Радиальная иммунодиффузия (РИД) плазмы, биологических жидкостей, парапротеинов - принципы, эффективность

Обновлено: 28.04.2024

Физиология:

Популярные разделы сайта:

Метод радиальной иммунодиффузии. Иммуноэлектрофорез

Одним из часто применяемых в настоящее время вариантов реакции преципитации з геле является метод радиальной иммунодиффузии. Он был разработай Дж. Фэйи (J7~Fahey, 1965) и Г. Манчини (G. Mancini, 1965) для количественного определения антигенов. При постановке реакции этим методом первоначально готовят гель, содержащий ангисыворотку в разведенном виде (1:50— 1 : 200). В тонком слое такого геля проделывают лунки, в которые вносят антиген в различных концентрациях. Диффундируя в гель, антиген реагирует с содержащимися в нем антителами и образует преципитат в форме кольца вокруг лунки с антигеном. Так как преципитат выпадает при эквивалентных соотношениях реагентов, диаметр кольца будет неодинаков вокруг лунок, содержащих различные количества антигена. Чем больше концентрация антигена, тем больший диаметр будет у образующегося кольца преципитации.

Сравнивая кольцо преципитации образца антигена, концентрация которого не известна, с кольцами преципитации стандартного антигена, по калибровочной кривой находят его концентрацию. Метод особенно широко применяется с тех пор, как ряд фирм стал выпускать готовые пластины геля с антисыворотками и необходимые стандарты.

Иммуноэлектрофорез. Метод, введенный П. Грабаром (P. Grabar et al., 1956), сочетает высокую разрешающую способность электрофоретического анализа макромолекул со специфичностью их выявления с помощью реакции преципитации в геле. Исследуемый образец подвергают электрофорезу в геле агара или агарозы. Затем параллельно оси движения исследуемых веществ в электрическом поле проделывают в геле траншею и заполняют ее антисывороткон. При встречной диффузии в геле антитела и антигены, подвергнутые электрофорстическому разделению, образуют зоны преципитации в форме дуг.
Существует большое число модификаций основного метода, имеющих целью повысить его чувствительность. К ним относятся противоточный и двухмерный электрофорез, радиоиммуноэлектрофорез и др.

иммунодиффузия

Агглютинация. Агрегация низкодисперсных (нерастворимых) антигенов с помощью антител называется агглютинацией. Антигенами могут быть бактерии, клетки крови (чаще всего эритроциты), другие клетки. Если антитела направлены против антигенов, являющихся составной частью бактериальной стенки или клеточной мембраны, реакцию обозначают как активную (активная агглютинация). Пассивной называют агглютинацию клеток антителами против антигенов, сорбированных или присоединенных ковалентно к клеточной мембране (обычно эритроцита). Во всех случаях, когда речь идег об агглютинации эритроцитов, реакцию называют гемагглютинацией (активная или пассивная).

Реакция агглютинации по своему механизму не отличается от реакции преципитации. «Сшивка» бивалентными или поливалентными антителами (IgG или IgM) приводит к формированию «решетки». В силу несоизмеримо больших размеров корпускулярного антигена по сравнению с молекулой антитела поперечная сшивка, например, двух соседних эритроцитов может оказаться недостаточной для их фиксации. Устойчивость агрегата растет по мере формирования «решетки», обеспечивающей связывание клеток по многим точкам. Именно поэтому поливалентные антитела намного эффективнее агглютинируют антигены в сравнении с бивалентными. Так, IgM-гемагглютнннпы более чем в 1000 раз активнее в реакции гемагглютинацни, чем IgG-гемагглютинины.

Реакция агглютинации не имеет строго количественного учета. Однако практическая ценность ее столь велика, что и по сей день она остается важным инструментом как в руках исследователя, так и врача-лаборанта.

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

В 1965 г. Джульетта Манчини и соавт., а независимо от них - Д.Л. Фэй и Э.М. МакКелви разработали методику радиальной иммунодиффузии (РИД) в том же агаровом геле для количественного определения содержания в крови (в сыворотке) иммуноглобулинов классов А, G и М.

Для этого потребовалось получить моноспецифические антисыворотки лабораторных животных против очищенных иммуноглобулинов классов М, А и G человека. Моноклональных антител в те годы еще не было.

Манчини, Фэй и МакКелви воспользовались тем физикохимическим свойством агар-агара, что температура его плавления недалека от физиологических температур теплокровных животных, и белки (по крайней мере иммуноглобулины) не претерпевают калечащую денатурацию при температуре плавления агара. Это позволило авторам ввести в состав золя агара, т.е. в жидкую фазу, антисыворотки против иммуноглобулинов разных изотипов, тщательно перемешать раствор перед заливанием на стеклянную пластину. Таким образом, в слое агарового геля оказываются заплавленными антииммуноглобулиновые антиизотипические антитела. В таком геле пробивают круглые луночки, в которые вносят так называемые стандарты (или калибраторы, т.е. растворы иммуноглобулинов с известной концентрацией для построения калибровочной кривой) и пробы испытуемых сывороток и оставляют на свободную диффузию на 16-24 ч.

По истечении этого времени вокруг луночек образуются видимые невооруженным глазом кольца преципитатов. Опыт показал: диаметр колец преципитатов тем больше, чем выше концентрация данного изотипа иммуноглобулинов в исследуемой биопробе. Калибраторы - препараты иммуноглобулинов заданного изотипа с известной весовой концентрацией (мг/мл) - позволяют построить калибровочную кривую и с ее помощью определить концентрации иммуноглобулинов в испытуемых пробах сывороток. Последнее возможно только на прямом отрезке кривой. Для спрямления калибровочной кривой прибегают к несложным математическим действиям, например откладывают на осях координат не диаметр колец преципитации, а квадрат этой величины, и/или не концентрацию изотипа иммуноглобулинов, а логарифм концентрации по основанию 2 или 10. Какой подход окажется приемлемым, подбирают опытным путем в каждой лаборатории.

Хотя метод РИД разработан полвека назад, его нередко используют в лабораториях клинической иммунологии до настоящего времени в силу простоты исполнения, относительно невысокой стоимости реагентов и независимости от приборов.

Метод РИД применим только для названных изотипов иммуноглобулинов (М, А и G), ибо их физиологические концентрации в сыворотках крови попадают в пределы чувствительности метода (мг/мл).

Изотипы IgD и IgE присутствуют в нормальных сыворотках в таких низких концентрациях, которые метод РИД не «видит». Концентрации IgE определяют с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа - ИФА (см. ниже):

1) общий IgE - ловушечным ИФА, в котором первым слоем на твердой фазе сорбированы моноклональные антиизотипические анти-ε-антитела;

2) для определения антигенспецифичных IgE антигены сорбируют на пористой твердой фазе, где площадь сорбции существенно превосходит дно планшета при одном и том же реакционном объеме; чувствительность определения соответственно существенно выше.

IgD в норме присутствует в сыворотках в следовых количествах, и задача его измерения встает крайне редко (вероятно, только в случаях IgD-продуцирующих плазмоцитом).

В табл. 4.1 и 4.2 приведены нормальные концентрации иммуноглобулинов разных изотипов у людей разного возраста (по данным более современного нефелометрического определения с использованием антиизотипических моноклональных антител и прибора нефелометра).

Таблица 4.1.Концентрации иммуноглобулинов классов М, А и G в сыворотке крови человека в норме


Окончание табл. 4.1


Таблица 4.2.Концентрация изотипов IgG (1, 2, 3, 4), IgA (1, 2) и IgE в сыворотке крови взрослого человека в норме

Поскольку IgE в норме в крови присутствует в низкой концентрации, то для снижения вероятности ошибок при записывании нулей по международной договоренности значения IgE выражают в так называемых международных единицах - МЕ/мл или кМЕ/л (IU/ml, kIU/l). 1 МЕ равна 2,43 нг IgE.

Двойная радиальная иммунодиффузия

Принцип метода. В лунки, вырезанные в агаровом или агарозном геле, помещают антиген и антисыворотку, которые диффундируют навстречу друг другу. В том участке геля, где их соотношения эквивалентны, образуется видимый преципитат. Двойную радиальную иммунодиффузию проводят на предметных стеклах (микрометод).

Методика. Расплавляют 1,5 г агара в 100 мл буфера (0,15 М NaCl) на водяной бане. Порциями по 3 мл горячий агаровый гель наносят на сторого горизонтально установленные предметные стекла, для того чтобы получить равномерный слой агара толщиной приблизительно 1,5 мм. После застывания агара пластинки готовы к употреблению. В зависимости от характера иммунохимических исследований в агаре делают дунки при помощи готовых штампов или вырезают из стеклянной (можно металлической) трубочкой. Лунки должны отстоять друг от друга на расстоянии от 4 до 10 мм. В одни лунки вносят сыворотку, в другие - антигены. После внесения растворов иммунодиффузию проводят во влажной камере при температуре 4°, 20° или 37°С. Продолжительность диффузии зависит от целей исследования, она должна быть не менее 24 часов и в некоторых случаях может достигать 6-7 дней. По окончании иммунодиффузии можно непосредственно оценивать результаты по влажному препарату. Возможен другой способ оценки результатов. Для этого нужно сначала отмыть непреципитирующие субстанции замачиванием пластины 2-3 раза на 12 часов в 0,15 М растворе NaCl. Затем на поверхность геля кладут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, и гель высушивают при 40-50°С или при комнатной температуре. Высушенные пластины геля окрашивают обычно амидочерным 10В, после чего оценивают результаты иммунодиффузии.

Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации:

1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов.

2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реагирующие с антисывороткой детерминанты антигенов неидентичны, и следовательно, сами антигены различны.

3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой «шпоры». «Шпора» часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с антигеном сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими антителами иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из антигенов имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих антител в антисыворотке приводит к образованию шпоры.

4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это означает, что оба антигена содержат как одинаковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспецифической антисыворотки.

Основные типы преципитации представлены на рис. 3.

Вышеописанная методика иммунодиффузии на предметных стеклах представляет собой микровариант метода, предложенного Ухтерлони в 1949 г. В условиях макрометода слой геля, создаваемый в чашках Петри, составляет 2-3 мм, лунки и соответственно объемы реагентов довольно велики, лунки отодвинуты друг от друга на значительные расстояния, линии преципитации длинные и хорошо выраженные.

Титрование. Для титрования растворов антигена и антисыворотки располагают лунки так, как показано на рис. 4.

Одинаковые объемы растворов антигена, приготовленных двукратным разведением вносят в периферические лунки. Такой же объем антисыворотки вносят в центральную лунку. При оценке иммунодиффузии учитывают:

1. Расстояние от линии преципитации до центральной и периферической лунок.

2. Наибольшее разведение антигена, при котором еще заметно образование преципитата.

3. Интенсивность и ширину плюс преципитации.

Наибольшее разведение, при котором образуются видимые преципитаты, дает значение титра. Этим способом можно также определять количество преципитирующих антител в различных антисыворотках, которые можно сравнивать в реакции иммунодиффузии со стандартным раствором антигена.

Полуколичественное определение антигенов. Титрование часто используют для полуколичественного определения антигена. Вокруг центральной лунки с антисывороткой формируют четыре лунки для антигена. Чем выше концентрация антигена, тем ближе к центральной лунке будут расположены полосы преципитации. Путем сравнивания со стандартным раствором антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена.

Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыворотка. Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах (рис. 44).

Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма (рис. 44).

Познавательно:

Тема 12. Содержательные и процессуальные теории мотивации 1.Содержательные теории мотивации: теория иерархии потребностей А. Маслоу.
Порядок действий локомотивной бригады при нарушениях нормальной работы устройств АЛСН и контроля бдительности машиниста 1. В случае внезапного появления на локомотивном светофоре желтого с красным или красного огней из-за нарушения нормальной работы.
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «.
Профессиональные качества и навыки юриста К профессии юриста, так же как и к любой другой профессии предъявляются различные профессиональные требования.
Автоматизированная информационная система Реферат ПО ТЕМЕ: Автоматизированная информационная система. Принцип работы на примере конкретной системы. Выполнил .

Я никогда не присоединюсь к движению против войны. Позовите меня, когда появится движение за мир. © Мать Тереза ==> читать все изречения.

Радиальная иммунодиффузия (РИД) плазмы, биологических жидкостей, парапротеинов - принципы, эффективность

Медицинская микробиология:

Методика проведения простой (одиночной) радиальной иммунодиффузии по Манчини

Простая (одиночная) радиальная иммунодиффузия по Манчини (G. Mancini, 1965) используется для количественного определения изотипов иммуноглобулинов, компонентов системы комплемента в сыворотке и др. Принцип метода состоит в следующем: на твердую основу (стеклянную или полистироловую пластинку) наносят слой агара с моноспецифической антисывороткой к одному из изотипов иммуноглобулинов (антитело). В этом слое делают лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку пациента (антиген).

Антиген из лунок диффундирует в гель, где встречается с антителами, что сопровождается образованием зоны помутнения в агаре (преципитат) в виде кольца преципитата. Диаметр кольца увеличивается до тех пор, пока весь внесенный антиген не будет связан антителом, внесенным в гель. Площадь этой зоны прямо пропорциональна количеству внесенного в лунки антигена (т. е. количеству иммуноглобулина определенного класса), которое устанавливают по калибровочной кривой.

Для постановки реакции необходимо иметь:
— моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов М, G и А (выпускаются в нашей стране в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалея РАМН, НИИВС им. И. И. Мечникова);
— образцы сыворотки крови от обследуемых лиц;
— стандартную референс-сыворотку, полученную от здоровых доноров (выпускается в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалея РАМН);
— 3% агар Дифко или Нобля («Difco», США) или агарозы в веронал-мединаловом буфере 0,12 М, pH 8,56. (Для приготовления такого геля навеску 3 г агара растворяют в 50 мл дистиллированной воды, нагревая на слабом огне при постоянном перемешивании в течение 40 мин. Затем, продолжая нагревать, добавляют 50 мл 0,2 М веронал-мединалового буфера pH 8,56, перемешивают до полного растворения агара, не доводя до кипения);
— веронал-мединаловый буфер 0,12 М pH 8,56;
— окрашивающую жидкость: амидо-черный — 1 г, уксусная кислота ледяная — 100 мл, вода дистиллированная—до 1000 мл; перемешать, профильтровать;
— отмывающий раствор: уксусная кислота ледяная 70 мл, вода дистиллированная до 1000 мл;
— стекла размером 9х 12 см, П-образную рамку 120x90x8 мм толщиной 1 мм;
— пробойник;
— водяную баню на 50-60 °С;
— влажную камеру.

а) Постановка реакции и учет результатов. Для количественного определения изотипов иммуноглобулинов готовят агаровый гель: 4 мл растопленного и охлажденного до 56 °С 3% агара Дифко смешивают с равным количеством моноспецифической сыворотки против одного из изотипов иммуноглобулина, разведенной веронал-мединаловым буфером 0,12 М pH 8,6 до 1/2 рабочего разведения (см. ниже). Этот гель используют для заливки стеклянной пластины следующим образом: берут 2 стеклянные пластины 9х12 см, одну из них смазывают гидрофобной жидкостью (например, КГЖ-94), другую—тонким слоем агара.

Между этими пластинами устанавливают П-образную рамку 120x90x8 мм, толщиной 1 мм и всю систему скрепляют зажимами. В пространство между пластинами выливают 8 мл приготовленного агарового геля с антиглобулиновой сывороткой. После застывания геля снимают зажимы, рамку и пластину, обработанную гидрофобной жидкостью. В дальнейшей работе используют стеклянную пластину с застывшим гелем (при достаточном опыте можно заливать агаровый гель непосредственно на стеклянную пластину). Если необходимо определить иммуноглобулины трех изотипов (IgM, IgG, IgA), готовят 3 пластины, залитые гелем, как описано выше. На каждой пластине пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм друг от друга (7 рядов по 5 лунок в каждом).

Важным этапом в проведении теста является построение калибровочных кривых. Для этого в лунки второго ряда каждой пластины вносят по 2 мкм стандартной референс-сыворотки—неразведенной и в разведениях 1:2-1:16. Такая сыворотка содержит определенное количество иммуноглобулинов классов М, G и А. Можно приготовить собственный рабочий стандарт из смеси свежих сывороток от здоровых доноров, откалиброванных по референс-сыворотке.

В оставшиеся лунки вносят сыворотки обследуемых лиц в объеме по 2 мкл. Пластины помещают во влажную камеру и инкубируют 24 ч при 4°С. Затем их. на 48 ч погружают в забуференный изотонический раствор натрия хлорида для отмывки от несвязавшихся белков с троекратной сменой буфера.


Измеряют диаметр колец преципитации во втором ряду лунок со стандартной референс-сывороткой и ее разведениями. Строят калибровочные кривые, где на оси ординат откладывают концентрацию иммуноглобулина, а на оси абцисс— диаметр колец. В дальнейшем по этим калибровочным кривым определяют концентрацию иммуноглобулинов изотипов М, G и А в сыворотках обследуемых лиц. Калибровочные кривые строят отдельно для каждой пластины.

Линии преципитации, образовавшиеся в геле, можно окрасить различными методами. Для этого предварительно пластины заливают изотоническим раствором натрия хлорида, меняя раствор несколько раз в течение 3 дней. Затем тщательно несколько раз промывают водой. Агар покрывают несколькими слоями влажной фильтровальной бумаги и высушивают при 37 °С до превращения его в тонкую пленку. Стеклянные пластины с высушенными агаровыми пленками окрашивают. Для окрашивания линий белка используют один из следующих красителей: амидочерный, азокармин, бромфеноловый синий, бромкрезоловый зеленый. Пластинки помещают в краситель на 4 ч.

Затем промывают в двух порциях отмывающего раствора. Высушивают при 37 °С. После такой обработки с пластины можно снять тонкую пленку высушенного геля с результатами реакции и сохранять в качестве протокола опыта.

Для окраски липидов и липопротеинов применяют насыщенный раствор Судана черного в 60% этиловом спирте. Пластины выдерживают в растворе этого красителя 2 ч, отмывают 2 раза 50% этанолом по 15 мин. Затем их помещают в 20% раствор глицерина, содержащий 2% ледяной уксусной кислоты, инкубируют 4 ч при 37 °С. Высушивают после извлечения из раствора при той же температуре и снимают пленки геля с результатами реакции со стеклянной пластины.

б) Определение рабочего разведения моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов М, G и А. Готовят ряд разведений 1:10-1:80 каждой из антисывороток в 0,1 М веронал-мединаловом буфере pH 8,6. В пробирки, содержащие по 1 мл растопленного и охлажденного до 56° С 3% агара, которые помещены на водяную баню, добавляют по 1 мл приготовленных разведений монорецепторной антисыворотки и хорошо перемешивают.

Смесь агара и антисыворотки выливают между стеклянными пластинами, сконструированными, как описано выше. Сначала используют 2 мл антисыворотки в разведении 1:80. После застывания вносят 2 мл в разведении 1:40 и далее добавляют каждое последующее разведение после застывания предыдущего. Таким образом, на одной пластине размещается 4 ряда смеси по 2 мл, содержащей разведения антисыворотки и агар. После застывания последнего ряда и снятия зажимов, рамки и пластины, обработанной гидрофобной жидкостью, освобождают пластину со слоем агара и антисыворотки. В этом слое пробойником делают лунки, в которые вносят разведения стандартной референс-сыворотки в объеме 2 мкл. Через 24 ч инкубации при 4 °С оценивают результаты.

Рабочим разведением антисыворотки считается ее максимальное разведение, при котором образуются четкие кольца преципитации со стандартной референс-сывороткой, интенсивность которых достаточна для их измерения.

в) Методы иммуноэлектрофореза используются для выявления антигенов или антител в том случае, если миграция компонентов иммунного комплекса проходит в электрическом поле. При этом достигается разделение антигенов и антител на компоненты в соответствии с их подвижностью и зарядом. Используют методы простого, ракетного или встречного иммуноэлектрофореза.

Метод простого иммуноэлектрофореза включает 2 этапа:
— электрофоретическое разделение смеси антигенов в геле;
— выявление разделенных антигенов при помощи антител-преципитинов путем свободного диффундирования их навстречу антигенам. В геле, в области эквивалентности, формируются визуально различимые линии преципитата (двойная радиальная иммунодиффузия).

В ракетном иммуноэлектрофорезе движение антигена в электрическом поле происходит в геле, содержащем антитела. В области эквивалентности концентраций антигена и антител формируется преципитат в виде факела ракеты.

Метод встречного иммуноэлектрофореза основан на движении антигена и антитела навстречу друг другу под действием электрического поля. Белковые и полисахаридные антигены заряжены отрицательно и движутся по направлению к аноду. Молекулы иммуноглобулинов движутся к катоду. Формируется видимый преципитат в виде прямой линии, перпендикулярной направлению движения антигена и антител.

Читайте также: