественным кариесом, это колебание значительно выше, чем у участников из 1-й группы. Хорошо известно [16], что тиоцианаты служат локальными антибактериальными агентами для анаэробных микроорганизмов. Следует отметить, что наличие тиоцианатов в слюне может также свидетельствовать о состоянии местного иммунного статуса ротовой полости.

Особое внимание привлекают три области: 1765—1725, 1185—1140 и 870—700 см -1 , в которых колебания в ИК-спектрах наблюдаются лишь в образцах, полученных в группе участников эксперимента с множественным кариесом. Первые две области в увеличенном масштабе представлены на рис. 1, в, г. Анализ литературы показывает, что колебательная полоса в области 1185—1140 см -1 (см. рис. 1, г) относится к присутствующим в ротовой жидкости карбогидратам. Они входят в состав муцинов слюны, которые покрывают и смазывают поверхность слизистой оболочки, предотвращают прилипание анаэробных бактерий и их колонизацию, защищают ткани от физического повреждения. Мода ИК-полос в области 1765—1725 см -1 (см. рис. 1, в) в соответствии с данными работ [6] представляет собой колебание >C=O и соотносится с карбоновой группой сложного эфира. Отметим, что наличие эфиров в твердой ткани зуба человека при кариесе зубов было показано в ряде работ [6, 7]. При этом авторы этих работ указывали, что в кариозной ткани эфиры встречаются чаще, чем в интактной.

В третьей особой области, как отмечалось ранее, в диапазоне 870—700 см -1 имеется ряд малоинтенсивных мод колебаний. Из анализа литературы известно, что данные колебательные моды принадлежат связям С—Н, P—O фосфодиэфиров, сложных эфиров, других липидов и углеводов слюны. Причиной возрастания интенсивности этой группы колебаний в спектре 2-й группы участников эксперимента является увеличение концентрации липидов и относящихся к ним сложных эфиров слюны вследствие развития кариеса зубов, как это показано в работе [17].

Чтобы дать количественные оценки с использованием данных ИК-спектроскопии и установить разницу в молекулярном составе ротовой жидкости между группой здоровых пациентов и группой пациентов с множественным кариесом мы использовали подход, апробированный в ряде наших предыдущих работ [13, 18]. В них показано, что математическая оценка изменений в молекулярном составе слюны может быть дана на основе расчета и анализа четырех различных соотношений (коэффициентов).

Для расчета первого из них — R1 (минерал-органическое соотношение) достаточно взять отношение интегральной интенсивности фосфатных полос в ИК-спектре, к интегральной интенсивности полосы колебаний, соотносимой с Амид I. Второй коэффициент — R2 (углерод-фосфатное отношение) может быть рассчитан из отношения интегральной интенсивности полосы колебаний связей C=O и CH₂/CH₃ к интегральной интенсивности фосфатных полос в ИК-спектре.

Третий коэффициент — R3 (Амид II/Амид I) рассчитан из отношения интегральной интенсивности полосы Амид II к интегральной интенсивности полосы Амид I.

Четвертый коэффициент — R4 (протеин/тиоцианатное соотношение) может быть рассчитан из отношения интегральной интенсивности амидных полос (Амид I и Амид II) к интегральной интенсивности полосы колебаний -N=C=S, соотносимой с тиоцианатом.

Результаты расчетов соотношений R1—R4 для двух групп участников исследования приведены на рис. 2, а Рис. 2. Соотношения и относительные изменения R1 и R4 для двух групп участников исследования. a — минерал-органическое соотношение (R1); б — углерод-фосфатное отношение (R2); в — отношение Амид II/Амид I (R3); г — протеин/тиоцианатное соотношение (R4). также относительные изменения для четырех соотношений. Напомним, что соотношения R1—R4 рассчитаны на основе спектров, усредненных по группе участвовавших в исследовании пациентов.

Комплексная оценка полученных экспериментальных результатов ИК-спектроскопии и расчетных данных, приведенных на рис. 1 и 2, позволяет сделать следующие важные выводы.

Хорошо видно, что в случае наличия множественного кариеса у пациентов наблюдается уменьшение минерал-органического соотношения — коэффициент R1 (см. рис. 2, a), что свидетельствует о сокращении в составе слюны доли минеральных групп и комплексов и/или возрастании части органической компоненты при наличии в смешанной слюне кариесогенных бактерий [11, 12]. При этом следует отметить значительное (по результатам расчета) увеличение коэффициента R3 (отношение интегральных площадей Амид II/Амид I) для группы лиц с множественным кариесом около 120% (см. рис. 2, в). Это означает, что изменения в составе органической компоненты ротовой жидкости, полученной у волонтеров 2-й группы, обусловлены увеличением количества молекулярных групп CN и NH по отношению к доле связей C=O (см. рис. 1; см. таблицу). Согласно данным литературы, эти молекулярные группы относятся к белковой составляющей, изменение доли которой может происходить вследствие появления патологической микрофлоры ротовой полости как в нестимулированной, так и в стимулированной слюне [11, 12].

Относительное изменение углерод-фосфатного соотношения R2 (см. рис. 2, б) также указывает на различия в молекулярном составе образцов смешанной слюны, полученных от пациентов 1-й группы и участников из группы с множественным кариесом. Показано, что коэффициент R2 для группы волонтеров с множественным кариесом почти на 16% больше, чем для 1-й группы участников (см. рис. 2, б). Увеличение коэффициента R2 обусловлено снижением доли фосфатных комплексов в молекулярном составе ротовой жидкости и увеличением доли связей, относимых к C=O и CH₂/CH₃.

Кроме того, показательные изменения в составе ротовой жидкости происходят в отношении числа групп -N=C=S, соотносимых с наличием в слюне тиоцианатов (см. рис. 1, г). В соответствии с данными литературы уровень тиоцианатов в слюне, оказывающий антибактериальное действие на продукты жизнедеятельности бактерий, при патологических процессах может повышаться. Коэффициент R4, который является протеин/тиоцианатным соотношением, демонстрирует практически двукратное уменьшение. При этом, если относительные изменения соотношений R1 и R3 указывают на заметное увеличение доли органики (в том числе протеинов) в составе смешанной слюны, то уменьшение соотношения R4 почти в 2 раза обусловлено весьма значительным увеличением доли тиоцианатов в слюне у лиц с множественным кариесом.

Что же касается выводов о качественных изменениях в составе ротовой жидкости при множественном кариесе, то исходя из экспериментальных данных FTIR (см. рис. 1) весьма важными и показательными являются различия в ИК-спектрах в области 1765—1725 см -1 (см. рис. 1; см. таблицу), в которой расположены колебательные полосы, относящиеся к карбогидратам и карбоновой группе сложного эфира. Как хорошо видно из полученных экспериментальных данных, эти две низкоинтенсивные полосы определяются лишь в спектрах образцов ротовой жидкости 2-й группы участников эксперимента, страдающих множественным кариесом. Сделанные нами заключения совпадают с результатами других работ [17, 19].

Все описанные особенности в ИК-спектрах ротовой жидкости хорошо согласуются с известными результатами ряда работ по исследованию развития патологических процессов в ротовой полости, в том числе кариозного процесса [4, 11, 12, 17].

Подводя итоги, следует отметить один немаловажный факт. Как показано в предыдущих исследованиях, ни один из антимикробных агентов (в том числе тиоцианат), как и интегральные маркеры слюны, не обладают прогностической значимостью, достаточной для диагностирования in vivo появления в будущем кариеса, и слабо ассоциированы с динамикой развития кариеса зубов [16]. Поэтому, по нашему мнению, повысить точность детекции развития кариозного процесса можно лишь на основе комплексного анализа количественных и качественных данных об изменениях в молекулярном составе ротовой жидкости.

Заключение

Методом FTIR, в том числе с использованием синхротронного излучения, определены особенности в ИК-спектрах, а также рассчитаны минерал-органическое, углерод-фосфатное, Амид II/Амид I и протеин/тиоцианатное соотношения для группы лиц, больных с множественным кариесом, и пациентов контрольной группы.

На основе комплексного анализа экспериментальных данных удалось показать, что органоминеральный баланс ротовой жидкости у лиц, страдающих множественным кариесом, сдвигается в сторону сокращения содержания в ней минеральных групп и комплексов и увеличения органической составляющей. Интегральным показателем этих изменений молекулярного состава служит отношение Амид II/Амид I. В группе с множественным кариесом это соотношение возрастает почти на 120% по сравнению с таковым в группе здоровых пациентов.

В случае множественного кариеса зубов в образцах смешанной слюны более чем в 2 раза увеличивается содержание тиоцианатов. Кроме того, в смешанной слюне появляются карбоновые группы сложных эфиров, липидов и углеводов, наличие которых характерно при развитии кариеса.

Полученные нами комплексные результаты и отработанная методика могут использоваться соответственно в качестве биомаркеров и диагностического подхода при анализе образцов смешанной слюны пациентов для оценки кариесогенной ситуации.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−00003).

Часть данного исследования выполнена на канале инфракрасной микроспектроскопии австралийского синхротрона.

Современная молекулярная диагностика в стоматологии

Некоторые заболевания полости рта лечатся назначением антибактериальных препаратов. Но бактериальная флора в полости рта может быть устойчивой к некоторым группам антибактериальных препаратов. Современные методы молекулярной диагностики в стоматологии открывают новые возможности в изучении этиологии и патогенеза заболеваний полости рта. Ведь идентификация малоизученных бактериальных организмов, которые способствуют развитию патологических процессов в тканях челюстно - лицевой области, будет оказывать большую пользу в лечении болезней полости рта.

Универсальные праймеры - разновидность молекулярной диагностики

На сегодня в качестве молекулярной диагностики используют универсальные праймеры, характеризующие весь микробный биоценоз. Для этого применяют метод культивирования. Из-за объективных ограничений метода ПЦР и иммунохимического анализа нужно проверить праймеры и антитела на чистой культуре бактерий. После такой проверки возможно применение новых препаратов в молекулярной диагностике пародонтита и других патологий полости рта.

При лечении воспалительных заболеваний пародонта часто применяются антибиотики.

Однако существует проблема, которая состоит в выборе группы антибактериальных средств, контроле их эффективности и выявлении резистентности бактерий к назначенной группе антибактериальных препаратов. Такие проблемы могут быть решены с помощью молекулярной диагностики.

Так как назначение антибактериальных препаратов нередко производится без учета вышеперечисленных факторов, внедрение молекулярной диагностики, в частности ПЦР, является довольно актуальным вопросом в клинической стоматологии.

Методы молекулярной диагностики в стоматологии:

универсальные праймеры;
ПЦР;
детекция продуктов амплификации.

Роль молекулярной диагностики в изучении генов

Использование методов молекулярной диагностики способствует развитию исследований в сфере изучения генов, которые устойчивы к антибиотикам. Например, ПЦР была использована с целью определения локусов ДНК, которые устойчивы к эритромицину и тетрациклину у анаэробов. Местное назначение тетрациклина может способствовать появлению ПК бактерий, которые устойчивы к этому препарату. По данным некоторых исследований, приблизительно 12% бактерий ротовой полости являются устойчивыми к препаратам тетрациклинового ряда.

Не менее интересные результаты продемонстрировали исследования образцов зубных бляшек и слюны, полученные от 20 здоровых взрослых, которые не принимали антибиотики на протяжении 3 месяцев. Было выявлено 8 классов генов устойчивости к тетрациклину, которые кодируют рибосомный белок. Гены устойчивости грамотрицательных бактерий локализируются по всему геному и связаны с большими перемещающимися плазмидами. Гены устойчивости бактерий размещены на малых передающихся плазмидах.

Молекулярная диагностика выявляет расположение генов устойчивости к антибиотикам

Доказано, что некоторые бактерии распространяют гены устойчивости к тетрациклину с помощью транспозонов.

Было установлено, что многие виды бактероидов имеют большое количество хромосомных элементов с геном устойчивости к тетрациклину. Данные элементы встроены в хромосому бактериоидов и самостоятельно передаются от хромосомы донора к хромосоме реципиента.

Таким образом, изучение устойчивости микробной флоры ротовой полости к антибактериальным препаратам является актуальным и приоритетным направлением в стоматологии. Большое значение в этом направлении имеет молекулярная диагностика.

Молекулярная диагностика в современной стоматологии

Исследование устойчивости микрофлоры полости рта антибиотикам является одним из приоритетных направлений современной стоматологии. Важную роль в этом направлении играет молекулярная диагностика.

Некоторые заболевания ротовой полости можно вылечить с помощью антибактериальных препаратов. Но может оказаться, что бактериальная флора устойчива к действию антибактериальных препаратов, и лекарства не подействуют.

Новые возможности для изучения и лечения заболеваний полости рта открывает молекулярная диагностика. Потому что идентификация неизвестных организмов бактерий, из-за которых развиваются патологические процессы в челюстно-лицевых тканях, будет способствовать лечению заболеваний полости рта.

Универсальные праймеры - один из методов молекулярной диагностики

Сегодня для молекулярного исследования используют универсальные праймеры. Они изучают характер всего микробного биоценоза. С этой целью используют метод культивирования. Поскольку ПЦР и иммунохимический анализ имеют объективные ограничения, праймеры и антитела нужно проверить на чистой культуре бактерий. Подобная проверка покажет, можно ли применять новые препараты при молекулярной диагностике заболеваний полости рта.

Очень часто для лечения воспалительных заболеваний применяют антибиотики. Но есть проблема, которая состоит из некоторых факторов: выбор группы антибиотиков, контроль их эффективности, выявлений резистентности бактерий на назначенный тип антибиотиков. Эту проблему можно решить благодаря молекулярной диагностике.

Поскольку зачастую антибиотики назначаются без учета вышеуказанных факторов, развитие молекулярной диагностики стает актуальным вопросом в современной клинической стоматологии.

Значение молекулярной диагностики при исследовании генов

Молекулярная диагностика помогает развитию исследований генов, которые имеют устойчивость к действию антибиотиков. Например, ПЦР использовали для определения локусов ДНК, они устойчивые к тетрациклину и эритромицину. При местном назначении тетрациклина могут появится ПК бактерии, устойчивые к данному препарату. По результатам исследований, примерно 12 % бактерий полости рта устойчивы к препаратам с тетрациклином.

Интересные результаты показали изучения образцов слюны и зубных бляшек от 20 взрослых, которые не имели жалоб на здоровье и не принимали антибиотики 3 месяца. В результате получили 8 классов генов, которые устойчивые к тетрациклину и колируют рибосомный белок.

С использованием молекулярной диагностики изучают расположение генов устойчивости к антибиотикам

Клинически доказано, что некоторые виды бактерий способствуют распространению генов устойчивости (с помощью транспозонов). Также установлено, что некоторые бактероиды имеют много хромосомных элементов с геном устойчивости. Эти элементы находятся в хромосоме бактероида и передаются от донора к реципиенту.

Таким образом, исследование устойчивости микрофлоры полости рта антибиотикам является одним из приоритетных направлений современной стоматологии. Важную роль в этом направлении играет молекулярная диагностика.

Читайте также: