Плацентарная щелочная фосфатаза (ПЩФ) и карциноэмбриональный антиген (КЭА) в норме и при раке

Обновлено: 26.04.2024

Научный редактор: М. Меркушева, ПСПбГМУ им. акад. Павлова, лечебное дело.
Ноябрь, 2020.

Синонимы: Фосфатаза щёлочная, ЩФ, Alkaline phosphatase, ALP.

Степень активности щелочной фосфатазы определяется методом биохимического анализа крови. Данный показатель считается наиболее важным диагностическим критерием при заболеваниях опорно-двигательного аппарата, печени, почек и других внутренних органов.

Щелочная фосфатаза - это общее название группы ферментов, которые принимают активное участие в кальциево-фосфорном обмене, а именно, в процессе расщепления фосфорной кислоты. Фосфатазы локализуются в мембранах практически всех клеток организма, но большая их часть находится в тканях печени, желчного протока, кишечника, почек, костей, плаценты.

Основные сведения

Группа фосфатаз в организме человека представлена 11 изоферментами, из которых самыми основными являются:

ALPI - кишечная фосфатаза;
ALPL - неспецифическая (из тканей печени, костей, почек) фосфатаза;
ALPP - плацентарная фосфатаза.

В норме щелочная фосфатаза состоит из 2-х фракций: костного и печеночного изоферментов (костный - в остеобластах, печеночный выделяется с желчью), количественное содержание которых в сыворотке крови примерно одинаково. Но в ряде случаев это соотношение может меняться или «разбавляться» включением других видов изоферментов. К подобным ситуациям можно отнести патологические состояния, например, поражение клеток механического, воспалительного характера или какие-либо физиологические особенности организма.

Спровоцировать рост активности щелочной фосфатазы могут заболевания:

органов гепатобилиарной системы;
опорно-двигательного аппарата;
органов пищеварительного тракта;
злокачественные новообразования;
эндокринные нарушения.

Кроме того, повышение значений фосфатаз может наблюдаться у вполне здоровых людей с интенсивным (сильнее обычного) обменом веществ, у беременных и у детей в период активного роста костей.

Снижение активности щелочной фосфатазы фиксируется крайне редко и чаще всего это происходит на фоне недостаточности функции щитовидной железы, нарушения питания (голодание, строгие диеты), дефицита витаминов и микроэлементов и пр.

Показания к исследованию

Назначают и интерпретируют результаты специалисты: терапевт, гастроэнтеролог, гепатолог, инфекционист, гематолог, эндокринолог, хирург, врач общей практики, педиатр.

Обструктивные заболевания печени и желчевыводящих путей;
Воспалительные заболевания желчевыводящих путей;
Патологии костной системы, в т.ч. рак первичный и метастатический;
Онкологические заболевания почек;
Инфекционный мононуклеоз (острое вирусное заболевание, в ходе которого происходит поражение печени).
Индивидуальный мониторинг пациентов с остеопорозом, получающих антирезорбтивные средства 1 .

Анализ на щелочную фосфатазу является обязательным в программе плановых медосмотров и при подготовке пациента к хирургическому вмешательству. Также тест на фосфатазы включен в перечень «печеночных проб», когда назначается диагностическое исследование функции печени.

Кроме того, оценить активность щелочной фосфатазы рекомендуется при жалобах пациента на:

повышенную утомляемость;
слабость;
нарушение или отсутствие аппетита;
тошноту/рвоту;
боли в области живота/правого подреберья;
желтушность кожных покровов;
изменение цвета мочи и/или кала;
кожный зуд;
чувство ломоты в костях;
частые переломы и/или деформации костей.

Повторный анализ на щелочную фосфатазу обычно назначается с целью контроля за течением заболевания и/или оценки эффективности проводимого лечения.

Подготовка

Выполнения сложных подготовительных мероприятий к данному исследованию не требуется. Подготовка проводится соответственно биохимическому анализу крови. Подробнее о правилах можно посмотреть здесь.

Референсные значения

Важно! Нормы могут различаться в зависимости от реактивов и оборудования, используемого в каждой конкретной лаборатории. Именно поэтому при интерпретации результатов необходимо пользоваться стандартами, принятыми в той лаборатории, где сдавался анализ. Также необходимо обращать внимание на единицы измерения.

Нормы щелочной фосфатазы по данным независимой лаборатории Инвитро 2 :

Нормы лаборатории Хеликс 3 :

Возраст, пол		Референсные значения
до 15 дней		83 - 248 Ед/л
15 дней - 1 год		122 - 469 Ед/л
1-10 лет		142 - 335 Ед/л
10-13 лет		129 - 417 Ед/л
13-15 лет	женский	57 - 254 Ед/л
	мужской	116 - 468 Ед/л
15-17 лет	женский	50 - 117 Ед/л
	мужской	82 - 331 Ед/л
17-19 лет	женский	45 - 87 Ед/л
	мужской	55 - 149 Ед/л
старше 19 лет	женский	35 - 105 Ед/л
	мужской	40 - 130 Ед/л

Данные по щелочной фосфатазе Руководства по лабораторным методам диагностики 4 :

Возраст	Общая, МЕ/л	Костная,%
Новорождённые	35 - 106
1 месяц	71 - 213	85
3 года	71 - 142	85
10 лет	106 - 213	85
Взрослые до 31 года	39 - 92	60
Взрослые старше 31 года	39 - 117	40

Факторы влияния

последний триместр беременности (щелочная фосфатаза содержится в плаценте);
постменопауза (период после наступления менопаузы);
состояние после переломов костей (стадия заживления);
недоношенность (у новорожденных детей);
детский/подростковый возраст (активный рост костей);
нарушение правил транспортировки и хранения биоматериала (охлаждение крови после взятия);
прием лекарственных препаратов, обладающих высокой гепатотоксичностью (агрессивное действие на печень):
метотрексат;
хлорпромазин;
парацетамол;
аспирин;
аллопуринол;
антибиотики широкого спектра действия;
сульфаниламиды;
прием больших доз аскорбиновой кислоты (витамин С), магнезии;
дефицит фосфатов и кальция в пищевом рационе.

нарушение питания (недостаток магния и цинка в пище);
прием медикаментозных средств:
оральные контрацептивы;
эстрогены;
клофибрат;
даназол;
азатиоприн;
наличие примесей в лабораторной посуде: мышьяк, цитрат, бериллий, ЭДТА и др. (ошибка лаборанта при выборе емкости).

Важно! Интерпретация результатов всегда проводится комплексно. Поставить точный диагноз на основании только одного анализа невозможно.

Повышение значений

Заболевания печени и желчевыводящих путей:

непроходимость желчевыводящих протоков и, как следствие, механическая желтуха:
камни желчных путей,
опухолевые образования желчных протоков;
рак головки поджелудочной железы, желудка (провоцирует механическое сдавливание общего желчного протока);
первичный и/или вторичный (метастазирующий) рак печени; печени (патологический процесс замещения здоровой ткани органа соединительной (рубцовой) тканью, в результате которого угнетается функция печени);
гепатиты любой этиологии (активность щелочной фосфатазы в этом случае в 3 раза превышает нормальные показатели);
инфекционный мононуклеоз (острая вирусная патология, в ходе которой страдает функция печени);
аутоиммунные поражения желчных путей (редко встречающиеся наследственные заболевания: первичный билиарный цирроз и первичный склерозирующий холангит). В этом случае также наблюдается одновременное повышение значений щелочной фосфатазы и гамма-ГТП до высоких цифр;

Патология костной ткани:

болезнь Педжета (аномальный рост костей и локальное нарушение их структуры);
остеомаляция (патологическое размягчение костной ткани, спровоцированное дефицитом кальция); (нарушение костеобразования и недостаточность минерализации костей, проявляется у детей грудного и раннего возраста);
остеосаркома (первичный рак костей) и метастазы из очагов рака в других органах;

инфаркт миокарда, легкого, почки; , перфорация кишечника;
цитомегалия у детей (вирусное заболевание, в патологический процесс вовлекается печень и селезенка); (интенсивное вымывание кальция из костной ткани на фоне гиперфункции околощитовидных желез).

Неспецифическая щелочная фосфатаза присутствует на мембране нейронов и может играть роль в нейродегенерации при болезни Альцгеймера, практический у всех пациентов с болезнью Альцгеймера отмечается повышение щелочной фосфатазы в крови 5 .

Примечание: если наряду с высокой активностью щелочной фосфатазы другие биохимические показатели крови (билирубин, АЛТ, АСТ) тоже повышены, то вполне вероятно поражение печени. Если повышается уровень кальция и фосфора, то предполагают патологию костей. Одновременное повышение щелочной фосфатазы и гамма-ГТП является признаком заболеваний желчевыводящих путей.

Понижение значений

Дефицит витамина В12;
Гемотрансфузия (переливание крови);
Квашиоркор (тяжелая дистрофия, вызванная дефицитом белков, чаще развивается у детей 1-4 лет); (недостаточность функции щитовидной железы);
Ахондроплазия (наследственное нарушение процессов роста длинных костей, карликовость);
Гипофосфатазия (редкое врожденное заболевание, провоцирующее размягчение костной ткани);
Кретинизм (аномальное развитие щитовидной железы, слабоумие);
У беременных недостаточность плаценты.

Sonia A Talwar, MD. Bone Markers in Osteoporosis. - Medscape, Jan 2017. Данные независимой лаборатории Инвитро. Данные лаборатории Хеликс. А.А.Кишкун, д.м.н., проф. Руководство по лабораторным методам диагностики, - ГЭОТАР-Медиа, 2007г. Vardy ER. Alkaline phosphatase is increased in both brain and plasma in Alzheimer's disease. - Neuro-degenerative diseases 2012;9(1):31-7

Важно! Все материалы носят справочный характер и ни в коей мере не являются альтернативой очной консультации специалиста.

Этот сайт использует cookie-файлы для идентификации посетителей сайта: Google analytics, Yandex metrika, Google Adsense. Если для вас это неприемлемо, пожалуйста, откройте эту страницу в анонимном режиме.

Плацентарная щелочная фосфатаза (ПЩФ) и карциноэмбриональный антиген (КЭА) в норме и при раке

Плацентарную щелочную фосфатазу (ПЩФ) относят к белкам, ассоциированным с беременностью и опухолевым ростом. ПЩФ образуется в плаценте и фетальных тканях, в крови беременных женщин выявляется с 10-14 недель в количестве от 1,0 до 40,0 Ед/л, сохраняясь в кровотоке после родов в течение 10-14 дней. ПЩФ является маркёром герминогенных опухолей, обнаруживается в биологических жидкостях, эпителиальных клетках, фибробластах стромы и эндотелии новообразующихся сосудов опухолевой ткани при раке лёгкого и других органов, что следует учитывать при назначении лечения.

Плацентарную щелочную фосфатазу (ПЩФ), источником которой в организме матери является плацента [12], относят к белкам, ассоциированным с беременностью и опухолевым ростом [1, 13, 15, 31, 36]. ПЩФ генетически полиморфна и, в отличие от других типов щелочной фосфатазы, выдерживает нагревание до 65 °С в течение 10-15 минут и ингибируется в высокой степени L-фенилаланином и незначительно - L-гомоаргинином, но не L-лейцином, мочевиной и ЭДТА [13, 16, 18, 19]. Обычно ПЩФ синтезируется в плацентарном синцитиотрофобласте и поступает в кровоток матери после 12 недель беременности в количестве от 1,0 до 40,0 Ед/л. Различают 6 общих фенотипов ПЩФ S, FS, F, I, SI и FI согласно их изоэлектрической подвижности в крахмальном геле: S - медленная, F - быстрая и I - промежуточная [15, 18, 31]. Три общих аллеля ответственны за 97,5 % плацентарных фенотипов, в связи с чем, частота редких аллелей достигает 2,5 %. Это приводит к появлению редких гибридных фенотипов. Так, при исследовании 5000 плацент разных рас людей выявлено 48 фенотипов ПЩФ [1, 9, 22]. Ещё большее многообразие вариантов ПЩФ может быть выявлено с помощью моноклональных антител [14, 24]. Исследование ДНК и энзимного полиморфизма ПЩФ используется при изучении популяционных отличий [9, 22, 24, 31].

В онтогенезе экспрессия ЩФ регулируется таким образом, что до 10-й недели беременности в плаценте присутствует ЩФ, похожая по свойствам на печеночную ЩФ взрослого человека, на 10-13 неделях удаётся обнаружить плацентарный изоэнзим, а к 14 неделям этот фермент обеспечивает полную активность ЩФ плаценты, причём синтез его стимулируется эстрогенами [1, 11, 16, 26]. Вероятно, печёночная ЩФ является филогенетически более древней, а плацентарная ЩФ - более поздним продуктом эволюции, т.к. встречается только у некоторых приматов и человека [6, 31].

Промежуточное положение занимает схожая с ПЩФ по аминокислотному составу, антигенным свойствам и чувствительностью к L-фенилаланину, но менее термостабильная тонкокишечная ЩФ (ТКЩФ) человека. Обнаружены гибриды ПЩФ-ТКЩФ [11, 15, 24].

В наших исследованиях методом встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), с использованием моноспецифической кроличьей антисыворотки к ПЩФ и последующим гистохимическим окрашиванием агаровых пластинок на щелочную фосфатазу, ПЩФ определяется как в водно-солевых экстрактах на трис-глициновом буфере рН 8,6 (титр 1:512), так и бутаноловых экстрактах плаценты. При этом наибольшее количество фермента экстрагируется бутанолом из её мембранных фрагментов (титр 1:2048). Это также свидетельствует о существовании секретируемой и мембраносвязанной форм ПЩФ [1, 5, 6, 7, 33, 34]. Секретируемая ПЩФ выявляется в водно-солевых экстрактах фетальной лёгочной ткани с 26 недель внутриутробного развития плода человека в 72,7 % случаев в титре 1/4-1/8 (4-8 ЕД). К моменту рождения частота обнаружения этого антигена снижается до 30 % (титр 1/2-1/4 или 2-4 ЕД). Мембраносвязанная ПЩФ обнаруживается в бутаноловых экстрактах эмбриональных органов человека: в лёгких печени, почках, ЖКТ. Кроме того, кроличья антисыворотка, полученная к бутаноловым экстрактам из мембранной фракции фетального лёгкого, даёт реакцию полной идентичности с антисывороткой к ПЩФ [6], что является ещё одним доказательством продукции ПЩФ в эмбриональной легочной ткани. Высокая активность ПЩФ выявляется также иммуногистохимическим методом в зоне активного новообразования костной ткани эмбрионов человека: зона роста, периостальный слой и эндотелий новообразующихся сосудов и гаверсовых каналов [7, 34].

В сыворотке крови и органах здоровых взрослых людей методом ВИЭФ ПЩФ не идентифицируется [6, 8], однако, минорные количества ПЩФ определяются в сыворотке крови более чувствительными иммуноферментными и иммунорадиологическими методами, как у здоровых небеременных женщин, так и у мужчин, значительно повышаясь при патологии [3, 10, 16, 17, 27, 31, 34].

ПЩФ синтезируется в течение всей беременности, однако её физиологическая роль неясна [2, 7, 20, 21, 26, 31, 36]. По данным Onwuameze I.C. et al, (метод иммуноферментного анализа) у 47 небеременных средняя концентрация ПЩФ равна 0,79 ± 1,54 МЕ/л и в первые 8 недель беременности (98 женщин) достоверных отличий не отмечено (0,98 ± 1,28 МЕ/л). В процессе развития беременности уровень ПЩФ нарастает и её определение может быть рекомендовано в качестве простого теста для определения плацентарной недостаточности [2, 26]. В отдельных случаях количество ПЩФ в сыворотке крови здоровых беременных может превышать нормальный уровень в 10-25 раз [36]. Снижение уровня ПЩФ в крови беременных отмечено при гестозах, нарушении кальций-фосфор-магниевого гомеостаза, угрозе прерывания беременности[1, 2, 5, 19], а повышение - при диабете беременных [37].

Таким образом, функция ПЩФ в организме матери представляется неоднозначной. Видимо, этот энзим, участвуя в дефосфорилировании различных соединений, является активным ключевым ферментом многих метаболических процессов в быстрорастущих тканях матери и плода, для обеспечения которых обычных гидролаз было бы недостаточно [9, 19, 20, 21, 26, 29, 33]. Кроме того, ПЩФ принимает участие в активации факторов роста и, возможно, сама обладает такими свойствами [30]. Есть также указания на то, что ПЩФ может играть роль активатора плазминогена, что очень важно для регуляции системы гемостаза беременных и рожениц, у которых, как правило, отмечается гиперкоагуляция [7]. В физиологических условиях ПЩФ, наряду с ХГЧ, плацентарным лактогеном, специфическим бета-гликопротеином беременных и антигеном KI - 67, относят к маркёрам дифференцировки трофобласта [23, 25, 28]. Как отмечают Losh A. et Kainz C. [23] клиническое распознавание различий между полным и частичным пузырным заносом (complete hydatidiform mole and partial hydatidiform mole) позволяет прогнозировать повторное развитие беременности, малигнизацию или метастазирование трофобластической болезни беременных. Solehnia M. et al. не опровергают это положение, обнаружив снижение активности ПЩФ в ткани плаценты и сыворотке крови женщин с полным пузырным заносом [28]. ПЩФ может способствовать развитию плода, также как и росту раковых клеток, которые экспрессируют онкоген Ras [24, 30].

Интерес к ПЩФ в онкологии возник после того, как Fishman W. в 1968 г. обнаружил в ткани аденокарциномы лёгкого, плевральном экссудате и сыворотке больного раком лёгкого термостабильную щелочную фосфатазу, иммунохимически идентичную плацентарной, которую он назвал по имени больного «изоэнзим Регана» [16].

С тех пор обнаружено, что злокачественные опухоли могут продуцировать и другие варианты ПЩФ. Отмечена продукция опухолевыми тканями раннего плацентарного изоэнзима («не Регана»), характерного для плаценты первых 6 - 10 недель беременности [31], «изоэнзима Нагао» а также тонкокишечного варианта ЩФ («Казахара»), дающим перекрёстную реакцию преципитации с антисывороткой к ПЩФ [15]. Этот изофермент ингибируется L-фенилаланином, L-гомоаргинином, устойчив к нагреванию при 56 °С, но не к 65 °С и обнаруживается в сыворотке крови больных гепатомой , почечно-клеточным раком, семиномой и раком поджелудочной железы [11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 26, 33, 35].

При заболеваниях печени (гепатит, цирроз) возрастает количество кишечного изофермента ЩФ, дающего перекрёстную иммунохимическую реакцию с плацентарной ЩФ [6, 8, 15, 18]. При злокачественных опухолях печени в крови определяются печёночная и плацентарная ЩФ [8, 16, 18, 24, 31, 32]. По нашим данным, изоэнзимы ПЩФ обнаруживаются в опухолевой, околоопухолевой легочной ткани и коже больных раком легких иммуногистохимическими методами в 61-70 % случаев, что ассоциируется с существованием в клинической картине рака паранеопластических синдромов. При этом, количество активного изоэнзима в 8 раз выше в тканях низкодифференцированного или недифференцированного рака легкого, по сравнению с высокодифференцированным, что может быть использовано в иммуноморфологической характеристике этого заболевания [6, 34]. Появление ПЩФ и ПШФ-подобных изоэнзимов в сыворотке крови мы регистрировали методом ВИЭФ в количестве 1-8 ЕД у 52,7 % больных с 3 и 4 стадиями рака легкого и лишь в 5,3 % случаев - при 1 и 2 стадии, что может служить дополнительным диагностическим и прогностическим признаком [1, 6]. Кроме того, ПЩФ считается маркёром герминогенных опухолей и обнаружение её при раке легкого и других локализациях, на наш взгляд, следует учитывать при разработке схем химио-гормонотерапии
[4, 10, 27, 35].

Изоэнзимам ПЩФ, как опухолевым маркёрам, посвящено большое число публикаций, в том числе, фундаментальных обзоров и монографий [16, 24, 31]. Согласно гипотезе, объясняющей синтез неопластической клеткой белков, не свойственных данному типу клеток в норме, этот процесс является следствием депрессии генома, сопровождающего неопластическую трансформацию [16, 24, 31]. Установлено, что ПЩФ обнаруживается в злокачественных опухолях гортани, пищевода, желудка, толстой кишки, печени, простаты, яичек и яичников. При этом ПЩФ является маркёром определённых клеток трофобласта, желточного мешка и зародышевых клеток, которые, при возникновении из них опухолевых линий, продуцируют значительные количества этого энзима, что может быть использовано в уточняющей диагностике, контроле лечения и мониторинге заболевания [4, 6, 10, 24, 25, 28].

X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

ОНКОМАРКЕРЫ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, РАКЕ ЯИЧНИКОВ И РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Актуальность темы. На сегодняшней день рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди онкологических заболеваний женщин (16% всех случаев рака). В России данный диагноз ставят около 55 тыс. женщин ежегодно. Рак яичников находится на третьем месте по распространению вида рака после рака шейки матки. В группе риска находятся женщины старше 50 лет. Из числа выявленных больных онкологическими заболеваниями на 1 и 2 стадии развития заболевания находятся около сорока пяти процентов женщин от общего числа, 3 стадия составляет примерно 18%, и 28% - 4 стадия. Раковая опухоль - это злокачественное новообразование, характеризующееся бесконечным делением клеток, способных инвазироваться в прилежащие ткани и метастазироваться в отдаленные органы. Для выявления и лечения болезни на ранних стадиях используются скрининг-тесты. Данные методы исследования помогают обнаружить рак до появления каких- либо симптомов. Так же к мероприятиям, способствующим выявлению заболевания относятся маммография, РАР-мазки (рак шейки матки), определение онкомаркеров.Онкомаркеры - это соединения (белковой, пептидной, гормональной, ферментативной структуры) синтезируемые раковыми клетками, или клетками нормальных тканей как ответная реакция на развитие рака. Они обнаруживаются в крови или моче больных раком и некоторыми другими заболеваниями, концентрация в сыворотке зависит от развития злокачественного процесса. Большая часть известных ОМ не являются идеальными, так как при некоторых патологических процессах, например при воспалительных заболеваниях печени, поджелудочной железы и лёгких, наблюдается незначительное повышение уровня маркёра; в некоторых случаях на ранних стадиях развития болезни его определение не происходит. Для раннего определения данного заболевания в клинике так же используются онкофетальные белки. Они находится в эмбриональных тканях человека и крови в период внутриутробного развития, а после рождения исчезают или остаются в незначительных количествах. Во время развития опухоли они начинают снова синтезироваться и поступать в кровь. Например, α-фетопротеин (α-ФП) нормальный сывороточный белок зародыша, синтезируется в печени, желточном мешке и ЖКТ и выделяется в кровь. Наиболее высокая концентрация белка наблюдается в ходе эмбриогенеза и внутриутробного развития плода. После рождения его концентрация снижается, и у взрослого человека составляет 20 нг/мл. Его повышение в крови наблюдается при развитии рака печени, поэтому его определение используют для диагностики и в дальнейшем для оценки эффективности лечения. Карциноэмбриональный антиген (КЭА) используется для диагностики рака прямой кишки и отслеживания состояния больного в постоперационном периоде. После полного и удачного удаления опухоли концентрация КЭА снижается. При последующем повышении данного показателя у оперированных больных указывает на рецидив болезни и высокую вероятность метастазов. Хорионический гонадотропин (хгч), плацентарная щелочная фосфатаза и некоторые другие плацентарные белки так же используются в качестве онкомаркеров. В норме данный гормон секретируется кровь при беременности и достигает максимальной концентрации к 12 неделе. Затем его содержание снижается и остаётся на очень низком уровне до и после родов. β-Хорионический гонадотропин (β-ХГТ) - плацентарный гормон состоящий из α- и β-субъединиц. При опухолях яичников концентрация гормона, а в некоторых случаях только его β-субъединицы, повышается. Так как С-концевой участок β-субъединицы ХГТ иммунореактивен, то иммуно-гисто-химическое обнаружение гормона служит хорошим онкомаркёром в диагностике и слежении за ходом лечения наследственных и спорадических опухолей. Измерение уровня β-ХГТ в спинномозговой жидкости помогает диагностировать метастазы в мозг и в ЦНС. [6][5]

Рак яичников (РЯ) Существуют три вида злокачественных опухолей яичников: герминогенные, стромальные и эпителиальные. Эпителиальные, в свою очередь, делятся на серозные, муцинозные и эндометриоидные. Онкомаркеры, используемые для диагностики рака яичников: CA125, остеопонтин, РЭА, растворимые пептиды семейства мезотелина (SMRP), секреторный белок эпидидимиса человека 4 (HE4), ингибин B, калликреины, продукты гена MUC1, тканевой полипептидный антиген (TPA), PAI-1, ХГЧ(β-ХГЧ), АФП. [1][5] СА125 используется в диагностических целях при наличии новообразований в полости малого таза у женщин. У около 80% женщин с эпителиальным раком яичника уровень СА125 увеличивается до 35 ед/мл и более, но на 1 стадии увеличение его концентрации встречается реже. Чаще используется HE4, который обладает более высокой чувствительностью и специфичностью. Уровень СА125 может оставаться в пределах нормы, тогда как концентрация НЕ4 превышает ее у большей половины пациентов. Высокая концентрация НЕ4 наблюдается при серозных (> 90%), эндометриоидных и светлоклеточных опухолях, а при муцинозных и герминогенных опухолях резкого изменения не наблюдается. Комплексный анализ CA125 и HE4 маркеров значительно увеличивает значимость исследования для постановки диагноза на ранних стадиях развития доброкачественных или злокачественных образований в области таза. CA125 используется во время первичного лечения как прогностический маркер, но при постоянном повышенном уровне его показатель не учитывается. При бессимптомном течении болезни, после первичной терапии и при повышенном содержании СА125 до инвазивного вмешательства необходимо его повторное исследование в сочетании с физикальным осмотром и ректовагинальным обследованием. Снижение его уровня от первичного значения до начала химиотерапии в 2 и более раз и сохранение его в течении 28 дней говорит о положительной реакции на лечение. Увеличение является предпосылкой к рецидиву, но содержание его в пределах нормы так же не исключает наличие заболевания. Ингибин В является более характерным онкомаркером, и лучше отражает эффективность химиотерапии при гранулёзоклеточной опухоли яичника. Так как в норме во время менопаузы его концентрация у женщин очень низкая, то его повышение является показателем наличия опухоли яичников. Остопонтин менее чувствителен, чем СА125, но он выявляется раньше при возникновении рецидива. Oнкомаркер-TPAcyk, повышение его содержания в крови наблюдается часто при серозных и муцинозных типах рака яичника 41-82% случаев и изменяется в зависимости от стадии заболевания. Значимым фактором прогнозирования заболевания пациентов с раком яичников является уровень PAI-1 и PAI-2. Уровень PAI-1 изменяется в зависимости от стадии и является показателем плохого прогноза, тогда как показатель PAI-2 - благоприятного. Увеличение ХГЧ происходит при различных опухолях, таких как рак, определение его используется как независимый фактор прогнозирования. [5][3]

Рак шейки матки (РШМ). Плоскоклеточный рак шейки матки встречается в 90% случаях от всех злокачественных заболеваний шейки матки. Для мониторинга хода заболевания, прогнозирования доклинического выявления рецидивов и оценки эффективности лечения используется антиген плоскоклеточного рака (SCCA), цитокертины и РЭА. SССА чувствителен на 80% для 3 и 4 стадиях, и менее чем на 50% - для 1 и 2. Концентрация изменяется в зависимости от стадии, глубины инфильтрации, размера опухоли и т.д. Высокой чувствительностью к РШМ обладают ТРS и СЕА. Комплексный анализ имеет большее преимущество, особенно при диагностике опухолевого процесса на ранних стадиях. У пациентов, получающих лучевую или химиотерапию, повышение SССА говорит о неэффективности лечения. Его высокий уровень до начала лечения обуславливает начало адъювантной терапии. В 90% случаев является показателем возможного рецидива, и опережает его клиническое проявление на 2-4 месяца. [4][2]

Рак молочной железы (РМЖ). Основными признаками рака молочной железы являются уплотнения, ретракция сосков, изменения формы железы, ретракция и местное утолщение кожи и т. д. Первичная терапия локализованных форм рака молочной железы включает в себя операции по сохранению органов и лучевую терапию или мастэктомию. Поскольку не всем пациентам с раком молочной железы может потребоваться дополнительное лечение (у 70% пациентов без метастазов в лимфатических узлах после операции и лучевой терапии отсутствуют признаки заболевания), и не у всех пациентов наблюдается положительный эффект адъювантной терапии. Контроль после первоначального лечения включает физикальный осмотр, маммографию, рентгенограмму грудной клетки и определение онкомаркеров uPA и PAI-1 являются строгими и независимыми (не зависит от состояния гормонального рецептора) прогностическими факторами при раке молочной железы. Комплексный анализ данных маркеров является более эффективным. Пациенты, у которых не затронуты лимфатические узлы, и uPA с PAI-1 на низком уровне, не нуждаются в токсической химиотерапии и имеют низкий риск рецидива. Для контроля эффективности лечения используют CA15-3. После начала химиотерапии в течение 6-12 дней может наблюдаться временное повышение уровня онкомаркеров. Повышение так же может указывать на развитие отдаленных метастазов без соответствующих симптомов (более, чем на 30%). Необходимо проводить исследование CA15-3 у пациентов с метастатическим раком молочной железы перед каждым курсом химиотерапии. РЭА является менее чувствительным маркером, чем CA15-3. Он используется при наблюдении за пациентами на поздних стадиях болезни, особенно при низком содержании CA15-3 до начала лечения. [4]

Скрининг большинства опухолевых маркеров может быть не информативен, поскольку: 1. Низкая распространенность злокачественных новообразований у бессимптомных лиц 2. Не значительного повышения у пациентов на ранних стадиях. 3. Диагностика рака большинство маркеров имеет низкую специфичность, прогноз маркеров коррелируют с опухолевой массой. 4. Уровень большинства маркеров не достаточен для раннего выявления рецидива, поэтому необходимо дальнейшее изучение и возможное определение новых онкомаркеров, которые бы позволяли выявить раковые заболевания на ранних стадиях развития с более точным эффектом.

1) ”Oxford Handbook of Oncology” Jim Cassidy Professor of Oncology, Institute of Medical Sciences, Aberdeen Donald Bissett Consultant Clinical Oncologist, Aberdeen Royal Infirmary, Aberdeen and Roy AJ Spence OBE Consultant Surgeon, Belfast City Hospital; Honorary Professor, Queen’s University, Belfast; Honorary Professor University of Ulster -2002 - p. 73-77

2) Frederick O. Stephens, Karl Reinhard Aigner, “Basics of Oncology” second edition -2015 - p.236-242

3) Bast, R.C., P. Ravdin, D.F. Hayes, and others. "2000 Update Recommendations for the Use of Tumor Markers in Breast and Colorectal Cancer." Journal of Clinical Oncology - no. 6 - 2001

4) Tumor Markers - National Cancer Institute(USA) - 2011.

6)Биохимия: Учебник для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2008. - с.739-747

2 Астраханское региональное общественное учреждение по содействию научным исследованиям (АРОУСНИ) «ГРАНТ», Астрахань, Россия

Плацентарную щелочную фосфатазу (ПЩФ) относят к белкам, ассоциированным с беременностью и опухолевым ростом. ПЩФ образуется в плаценте и фетальных тканях, в крови женщин выявляется с 3-4 недель беременности в количестве от 1,0 до 64ЕД, сохраняясь в кровотоке после родов в течение 10-14 дней. ПЩФ является маркёром герминогенных опухолей, обнаруживается в биологических жидкостях, эпителиальных клетках, фибробластах стромы и эндотелии новообразующихся сосудов опухолевой ткани при раке лёгкого и других органов, что следует учитывать при назначении лечения.

1. Башкаев И.С. Метод флуоресцирующих антител // Руководство по иммунологии. - М. : Медицина, 1973. - С. 330-341.

2. Беда Н.А. Плацентарная щелочная фосфатаза и острофазовые белки в иммунохимической оценке течения беременности и некоторой онкопатологии : дисс. . канд. мед. наук. - М., 2002. - С. 9-27.

4. Мацко Д.Е., Иванцов А.О. Патологическая анатомия герминогенных опухолей // Практическая онкология. - 2006. - Т. 7. - № 1. - С. 6-15.

5. Сухарев А.Е. Тканевые и сывороточные острофазовые белки в клинической оценке неспецифических заболеваний и рака легких : дисс. . докт. мед. наук. - М., 1992. - С. 89-119.

6. Сухарев А.Е. [и др.] Плацентарная щелочная фосфатаза и острофазовые белки в клинико-лабораторной оценке факторов повышенного геморрагического риска в акушерстве : монография. - Москва-Астрахань, 2006. - С. 44-67.

7. Сухарев А.Е. [и др.] Определение изоэнзимов плацентарной щелочной фосфатазы методом встречного иммуноэлектрофореза в сыворотках крови больных гепатобилиарной патологией // Лабор. дело. - 1987. - № 8. - С. 572-574.

8. De Broe M., Pollet D. Multicentr Evaluation of Human Placental Alkaline Phosphatase as a Possible Tumor-Associated Antigen in Serum // Clinical Chemistry. - 1988. - № 34. - P. 10-16.

9. Fishman W.H., Singer R.W. Ectopic Isoenzymes. Expression of Embryonic Genes in Neoplasia // Cancer-Comprehensive Treatise. - London, 1975. - Vol. 3. - № 5. - P. 57-80.

11. Millan J.L. Mammalian Alkaline Phosphatases: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. - 2006. - P. 187-205.

12. Stigbrand T., Millan J.L., Fishman W.H. The genetic basis of alkaline phosphatase isoenzyme expression // Isozymes current topics in biological and medical research. - New York, 1982. - Vol. 6. - P. 93-117.

13. Stinghen S.-T. et al. Specific immunoassays for placental alkaline phosphatase as a tumor marker // J-Biomed-Biotechnol. - 2006. - № 5. - P. 560-587.

14. Sukharev A.E. et al. Immunochemical study of placental alkaline phosphatase (PLAP), lactoferrin (LF) and C-reactiv protein (CRP) in blood serum of pregnant and parturient women // Biomarkers and environment. Cechtuma. - 2001. - Vol. 4. - № 1-2. - Р. 27.

15. Sukharev A. et al. The detection of placental alkaline phosphatase (PLAP) in embrionic and malignant tissues : The Third Intern. Conf. On Cancer-induced Bone Diseases, nov. 16-18, 2001, Awaji, Japan // J. of Bone and Mineral Metabolism. - 2001. - Vol. 19, suppl. - Р. 68.

16. De Voorde A. et al. Screening of sera and tumor extracts of cancer patients using monoclonal antibody directed againts human placental alkaline phosphatase // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. - 1985. - Vol. 21. - № 1. - P. 65-71.

Актуальность. Плацентарную щелочную фосфатазу (ПЩФ) относят к белкам, ассоциированным с беременностью и опухолевым ростом [9; 10]. ПЩФ поступает в кровоток матери после 12 недель беременности вплоть до периода родов в количестве от 1,0 до 100,0 Ед/л. Изоэнзимы ПЩФ обнаруживаются не только в плацентарном синцитиотрофобласте, эмбриональных и опухолевых тканях, но и в сыворотке крови здоровых мужчин и женщин в минорных количествах: от 0,1 до 1,6 мкг/л или 0,06-1,85 ЕД/л [2; 5; 8; 9; 11; 12; 13; 16]. Этот факт вызывает интерес к дальнейшей идентификации и изучению тканевых структур, продуцирующих ПЩФ.

Цель работы: исследовать содержание ПЩФ в некоторых тканях и сыворотке крови человека в онтогенезе и при патологии для определения её диагностического значения.

Объект исследования. Водно-солевые и бутаноловые экстракты, гистологические срезы плодовой, дефинитивной и патологически изменённой легочной ткани (159 образцов), плаценты (6), костей, печени, почек, желудка, кишечника головного мозга от 26 плодов 9-36 недель внутриутробного развития, 60 образцов бронхиального секрета (мокроты), 329 сывороток крови беременных, 26 - родильниц, 350 сывороток крови больных злокачественными новообразованиями, 390 - больных с хроническими воспалительными заболеваниями внутренних органов, 290 - здоровых доноров (160 женщин и 130 мужчин).

Методы исследования. В экстрактах и гистологических срезах ПЩФ определяли с помощью моноспецифической тест-системы, полученной в нашей лаборатории. Тест-антиген представлен раствором ПЩФ, выделенной из плаценты методом водно-солевой и бутаноловой экстракции на трис-глициновом буфере (рН 8,6) и очищенной по методу Lehman [10]. Тест-антисывороткой служила моноспецифическая антисыворотка к ПЩФ, полученная иммунизацией кроликов с последующей дополнительной абсорбцией дефинитивными тканями по общепринятой методике [5]. В экстрактах тканей и сыворотках крови ПЩФ выявляли методом встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ). Иммуноэлектрофореграммы отмывали в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия и обрабатывали смесью нафтол-AS-фосфат и прочный синий РР по Берстону [3]. Линии преципитации, образованные антисывороткой и ПЩФ, окрашиваются в интенсивный синий цвет. Чувствительность ВИЭФ для ПЩФ равна 1 ЕД Боданского [5]. В реакции иммунофлуоресценции на криостатных срезах тканей использовали эту же антисыворотку и ослиные антитела против иммуноглобулина кролика, меченные флуоресцином, производства НИИ вакцин и сывороток им. Н.Ф. Гамалея [1]. Статистическую обработку проводили с использованием критерия Стьюдента [5].

Результаты и обсуждение

Плацента. В связи с тем, что становление синтеза ПЩФ в плаценте хорошо описано в литературе, мы специально этот вопрос не исследовали. По данным авторов [5; 6; 7; 8], активность ЩФ отмечается в синцитиотрофобласте с 16 недель внутриутробного периода развития. Мы выявили, что ПЩФ методом встречного иммуноэлектрофореза определяется как в водно-солевых, так и бутаноловых экстрактах зрелой плаценты, причём наибольшее количество фермента экстрагируется бутанолом из её мембранных фрагментов, оставшихся после водно-солевой экстракции, соответственно, титры 1:512 и 1:2048. Гистохимическим методом высокая активность ПЩФ отмечается в эндотелии сосудов, синцитиотрофобласте плаценты.

Легочная ткань. ПЩФ начинает выявляться в водно-солевых экстрактах в фетальной лёгочной ткани с 26 недель внутриутробного развития плода в 72,7% случаев в количестве 4,2±1,8 ЕД. К моменту рождения частота обнаружения этого энзима снижается до 30% (1,4±0,4 ЕД), а в дефинитивной ткани лёгких ПЩФ не определяется (табл. 1). Определение ПЩФ в бутаноловых экстрактах фетальных органов позволило выявить небольшие количества этого антигена (1-2 ЕД) в печени, в почках, ЖКТ, лёгких. Отсутствие ПЩФ в сыворотках крови плодов и водно-солевых экстрактах других фетальных органов, кроме лёгких, исключают возможность попадания её из плаценты и делает допустимым предположение о синтезе её в плодовой лёгочной ткани и других органах [2; 5]. Иммуноморфологические исследования с антисывороткой к ПЩФ методом непрямой иммунофлюоресценции Кунса подтвердили наличие ПЩФ в клетках эмбрионального эпителия фетального лёгкого. Интенсивное свечение отмечается преимущественно в области наружных мембран клеток [5].

Костная ткань. Нами обнаружена высокая активность ЩФ гистохимическим методом в зоне активного новообразования костной ткани (зона роста, периостальный слой и эндотелий новообразующихся сосудов и гаверсовых каналов). Использование непрямого метода Кунса с моноспецифической антисывороткой к ПЩФ показало наличие ПЩФ плацентарного типа в указанных тканевых структурах [6].

Таким образом, с помощью различных методик (энзимоиммуноэлектрофорез, иммуноморфологический и иммуногистохимический методы) мы выявили наличие ЩФ плацентарного типа не только в ткани плаценты, но и в других эмбриональных тканях [6; 15].

ПЩФ не обнаруживается в лёгочной ткани при хронических неспецифических заболеваниях легких (ХНЗЛ) и у здоровых людей. В водно-солевых экстрактах малигнизированной легочной ткани ПЩФ выявляется в 61,5-70% образцов (табл. 1).

Таблица 1 - Обнаружение ПЩФ в водно-солевых экстрактах легочной ткани методом ВИЭФ

Раково-эмбриональный антиген РЭА

Научный редактор: М. Меркушева, ПСПбГМУ им. акад. Павлова, лечебное дело.
Март, 2019.

Синонимы: раково-эмбриональный антиген, РЭА, карциноэмбриональный антиген, Carcinoembryonic Antigen, CEA.

Раковый эмбриональный антиген (РЭА) - это протеиновый компонент крови, онкомаркер, который применяется в диагностике добро- и злокачественных процессов органов ЖКТ. Здоровый организм производит РЭА в минимальных количествах, но под воздействием неблагоприятных факторов (курение, неграмотный рацион и т. д.) его уровень может начать расти.

Анализ на РЭА позволяет своевременно выявить злокачественные процессы толстого кишечника и других органов (прямой кишки, желудка, легких, яичников, молочных желез).

Общие сведения

Раковый эмбриональный антиген был впервые выявлен в 1965 году у пациента с онкологией толстой кишки. Этот фермент белкового происхождения начинает производиться у плода с момента формирования органов ЖКТ (пищевод, желудок, печень, поджелудочная железа, кишечник). В это время концентрация вещества достигает своего предела. После появления ребенка на свет в плазме крови остается незначительный объем РЭА, который имеет тенденцию к снижению с возрастом. Вещество в остаточном количестве обнаруживается не только в крови, но также в тканях органов ЖКТ и легких, эпителии грудных желез, на слизистых поверхностях, в спинномозговой и асцитической жидкости. После рождения ген, который отвечает за производство эмбриональных антигенов, в норме должен деактивироваться.

Повышение уровня РЭА у взрослых отмечается при патологическом (чаще добро- или злокачественном) процессе, воспалении, аутоиммунных заболеваниях, а также при беременности (повышается к 3 триместру, но значения остаются в норме или длительном курении 1 .

На заметку: привычка курить приводит к завышению РЭА в крови, что свидетельствует о возрастании риска ракового заболевания. У здорового человека норма РЭА в крови составляет до 2,5 нг/мл крови, в то время как у курильщика он может достигать 5 нг/мл и более.

Полный отказ от курения всего за 3 месяца приводит к значительному улучшению показателей функции легких и снижению сывороточного РЭА 2 .

Анализ на РЭА позволяет на ранних этапах диагностировать злокачественные процессы следующих органов:

в первую очередь рака толстой и прямой кишки;
бронхи и легкие;
органы ЖКТ (в том числе поджелудочная железа);
органы малого таза (матка и придатки, предстательная железа);
грудные железы;
метастазы в печень;
метастазы в костная ткань.

Показания

Давать направление на анализ и давать расшифровку результатов исследования на онкомаркер РЭА может проводить онколог, хирург, функциональный диагност и компетентный терапевт.

В первую очередь, специалист назначает тест на РЭА в крови при наличии тревожных симптомов, свидетельствующих о развитии добро- или злокачественного процесса:

ощущение инородного тела в организме, визуальное определение опухоли и/или прощупывание при пальпации;
запоры, чувство неполного опорожнения кишечника, ректальное кровотечение;
тяжелый грудной кашель в течение длительного времени, одышка;
беспричинное повышение температуры тела, лихорадка;
потливость во время ночного отдыха;
нарушение пищеварения, отсутствие аппетита;
хроническая слабость и вялость, уменьшение силовых показателей, тонуса мышечной ткани;
резкое уменьшение массы тела без объективных причин;
быстрая потеря жидкости из организма;
гипертиреоз (гиперсекреция гормонов щитовидной железы);
увеличение количества родинок на теле за непродолжительный срок;
кровотечение неизвестного генеза;
длительное заживление ран на теле;
ноющие и тянущие боли без установленной причины.

Помимо указанных выше симптомов, анализ на РЭА назначают в следующих случаях:

определение вида, локализации, стадии злокачественного процесса, наличия метастаз;
выбор схемы консервативной терапии рака и оценка ее эффективности;
определение эффективности хирургического лечения опухоли (РЭА должен прийти в норму через 2 месяца после операции). Причем уровень РЭА часто высок на момент рецидива, даже если он был нормальным до удаления первоначальной опухоли, таким образом, тестирование РЭА должно проводиться регулярно в течение долгого времени после операции, независимо от того, присутствовали ли высокие уровни на момент первоначального диагноза.
стандартный анализ при подозрении на добро- или злокачественные процессы органов ЖКТ, особенно, прямой или толстой кишки;
при подозрении на опухоли молочной железы, легких, яичников, метастазирования опухоли в печень и кости;
плановый анализ для пациентов в динамике после завершения лечения онкологии.

Ежегодного исследование на концентрацию РЭА в крови проводят пациентам, которые находятся в группе риска по факторам:

наследственность (родственники первой линии имели онкологию внутренних органов);
работа на вредном производстве (риск отравления токсинами, радиоактивными компонентами, облучение);
проживание в неблагоприятном регионе с высоким уровнем радиоактивности, недалеко от промышленных предприятий;
злоупотребление солярием (искусственный загар повышает вероятность добро- и злокачественных процессов), солнечными ваннами;
пожилые пациенты после 60 лет с отягощенным анамнезом (злоупотребление алкоголем или сигаретами, наличие родственников второй и третьей линии с раком внутренних органов).

РЭА в норме

У младенцев в утробе матери показатель завышен и может некоторое время сохранятся таковым после рождения. Как правило, анализ проводят взрослым, где референсные значения будут отличаться для людей с никотиновой зависимостью и без.

для некурящих: 0 - 3,8 нг/мл;
для курящих: 0 - 5,5 нг/мл 3 .

В случае превышения допустимых значений (6,5 - 10 нг/мл) подозревается развитие доброкачественного процесса внутренних органов, однако не исключается начальная стадия онкологического заболевания. Если РЭА достиг 10 нг/мл и продолжает расти, то подключаются дополнительные исследования для диагностики онкологических процессов в организме. Как правило, при раковых опухолях раковый эмбриональный антиген может повышаться в несколько раз, а при наличии метастазирования показатель превышает норму в несколько десятков раз.

Повышение до 10 нг/мл

Повышение показателя до 10 нг/мл может указывать на следующие патологические процессы:

новообразования внутренних органов (невриномы, липомы, полипы, фибромы, кисты и т. д.);
язвенные процессы слизистой желудка и толстой кишки;
доброкачественные опухоли печени (гепатоцеллюлярная аденома, гемангиома) и заболевания (гепатит, цирроз, острая алкогольная или химическая интоксикация, гиперплазия по узелковому типу);
заболевания органов дыхания (пневмония, бронхит и другие); (гранулематозное воспаление ЖКТ);
эмфизема (патологическое расширение альвеол легких);
туберкулез;
воспаление органов ЖКТ, в том числе поджелудочной железы (панкреатит);
почечная недостаточность; (тяжелое поражение желез внешней секреции).
аутоиммунные заболевания;
курение

РЭА сильно повышен

При повышении концентрации РЭА более 10 нг/мл подозревают следующие злокачественные процессы:

рак прямой, ободочной или толстой кишки (РЭА больше увеличен при правостороннем поражении органа);
рак органов дыхания (легких, бронхов, плевры);
рак желудка (дополнительно назначают исследования на СА 19-9 и СА 72-4);
рак женских половых органов (матка и шейка, яичники), предстательной железы у мужчин;
онкология других внутренних органов (реже): молочных желез, пищевода, щитовидной железы (медуллярная карцинома), мочевого пузыря, печени и т. д.;
метастазы в костной ткани, печени.

Таблица: чувствительность РЭА к заболеваниям 4 :

Увеличение концентрации РЭА более 20 нг/мл до начала лечения указывает на метастазирование опухоли.

Уровень РЭА снижается

хирургическое удаление злокачественной опухоли.
успешная терапия онкологического заболевания.

Подготовка к анализу

Биоматериал для исследования: сыворотка венозной крови.

Метод забора биоматериала: венепункция локтевой вены.

Обязательные условия: венепункция проводится строго натощак в утренние часы (с 8.00 до 12.00).

Также перед проведением теста на РЭА пациент должен поставить врача в известность по поводу текущих схем лечения, при этом необходимо указать дозировку и названия препаратов, кратность и продолжительность их приема.

1. Ercan S., Kaymaz O. Serum concentrations of CA 125, CA 15-3, CA 19-9 and CEA in normal pregnancy: a longitudinal study. - Archives of ginecology and obstetrics, 2012.
2. Pezzuto A., Spoto C. Short-term effectiveness of smoking-cessation treatment on respiratory function and CEA level. - Journal of comparative effectiveness research, 2013.
3. Данные лаборатории Helix.
4. А.А.Кишкун, д.м.н., проф. Руководство по лабораторным методам диагностики, - ГЭОТАР-Медиа, 2007г.

Читайте также: