Перспективы изучения транспорта белков в клетке
Обновлено: 09.05.2024
Нейродегенерация может проходить быстрее, если в нервных клетках не хватает белков-ретромеров, которые отвечают за расщепление токсичного тау-белка. К такому выводу пришли ученые, наблюдавшие за генно-модифицированными дрозофилами, которые производили человеческий тау-белок в 39 нейронах глаза. Сам по себе тау-белок уже вызвал гибель нервных клеток, а дефицит ретромеров ее только усилил — что, возможно, происходит и у людей, когда развивается болезнь Альцгеймера. Исследование опубликовано в журнале Nature Communications.
Многие нейродегенеративные расстройства вызваны токсичной формой белков. Они накапливаются в нейронах и между ними в виде нерастворимых клубков и нарушают транспорт веществ и передачу сигналов. Например, при болезнях Паркинсона и Альцгеймера в клубки собирается тау-белок. В норме — это часть цитоскелета нейрона, но при избыточном фосфорилировании он становится токсичным для клеток.
Мутации в гене, кодирующем тау-белок, связывают с повышенным риском развития нейродегенеративных болезней. Однако к накоплению агрегатов может привести не только поломка самого белка, но и нарушение работы путей, которые отвечают за расщепление и деградацию белковых клубков. Ретромерный комплекс — один из таких путей. В здоровых клетках он отвечает за транспорт белковых молекул и рецепторов через эндосомы в сеть аппарата Гольджи и обратно на клеточную поверхность. Мутации в белках этого комплекса связаны с болезнью Паркинсона, а дефекты его активности отвечают за развитие болезни Альцгеймера. Но до сих пор было неясно, как именно эти мутации участвуют в развитии нейродегенерации.
Команда ученых из Федеральной политехнической школы Лозанны во главе с Брайаном Маккейбом (Brian D. McCabe) попыталась ответить на этот вопрос и для этого воспроизвела человеческий механизм нейродегенерации у дрозофил. Сперва авторы работы создали линию мух, которые экспрессировали человеческий тау-белок во взрослом состоянии. Продолжительность жизни контрольных и экспериментальных особей оказалась разной. Экспрессия тау-белка уменьшила продолжительность жизни трансгенных дрозофил на 40,5 процента (p < 0.001) относительно контрольной линии насекомых.
Чтобы понять, какие изменения в нервной ткани привели к высокой смертности, ученые создали еще одну модель трансгенных насекомых. Известно, что высокий уровень тау-белка приводит к дегенерации аксонов, но трудно проследить этот процесс в эксперименте из-за того, что белок производят сразу множество нейронов мозга. Поэтому исследователи запустили экспрессию только в одной области глаза дрозофилы — дорсальном кластере (ДК), в котором всего 39 нейронов.
Тогда исследователи проверили, как на нейродегенерацию влияет работа ретромерного комплекса. Они заблокировали производство отдельных его белков (белков Vps) с помощью РНК-интерференции — и заметили, что нарушения в развитии глаза были выражены еще сильнее, чем у насекомых с экспрессией тау-белка, на 20-40 процентов. Также авторы обнаружили, что после блокировки ретромерного комплекса у мух снижается продолжительность жизни и сокращается количество аксонов в нейронах.
Наконец, исследователи задались вопросом, почему ингибирование ретромера делает тау-белок более токсичным. Они измерили уровень фосфорилирования, который отвечает за токсичность тау-белка, и выяснили, что работа ретромерного комплекса на него не влияет. Однако из-за активности ферментов-каспаз в клетке накапливались укороченные формы белка, которые считаются более токсичными. Ученые проследили их локализацию в клетке и заметили, что короткие формы тау скапливаются в поздних эндосомах — внутриклеточных пузырьках, которые перемещают ненужные клетке белки в лизосому, где они будут разрушены. Исследователи предположили, что накопление происходит именно из-за отсутствия ретромеров, поскольку они показали, что эти белки взаимодействует с белками эндосом и помогают ее работе.
В результате ученые предложили свою модель токсичности тау-белка. При нарушении работы ретромеров движение токсичного тау-белка к лизосоме сильно затягивается. Замедление происходит из-за его накопления в эндосомах. При этом каспазы, которые находятся в эндосомальных пузырьках, дольше действуют на тау-белок и превращают его в короткий и более токсичный. Избыток этой формы тау-белка нарушает стабильность нейронов и, в конечном счете, ведет к гибели животного.
Таким образом, авторы работы продвинулись еще на один шаг в попытках восстановить полный механизм нейродегенерации. Они рассчитывают, что созданная ими модель дрозофил поможет выяснить больше подробностей о том, как и почему гибнут нейроны, а дальнейшие исследования в этой области помогут определять предрасположенность человека к нейродегенеративным болезням.
Мы уже писали о предыдущих открытиях в области механизма нейродегенерации. Мы рассказывали о том, как нейрофизиологи связали накопление бета-амилоида с уровнем холестерина, а также испытали вакцину против тау-белка.
Как диффузия наводит порядок в клетке
Обзор
Молекулы расходятся в стороны спиралями, следуя за другими молекулами. В статье мы расскажем, как элементарные физические явления организуют главные в жизни клетки процессы.
Авторы
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Обычно диффузия разрушает порядок: рассеивает запахи в воздухе и даже засаливает огурцы. Однако клетка устроена так сложно, что внутри нее диффузия, наоборот, расставляет всё по местам. Так она помогает клетке выживать и размножаться. Каким образом? Для поиска ответа мы погрузились в биофизику молекул, которые упорядочивают диффузию. При этом разные молекулы дают разный результат. В первой части статьи диффузия организует транспорт веществ. Во второй — управляет ядром яйцеклетки. Но в обоих случаях работает по одному сценарию.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2021/2022
Эта работа опубликована в номинации «Биофизика» конкурса «Био/Мол/Текст»-2021/2022.
Партнер номинации — компания «БиоЛайн».
Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.
Генеральный партнер конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
А вы точно компания грузоперевозок?
Сколько же в клетке имеется разнообразного транспорта молекул. Часто им заняты белки: они переносят грузы через клетку на себе, пропускают молекулы через мембраны [2]. В общем, обычно белки-транспортеры прямо взаимодействуют с грузами. Поэтому мы расскажем о других белках. Они переносят грузы новым для биологов способом. В первой части статьи вы узнаете, что на самом деле действуют эти белки просто и, возможно, самым архаичным способом.
Самый новый и самый непонятный вид транспорта
Нестандартная транспортная система состоит из двух белков, MinE и MinD, и называется MinDE. Когда белки соединяются друг с другом на мембране, то начинают перемещаться по ней (рис. 1а и б). Для движения они расщепляют АТФ: в химических связях этой молекулы запасено много энергии. Поскольку MinDE используют энергию, их движение можно назвать активным транспортом.
В одиночку MinDE движется по мембране в случайном направлении. Но когда белков много, они объединяются в волны, которые движутся синхронно. Однако бесконечное движение волн белков по одному же кругу на длинной выдержке выглядит как диффузия. Ведь оно не меняет постоянный состав мембраны. Этим поведение системы MinDE похоже на диффузию. Поэтому движение белков MinDE можно назвать активной диффузией [3].
Система MinDE перемещает грузы по мембране клетки и управляет делением: задает ось, по которой разделится бактерия и разорвутся хромосомы [4]. Но в статье мы изучим только транспорт грузов по мембране. Он, скажем честно, странный, так что давайте разбираться
Невозможное наблюдение
В 2018 году [1] ученые выяснили, что система MinDE перемещает молекулы по мембране, но каким-то неизвестным способом. Давайте рассмотрим схему эксперимента — так мы поймем, что удивило авторов статьи.
Исследователи использовали белок стрептавидин в качестве груза для MinDE. Для эксперимента подготовили мембрану из липидов, сшитых с биотином — молекулой, которая сильно связывается со стрептавидином. Это заякоривало стрептавидин на мембране так, что перемещать его могла лишь какая-то постоянная сила.
Когда исследователи добавили к стрептавидину MinD, MinE и АТФ, то увидели, что движение MinDE переносит стрептавидин по мембране. Это поняли по свечению флуоресцентных меток, привязанных к белкам. Белки флуоресцировали разными цветами: MinD — зеленым, стрептавидин — синим. Исследователи увидели движение разных цветов, которое начиналось после сборки MinDE. Это доказывало, что MinDE переносит стрептавидин.
Однако MinDE не мог переносить стрептавидин: по ходу движения они разделялись. Зеленые и синие цвета отделялись друг от друга и собирались в одноцветные полосы (рис. 1б, г). Полосы разных цветов двигались вместе, хотя MinDE внутри зеленых полос не мог переносить на себе груз, который был внутри другой, синей, полосы. При этом сам по себе стрептавидин перемещаться тоже не может. Значит, MinDE как-то управляет движением стрептавидина, не касаясь его.
Рисунок 1. Работа системы MinDE и эксперименты с ней. Белок MinD обозначен зеленым цветом, MinE — рыжим, стрептавидин — синим. а — Белки MinD и MinE объединяются в движутся только вместе, используя для движения энергию АТФ. б — Движение MinDE и стрептавидина. Белки MinDE активно движутся по мембране и объединяются в волны. Стрептавидин цепляется за голубые остатки биотина, связанные с липидами. в — Схема эксперимента. В лунке закреплена мембрана, по которой перемещаются белки. К белкам прикреплены флуоресцентные метки, по которым наблюдают за распределением молекул на мембране. г — Как меняется флуоресценция MinDE и стрептавидина вдоль мембраны. Флуоресценция MinDE растет с ослаблением флуоресценции стрептавидина, и наоборот. Значит, чем больше на участке мембраны MinDE, тем меньше стрептавидина, и наоборот.
Подтверждение на новых грузах: это работает так же.
После стрептавидина исследователи проверили наблюдения на другом мембранном белке mCh-MTS. Его собрали из MTS (белок из системы MinD Bacillus subtilis) и флуоресцентного белка mCherry. mCh-MTS связан с мембраной непрочно и хаотично двигается без дополнительных сил. Но MinDE разделялся с ним на полосы так же, как со стрептавидином.
Рисунок 2. Движение белков по мембране: что происходит и как это выглядит. MinDE с mCh-MTS и стрептавидином по ходу движения по мембране разделяются на разные волны. Это регистрируется по изменению флуоресценции (на графике) и видно на фотографиях (справа).
Невероятное объяснила физика жидкостей
За три года физики нашли силу, которая отделяет грузы от транспортеров, и доказали свою гипотезу. Для этого они дополнительно изучили процесс.
Исследователи присоединяли к стрептавидину сверху ДНК-оригами — фигурки из нуклеиновых кислот. Их использовали, чтобы объединять много молекул стрептавидина в одну группу — под общей крышей из ДНК-оригами. Такие кучки из стрептавидина отличались от единичных молекул только большим размером. Было важно проверить, зависит ли от него движущая сила.
Оказалось, что большие грузы движутся быстрее маленьких. В эксперименте cargo-42 — ДНК-оригами, связавшая 42 стрептавидина — перемещалась дальше, чем cargo-2 за то же время. Cargo-42 разделялась на волны с MinDE более резко, чем маленькие группы стрептавидина (рис. 3а, 3б). Это означало, что белки MinDE на самом деле движут грузами.
Рисунок 3а. Закономерность: чем больше MinD, тем меньше в этой точке мембраны грузов Cargo. Горизонтальная шкала — распределение белков вдоль мембраны. Вертикальная — кучность молекул одного типа на соответствующем участке. Фиолетовые и голубые линии — расположение грузов на мембране, сигнал от них слабеет из-за MinDE. FH (теория Флори — Хаггинса) — как вышло, если бы грузы двигались хаотично, без участия MinDE; MS — усредненная реальная тенденция. Зеленым цветом показано увеличение количества MinD.
Рисунок 3б. Данные флуориметра: распределение грузов Cargo зависит от количества MinD. Судя по изменениям флуоресценции, Cargo много там, где мало MinDE, и наоборот. FH (теория Флори — Хаггинса) — как вышло, если бы грузы двигались хаотично, без участия MinDE; MS — усредненная реальная тенденция.
Чем больше груз, тем чаще он встречается с движущимися белками. Раз большой объект и двигается быстрее маленьких, значит, MinDE создает движущую силу. Это наблюдение подтвердило версию физиков.
Объяснение
Чтобы понять физику транспорта MinDE, представим реку. Когда поток воды в ней захватывает плот, то несет его с собой. Поток MinDE движет грузами схожим образом.
Активное движение волн MinDE толкает молекулы грузов — так между ними возникает жидкостное трение. За счет этого трения поток белков уносит грузы. Оно же одновременно отделяет грузы от волн белков. MinDE выталкивает грузы в пространство между своими волнами (рис. 4). Когда груз находится внутри волны MinDE, то его толкает много белков, и он движется быстрее грузов, которые отделены от волн MinDE. Так груз изнутри волны «догоняет» волну других грузов. Дальше он движется вместе с волной, потому что всех теперь толкают одинаково. Как результат, белки и грузы разделяются. И в экспериментах их волны выглядят как движущиеся полосы разного цвета.
Волнами белков и грузов движет активная диффузия MinDE, поэтому явление назвали диффузиофорезом. Такой диффузиофорез — сумма двух параллельных процессов: отделение грузов от белков-транспортеров и их общее движение. Исследователи рассматривали альтернативные гипотезы, но ни одна не объясняла особенностей транспорта MinDE (подробнее на рис. 5).
Рисунок 4. Диффузиофорез: как молекулы разделяются на волны. Квадрат сверху — как выглядит флуоресценция на мембране. Схема внизу — что происходит на уровне молекул. ДНК-оригами заякорены в мембране с помощью стрептавидина. MinDE создают поток, который толкает грузы (связанные через ДНК-оригами стрептавидины) с помощью трения. Грузы собираются в области, где MinDE мало. В итоге на мембране появляются две цветные области, состоящие из MinDE и грузов.
Рисунок 5. Сравнение диффузиофореза с альтернативными версиями. Зеленые кружки — белки системы Min, синие круги — грузы. За счет чего они собираются в волны? Притяжение между грузами и статические препятствия смещали бы грузы в область высоких концентраций MinD. Энтропия без дополнительных сил всё бы смешала. А в ходе диффузиофореза трение между молекулами сдвигает грузы с места и отделяет их от волн MinDE.
Чем полезен диффузиофорез
Белковая система MinDE пригодится в лабораторной практике. Управляемые белки легко распределят по мембране практически любые молекулы так, как нужно исследователю. Например, если кто-то исследует, как вещество связывается с поверхностью клетки, и нужно поместить его на конкретный участок мембраны. Транспортная система MinDE сыграет роль курьера.
По словам одного из авторов исследования, диффузиофорез настолько прост, что, возможно, стоял у истоков клеточных форм жизни [6]. Тогда не было арсенала биомолекул, между которыми распределены все процессы — физика определяла куда больше вещей, чем сейчас. Что, если диффузиофорез поможет узнать больше о наших самых древних предках?
Загадка ядра
Ядро клетки хранит генетический материал и контролирует работу с ним, поэтому от положения ядра в клетке зависят все важные процессы. Например, движение ядра определяет перемещения клетки, если она мигрирует. Когда один из белков, которые перемещают ядро, ломается, предшественники нейронов в формирующемся мозге эмбриона мигрируют с нарушениями. Структура мозгового вещества изменяется, извилины не формируются, и ребенок рождается с умственной отсталостью. Управляют движениями ядра цитоскелет и специальные белки. В клетках животных положение ядра связано с центриолями, и оно удерживается в центре клетки [3].
Цитоскелет — сеть белков внутри эукариотической клетки, которые управляют ее формой, служат путеводным тропами для транспорта и выполняют другую работу. Один из белков цитоскелета — тубулин — собирается в микротрубочки. Это транспортные магистрали и структуры, которые перестраиваются во время деления и разводят хромосомы. Они начинаются от центриолей — коротких трубок побольше — которые обычно лежат рядом с ядром в центре клетки.
Мышиные ооциты, предшественники яйцеклеток, оплодотворяются и делятся реже, когда их ядро уходит из центра клетки [7]. Для ооцитов человека центральное положение ядра также важно [8]. Однако в ооцитах нет центриолей, они исчезают в процессе созревания.
Хоть способа удержать ядро в центре нет, в здоровых ооцитах что-то толкает его к центру. Во второй части статьи мы расскажем об этой силе и о том, почему ядро в центре ооцита так важно.
Центрирование ядра: случайное совпадение
Здоровый ооцит мыши — клетка идеально сферической формы. Форму клеток задает сеть из нитей белка актина, которая лежит под поверхностью клетки (рис. 7). Нити актина постоянно перестраиваются — их собирают специальные белки формины. В процессе формины перемещаются по нитям актина, как по автобанам (подробнее на рис. 6). Движение пузырьков с актином хаотично, но именно оно управляет положением ядра в ооците.
Рисунок 6. Работа актина и форминов в клетке. а — В мигрирующей клетке. Формины собирают нити актина. Нити актина выпячивают мембрану в виде филлоподий и ламеллоподий, собираются в стрессовые волокна. Эти выступы разной формы участвуют в перемещениях клетки и других процессах. б — Сборка нити актина. Скорость некоторых форминов выше двух мкм/сек. в — В связке с другими белками и органеллами. Формины собирают нити актина, связанные с плотными контактами, и участвуют в движениях органелл. г — В делящихся клетках дрожжей. Актин опосредует межклеточный транспорт и участвует в разделении клеток.
Рисунок 7. Красная сеть нитей актина по краям клетки задает ее форму. Нити актина помечены красным флуоресцентным белком; гистоны — белки, организующие ДНК в ядре — зеленым.
Рисунок 8. Более активные пузырьки актина на периферии ооцита толкают ядро к центру.
Когда ядро попадает на периферию клетки, то сталкивается там с движением пузырьков актина. Поскольку с внешней части клетки актиновых пузырьков больше и со внутренней меньше, ядро толкают в центр. Суммарно движение создает градиент давления, который смещает ядро в центр ооцита и удерживает там (рис. 7) [10].
Направление движения актинового пузырька по одной нити случайно. В целом его можно назвать хаотичным, то есть активной диффузией. Но сеть актина неоднородна (рис. 6). Поскольку сеть актина плотная по краям клетки, больше всего пузырьков движется там [10].
Воздействие градиента давления подтверждают эксперименты с мышами Fmn2 -/- , у которых нарушена работа формина 2. В их ооцитах актин не собирается в нити, пузырьки с актином не создают градиент давления — и ядро остается на периферии. Зато после инъекции формина 2 за 30 мин. собиралась актиновая сеть и за несколько часов ядро перемещалось в центр ооцита (рис. 9) [10].
Рисунок 9. Без формина 2 сеть актина разрушается, и ядро уходит из центра.
Примечательно, что градиент давления актиновых пузырьков — это не специфический механизм для центрирования ядра. Исследователи вводили в ооциты капли масла, сопоставимые по размеру с ядром. В итоге, капли масла перемещались к центру точно так же, как ядро [11]. Так что давление пузырьков актина толкает любой объект. Но для работы ядра оно важно по-особенному.
Зачем ядру быть в центре внимания
Положение ядра в центре связано с формой его оболочки. Когда ядро в центре, с оболочкой все в порядке, потому что пузырьки с актином толкают его со всех сторон одинаково. Взаимодействия оболочки ядра с ДНК регулируют ее работу, и неполадки в оболочке могут нарушить работу с наследственным материалом (рис. 10а, 10б). Это может помешать перепрограммированию ооцита в момент, когда он будет готовиться к делениям после оплодотворения.
В отсутствие сети актина и движения пузырьков по ней форма ядра меняется. На оболочку ядра актин больше не давит, и она деформируется: в ней появляются провалы, инвагинации (рис. 10б). Исследователи этой проблемы показали, что без давления сети актина на оболочку ядра подавляется работа более 200 генов. Среди них ген самого формина 2, белки разных сигнальных путей, активаторы нормального развития зиготы и ее деления [12].
Рисунок 10а. Давление на оболочку ядра поддерживает работу генов.
Рисунок 10б. В отсутствие формина 2 ядро деформируется.
Для чего важно центрирование ядра
По крайней мере, на сотнях ооцитах мышей и человека проверено, что ооциты с ядром центре чаще готовы к оплодотворению и делятся успешнее ооцитов с нарушенным положением ядра [7], [8]. Возможно, репродуктологам стоит обращать внимание на положение ядра в ооците при отборе ооцитов для искусственного оплодотворения.
Заключение
В конце статьи мы неожиданно приходим к тому, что активная диффузия незаметно управляет двумя разными процессами. Она настолько же универсальна, насколько проста. При этом может влиять на важные события в жизни клетки и готова помогать биологам и медикам. Физика управляет даже биомолекулами и всегда готова напомнить о себе.
Новая микроскопия позволила увидеть движение белков в живой клетке
Группа физиков и биологов из США и Китая, в соавторстве с Нобелевским лауреатом Эриком Бетцигом, разработала новый вид оптической микроскопии, превышающей предел дифракции. Новая техника позволяет без вреда для клетки получать видеоролики движения белков в ней, успевая получать несколько кадров за одну секунду. Изображение, полученное новым методом, было использовано при оформлении обложки Science, статья, посвященная микроскопии, опубликована в сегодняшнем выпуске журнала.
Авторы модифицировали метод микроскопии, использующий структурированное освещение — SIM. В оригинальном методе для освещения образца используется интерференционная картина, создаваемая с помощью лазерного луча и дифракционной решетки. Внутри образца при этом находятся различные флуорофоры, которые способны светиться под действием излучения. В результате наложения и обработки снимков, сделанных при различных углах поворота решетки и смещениях, исследователи получают изображение с разрешением до 100 нанометров — вдвое лучше дифракционного предела. Ключевым здесь является анализ муара в «полосатых» фотографиях.
В новой работе исследователи улучшили метод благодаря двум независимым нововведениям. Во-первых, благодаря использованию объектива с ультрабольшой числовой апертурой — это позволило добиться разрешения в 84 нанометра и скорости съемки два кадра в секунду. Во-вторых — используя нелинейную зависимость интенсивности свечения люминофора от интенсивности падающего на него излучения. С помощью фотопереключаемого зеленого белка FP Skylan-NS авторы добились разрешения деталей размером 45 нанометров. Для сравнения, диаметр микротрубочек, являющихся частью цитоскелета клетки, составляет 25 нанометров.
Используя новый метод, авторы работы смогли пронаблюдать поведение различных белков вблизи плазматической мембраны, а также динамику a-актинина, актина и аппарата Гольджи в объеме.
Ключевым преимуществом разработанного метода является невысокая интенсивность лазерного излучения, необходимая для освещения образца. По словам Эрика Бетцига, во многих методах клетки получают слишком большие количества света. «Это повреждает клетки, убивает их, а в худшем случае и вовсе испаряет» — говорит Бетциг. Новый подход, по сравнению с RESOLFT требует почти в миллион раз меньшей интенсивности излучения.
Микроскопией сверхвысокого разрешения называется несколько методов, способных различить объекты размером менее половины длины волны видимого спектра. Такое разделение возникает из понятия дифракционного предела — минимального размера светового пятна, которое можно получить фокусированием электромагнитного излучения.
Протеомика: зачем изучать белки и как это делать
Кофактор — небелковое соединение, часто ион металла, которое нужно ферменту для осуществления биологической функции. Кофакторы часто называют молекулами-помощниками, которые участвуют в биохимических превращениях.
Интрон —участок ДНК, копия которого удаляется из первичного транскрипта и отсутствует в зрелой матричной РНК. Интроны встречаются только в генах эукариот.
Антитела — гликопротеины, находящиеся на поверхности B-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и в плазме крови, образующиеся в ответ на введение в организм человека или теплокровных животных бактерий, вирусов, белковых токсинов и других антигенов. Связываясь своими активными участками с бактериями или вирусами, антитела препятствуют их размножению или нейтрализуют выделяемые ими токсические вещества.
Внутриклеточная сортировка макромолекул и сохранение клеточных компартментов
Транспорт белков в митохондрии и хлоропласти
Те сравнительно немногие белки, которые кодируются собственными геномами этих органелл, расположены в основном во внутренней мембране в митохондриях и в тилакоидной мембране в хлоропластах. Полипептиды, кодируемые геномами этих органелл, обычно образуют субъединицы белковых комплексов, другие компоненты которых кодируются ядерными генами и поступают из цитозоля. Образование таких гибридных белковых агрегатов требует сбалансированности синтеза этих двух типов субъединиц; каким образом координируется синтез белка на рибосомах разных типов, разделенных двумя мембранами, остается загадкой.
8.4.1. Митохондриальные сигнальные пептиды представляют собой амфипатические аминокислотные последовательности [21]
В изучении биогенеза митохондрий оказалось чрезвычайно полезным использование в качестве объекта дрожжей. В их клетки можно эффективно вводить гибридные гены, кодирующие «смешанные» белки (полученные с помощью методов рекомбинантных ДНК). О механизмах переноса веществ в митохондрии известно гораздо больше, чем о механизмах переноса в хлоропласты. Скорее всего, эти механизмы идентичны, хотя хлоропласты и содержат еще один, самый внутренний мембранный компартмент - тилакоид.
Считается, что внешняя мембрана митохондрий содержит белки-рецепторы, связывающие митохондриальные сигнальные пептиды и тем самым помогающие процессу переноса, однако до сих пор эти гипотетические рецепторы не были как следует охарактеризованы.
8.4.2. Перенос веществ в митохондриальный матрикс зависит как от электрохимического градиента на внутренней мембране, так и от гидролиза АТР [22]
Практически все сведения о молекулярном механизме переноса белков внутрь митохондрии были получены при анализе бесклеточных транспортных систем. Суть экспериментов заключается в следующем. Вначале из гомогенизированных клеток методом дифференциального центрифугирования выделяют митохондрии, а затем инкубируют их с радиоактивно меченными белками, предназначенными для этих органелл (митохондриальные белки-предшественники). Очищенные белки-предшественники очень быстро и эффективно включаются в такие митохондрии.
Все формы направленного движения и транспорта нуждаются в энергии. В большинстве случаев эта энергия используется в форме АТР. Однако для переноса белков в митохондрии требуется еще наличие электрохимического градиента на внутренней митохондриальной мембране. Этот градиент образуется в процессе транспорта электронов по мере того, как протоны откачиваются из матрикса в межмембранное пространство (см. разд. 7.1.7). Внешняя митохондриальная мембрана свободно проницаема для ионов, поэтому на ней не поддерживается никакой градиент. Электрохимический градиент на внутренней мембране используется как аккумулятор энергии для осуществления большей части синтеза АТР в клетке. Кроме того, энергия градиента расходуется для переноса внутрь митохондрии белков, несущих положительно заряженные митохондриальные сигнальные пептиды. Если добавить ионо-форы, сбрасывающие митохондриальный мембранный потенциал (см. разд. 7.2.10), этот перенос блокируется. Каким образом электрохимический градиент способствует переносу белков? Ответ на этот вопрос пока не получен.
8.4.3. Митохондриальные белки проникают в матрикс в зонах слипания, связывающих две мембраны [23]
Пересекает ли белок на пути к митохондриальному матриксу две мембраны поочередно, или он проникает через обе мембраны сразу? Чтобы ответить на этот вопрос, можно охладить бесклеточную систему до температуры льда, задержав таким образом белки на промежуточной стадии переноса. Оказалось, что их N-концы находятся при этом в матриксе (они могут быть удалены протеазой матрикса), а остальная часть молекул расположена вне митохондрии (поскольку чувствительна к добавленным извне протеолитическим ферментам). Этот результат показывает, что белок-предшественник, когда проникает в матрикс, проходит через обе митохондриальные мембраны сразу. Специалисты по электронной микроскопии заметили многочисленные зоны слипания, в которых, внешняя и внутренняя митохондриальные мембраны сливаются, и предположили, что это именно те участки, через которые происходит перенос белков в матрикс. Недавно эти точки контакта были идентифицированы биохимически (по их связыванию с частично перенесенными внутрь митохондрии белками-предшественниками) и очищены.
8.4.4. Когда белки проникают в митохондриальный матрикс, они разворачиваются [24]
По всей вероятности, белки-предшественники разворачиваются перед тем, как пересечь две митохондриальные мембраны в точке контакта. Трудно представить себе, что свернутый водорастворимый белок мог бы «протаранить» два (или даже один) липидных бислоя, оставаясь в своей нативной трехмерной конформации. Точно также невозможно вообразить, что пора могла бы пропускать глобулярные белки, которые сильно варьируют по размерам и форме. Ведь при этом она становилась бы проницаемой для протонов, и в результате электрохимический градиент на внутренней мембране исчезал бы. Между тем, в развернутом состоянии все белки имеют сходную конформацию и могут быть перенесены с помощью общего механизма. Но поскольку белки в свернутом состоянии обладают меньшей свободной энергией, чем в развернутом (по этой причине полипептиды спонтанно сворачиваются), разворачивание молекулы белка требует затрат энергии. Предполагается, что эту энергию обеспечивает гидролиз АТР.
Чтобы проверить, разворачиваются ли белки-предшественники, когда они пересекают митохондриальную мембрану, был сконструирован гибридный ген, кодирующий «смешанный» белок. В этом как бы состыкованном белке митохондриальный сигнальный пептид присоединен к N- концу цитоплазматического фермента-дигидрофолатредуктазы (ДГФР). Такой гибридный белок обладал почти ненарушенной ферментативной активностью, а значит ДГФР была в нативной трехмерной конформации. При смешивании с препаратом митохондрий этот белок поступал в матрикс. Однако если его предварительно обрабатывали метатрексатом, который прочно связывается с активным центром фермента и мешает разворачиванию его молекулы, то перенос резко подавлялся. Генетические эксперименты на дрожжах подтверждают, что для АТР-зависимой реакции разворачивания белков необходимы некоторые гены семейства hsp 70. Если эти гены инактивировать, то и митохондриальные белки-предшественники, и белки, предназначенные для ЭР, не могут пересечь соответствующие мембраны и вместо этого накапливаются в цитозоле.
8.4.5. Для транспорта белков в межмембранное пространство митохондрий необходимы два сигнала [25]
8.4.6. Для переноса белков из цитозоля во внешнюю митохондриальную мембрану также необходимо их разворачивание [26]
Во внешней мембране митохондрий имеется одна необычная структура (она напоминает внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий), липидный слой которой содержит большие количества образующего поры белка-порина. По этой причине внешняя мембрана свободно проницаема для неорганических ионов и метаболитов и для молекул белков размером меньше 10 кДа. Но для больших по размеру белков внешняя мембрана является барьером и поэтому помогает удержать белки межмембранного пространства от утечки обратно в цитозоль.
Включение во внешнюю мембрану белков, кодируемых основным клеточным геномом - таких, как порин, - происходит по АТР- зависимому механизму, но не требует использования специальных пептидов, которые бы потом отрезались. Мембранный потенциал тоже не требуется. О том, как происходит подобное включение, известно очень мало. По крайней мере у одного белка внешней мембраны имеется нормальный матриксный транспортный сигнал, за которым следует последовательность, каким-то образом прерывающая перенос на внешней мембране.
8.4.7. Для того, чтобы направлять белки в тилакоидную мембрану хлоропластов, необходимы два сигнальных пептида [27]
Транспорт белков в хлоропласти во многих отношениях напоминает транспорт в митохондрии: и тот, и другой процесс происходят после трансляции, и тот, и другой нуждаются в энергии, и в том, и в другом случае используются гидрофильные N-концевые сигнальные пептиды, которые затем удаляются. Однако имеется по крайней мере одно важное отличие: в митохондриях для проведения этого транспорта используется еще электрохимический градиент на их внутренней мембране. В хлоропластах же, где электрохимический градиент имеется не на внутренней мембране, а на мембране тилакоида (см. гл. 7), по-видимому, для транспорта через внешнюю двумембранную оболочку в качестве источника энергии используется только гидролиз АТР.
Сигнальные пептиды для переноса белков в хлоропласты напоминают раннее описанные пептиды для импорта в митохондрии. Но в растительных клетках имеются и митохондрии, и хлоропласты, и соответственно, белки должны «выбирать» между ними. Например, в растительных клетках бактериальный фермент, присоединенный (методами генной инженерии) к N-концевой последовательности митохондриального белка, направляется в митохондрии. Тот же белок, связанный с N-концевой последовательностью белка хлоропластов, оказывается в хлоропластах.
Большинство белков проникает в митохондрии и хлоропласты из цитозоля сходным образом. Этот механизм был наиболее хорошо изучен для митохондрий, особенно у дрожжей. Белок переносится в матрикс митохондрии через зоны слипания внешней и внутренней мембран. Для этого переноса требуется гидролиз АТР, а также электрохимический градиент на внутренней мембране. Транспортируемый белок разворачивается, когда пересекает мито хондриальные мембраны. В митохондрии или хлоропласты переносятся только те белки, которые содержат специфический сигнальный пептид. Этот сигнальный пептид обычно расположен на N-конце молекулы белка и отрезается после переноса ее внутрь органеллы. На втором этапе транспорта белок может переноситься во внутреннюю мембрану. Для этого он должен иметь еще гидрофобный сигнальный пептид; этот пептид открывается после удаления первого сигнала. В случае хлоропластов для переноса белков из стромы в тилакоид также требуется второй сигнальный пептид.
Биологическая библиотека - материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.
Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.
Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.
Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.
Читайте также: