Окрашенные препараты. Окрашенные мазки. Отбор материала для микроскопии. Фиксация препарата. Фиксация мазка. Фиксация бактерий.

Обновлено: 15.05.2024

Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовле­ние мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло поме­щают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей не­большое количество исследуемого материала, как для препарата «раздавлен­ная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на пло­щади 1 — 2 см максимально тонким слоем. Мазок должен быть настолько то­нок, чтобы быстро высыхал после приготовления.

Высушивание мазка лучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распростра­ненным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препа­рат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внеш­него вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строе­ния клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами (см. приложение 5). Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором.

Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилино­выми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относят­ся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей слу­жат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связы­ваются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристалл-виолет, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологи­ческой практике применяются почти исключительно основные красители.

Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В пер­вом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только опреде­ленные структуры клетки и запасные вещества.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуют­ся фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксирован­ный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение 1 — 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя.

По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стека­ющая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позво­ляет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильт­ровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фикси­рованные, окрашенные препараты могут храниться длительное время.

Форму клеток и их расположение (цепочки, розетки, пакеты, тетрады и т.д.) выявляют, как правило, на препаратах «раздавленная капля» при светло-польной или фазово-контрастной микроскопии. Для определения формы кле­ток мелких палочковидных бактерий, таких как Serratia marcescens, готовят пре­парат фиксированных клеток и применяют простое окрашивание. Клетки мел­ких бактерий, имеющих выросты - простеки (роды Caulobacter, Labrys, Prosthecomicrobium, Stella и некоторые другие), целесообразно исследовать мето­дом фазового контраста или в темном поле. Естественное расположение клеток в колонии микроорганизмов, а также спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изучают на препарате «отпечаток».

Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культи­вирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Этапы приготовления мазков-препаратов.

Методические указания к лабораторным занятиям по общей микробиологии с основами общей и частной вирусологии. // Сост.: Л.В.Новикова, И.П.Куторкина, И.С.Романова. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2003. - 64 с.

Методические указания написаны в соответствии с программой по микробиологии с вирусологией. Содержат планы занятий, задания для выполнения лабораторной работы, вопросы для самостоятельной подготовки к занятиям, основные методы изучения микроорганизмов и вирусов, дополнительный материал.

Предназначены для студентов III курса дневного отделения биологического факультета специальности «Биоэкология».

Печатается по решению научно-методического совета Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева.

ЗАНЯТИЕ 1

Тема: МИКРОБИОЛОГИЯ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ БИОЭКОЛОГИИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. МОРФОЛОГИЯ МИКРОБОВ.

Цель занятия:ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории, с методами изучения микроорганизмов, освоить технику иммерсионной микроскопии; освоить технику приготовления и простых методов окраски мазков-препаратов.

План занятия.

1. Распространение микробов в окружающей среде. Роль микробов в живой и неживой природе.

2. Микробиологическая лаборатория. Оборудование, правила работы, организация рабочего места.

3. Методы изучения микроорганизмов (микроскопический, бактериологический, экспериментальный, серологический, кожно-аллергический).

4. Микроскопический метод исследования. Виды современных микроскопов. Иммерсионная микроскопия.

5. Тинкториальные свойства бактерий. Этапы приготовления мазков-препаратов. Простые методы окраски.

6. Морфология бактерий. Измерение размеров микробных клеток.

Задания для выполнения лабораторной работы.

1. Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории.

Выполняя микробиологические исследования, необходимо соблюдать следующие правила:

- с инфицированным материалом работают только с помощью инструментов (бактериологические петли, пинцеты, корцанги и др.);

- прикасаться руками к исследуемому материалу запрещается;

- при посеве материала делают надпись на пробирках и чашках Петри и пр.;

- материал высевают в пробирки и чашки Петри вблизи от пламени горелки с обжиганием бактериологической петли и краев пробирки;

- растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, забирают пипеткой с помощью резинового баллона;

- в лаборатории запрещается курить и принимать пищу;

- рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. Личные вещи следует хранить в специально отведенном месте;

В ходе работы и по ее окончании применяются следующие способы дезинфекции:

- при случайном попадании инфицированного материала на стол, пол и другие поверхности это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раствором;

- руки обрабатывают дезинфицирующим раствором, а затем моют с мылом;

- помещение дезинфицируют с помощью бактерицидных ламп и путем обработки поверхности лабораторной мебели дезинфицирующим раствором.

2. Ознакомиться с оборудованием микробиологической лаборатории.

Лаборатории снабжены рядом обязательных приборов и аппаратов:

  1. Приборы для микроскопии: биологический иммерсионный микроскоп с дополнительными приспособлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный конденсор и др.), люминесцентный микроскоп.
  2. Термостаты и холодильники.
  3. Приборы для приготовления питательных сред, растворов и т.д.: аппарат для получения дистиллированной воды (дистиллятор), технические и аналитические весы, рН-метры, аппаратура для фильтрования, водяные бани, центрифуги.
  4. Набор инструментов для манипуляций с микробами: бактериологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.
  5. Лабораторная посуда: пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки и др., аппарат для изготовления ватно-марлевых пробок.
  6. Аппаратура для стерилизации: автоклавы, сухожаровые шкафы, бактерицидные лампы.

Каждое рабочее место снабжается спиртовкой и сосудом с дезинфицирующим раствором.

3. Приготовить мазок с агаровой культуры стафилококка, окрасить метиленовой синей, изучить под микроскопом.

Этапы приготовления мазков-препаратов.

Приготовление состоит из нескольких последовательных операций: подготовка мазка, высушивание, фиксация и окраска. Исследуемый материал наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Для взятия бактериальной культуры:

- нагревают до покраснения бактериальную петлю в пламени горелки;

- берут пробирку с исследуемой культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцами правой руки к ладони;

- обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут исследуемый материал;

- вынимают петлю, обжигают край пробирки и закрывают пробкой.

- взятый материал осторожно распределяют по предметному стеклу тонким слоем, после чего бактериальную петлю стерилизуют в пламени спиртовки;

- если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора

- мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки. Нельзя допускать закипания материала, т.к. при этом может нарушиться структура микроорганизмов.

- фиксация препарата: высушенные мазки подвергают термической (предметное стекло (мазком вверх) проводят несколько раз через пламя горелки) или химической (фиксирующие растворы: формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнау, ацетон, пары осмиевой кислоты) обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла.

Методы окраски микробиологических препаратов

Клеточная стенка бактерий является их важным отличительным признаком.

В целях более подробного изучения клеточных структур бактерий микробиологические препараты окрашивают. Можно окрашивать живые бактериальные формы, однако такая окраска не даёт полной картины строения микробной клетки. В связи с этим приготавливают фиксированные препараты микроорганизмов. Фиксация убивает живые клетки и одновременно закрепляет их на поверхности предметного стекла.

Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала, как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 - 2 см максимально тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы быстро высыхал после приготовления.

Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка.

Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например, их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором.

Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относятся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристалл-виолет, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологической практике применяются почти исключительно основные красители.

Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение 1 - 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя.

По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время.

Форму клеток и их расположение (цепочки, розетки, пакеты, тетрады и т.д.) выявляют, как правило, на препаратах «раздавленная капля» при светло-польной или фазово-контрастной микроскопии. Для определения формы клеток мелких палочковидных бактерий, таких как Serratia marcescens, готовят препарат фиксированных клеток и применяют простое окрашивание. Клетки мелких бактерий, имеющих выросты - простеки (роды Caulobacter, Labrys, Prosthecomicrobium, Stella и некоторые другие), целесообразно исследовать методом фазового контраста или в темном поле. Естественное расположение клеток в колонии микроорганизмов, а также спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изучают на препарате «отпечаток».

Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Окраска по Граму (сложное окрашивание микроорганизмов) и ее использование для дифференциации бактерий с различным строением клеточной стенки.

Данный сложный (использующий более одного действующего вещества) метод окраски впервые был предложен в 1884г. датским ученым Х. Грамом (Ch.Gram) для окрашивания тканей, а позднее получил широкое распространение при окраске прокариот и был назван именем его разработчика.

Важное значение метода окраски по Граму в микробиологии определяется тем, что результаты окрашивания бактерий оказываются напрямую связанными с особенностями строения их клеточных стенок. Объяснением этого являются выраженные различия в строении клеточных стенок грамположительных (по данному методу окрашивающихся в фиолетовый цвет) и грамотрицательных (по данному методу окрашивающихся в красный цвет)бактерий. Первые из них имеют достаточно толстые слои из муреина (у эубактерий) или псевдомуреина (у архебактерий), удерживающие образующийся в протопласте комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и препятствующие его вымыванию из клетки при последующей обработке спиртом.

В свою очередь грамотрицательные бактерии не образуют подобных гетерополисахаридов или содержат их в небольших количествах, недостаточных для предотвращения экстрагирования комплекса красителя с йодом из протопласта при его обработке спиртом. Сказанное объясняет, почему несмотря на кажущуюся простоту метода Грама, именно он получил наибольшее распространение в качестве важного таксономически значимого теста, с результатами которого хорошо коррелируют многие прочие свойства прокариот.

Для реализации данного метода готовят специальный краситель - карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового: 1 г красителя растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до консистенции кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 мл 96 % спирта, окончательно разводят 100 мл дистиллированной воды, сливают в бутыль, отстаивают и через сутки фильтруют. Вторым важным компонентом для окраски по Граму является раствор Люголя: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г иодида калия и 1 г иода кристаллического, смесь хорошо укупоривают и оставляют на сутки, после чего добавляют 300 мл дистиллированной воды.

Процедура окрашивания по Граму начинается с обработки фиксированных бактериальных клеток красителем кристаллическим фиолетовым, за чем следует обработка клеток раствором иода. Эти два компонента вместе образуют крупномолекулярный комплекс, нерастворимый в воде и слабо растворимый в спирте. Поэтому, используя спирт, клетки дифференцируют: при промывании в нем «грамположительные» клетки удерживают комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и остаются синими, а «грамотрицательные» обесцвечиваются. Для того же, чтобы также сделать их видимыми, образцы дополнительно окрашивают каким-либо контрастным красным красителем - обычно фуксином.

Среди множества предложенных в настоящее время вариантов, окрашивания по Граму (по Г.П. Калине, по Эткинсу и др.) достаточно широкое распространение получила модификацияпо А.И. Синеву, для реализации которой предварительно готовят полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового и высушенной.

Процедура сложного окрашивания микроорганизмов:

1) на предметном стекле готовят мазок бактериальной культуры, который фиксируют над пламенем горелки;

2) на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового, на который наносят 2-3 капли воды и выдерживают в течение 2 мин;

3) снимают фильтровальную бумагу;

4) не смывая водой (!) на препарат наносят 2-3 капли раствора Люголя и выдерживают в течение 1 мин;

5) сливают раствор Люголя;

6) опускают предметное стекло в стаканчик с 95 % спиртом, где тщательно прополаскивают препарат в течение 0,5-1 мин, пока не перестанет отходить краситель;

7) тщательно промывают препарат водой;

8) наносят на предметное стекло раствор водного фуксина и прокрашивают препарат в течение 0,5-1 минут;

9) краситель сливают, тщательно промывают препарат водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

Считается, что в большинстве случаев интерпретация результатов окраски мазка по Граму не представляет трудностей, однако некоторые грамположительные микроорганизмы, в частности представители рода Bacillus, могут иметь грамотрицательную окраску. Напротив, некоторые штаммы грамотрицательных родов Acinetobacter и Moraxella проявляют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, поэтому выглядят грамположительными.

Для уточнения таких «грам-сомнительных» реакций предложены особые методы. В Японии предложили метод «тяжа», позволяющий отличить с помощью КОН-теста грамотрицательные микроорганизмы от грамположительных. В основе метода с КОН лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как клеточная стенка грамотрицательных микроорганизмов разрушается при указанном воздействии.

Методика выполнения работы.

На предметное стекло наносят каплю 3 %-ного водного раствора КОН. Петлей вносят суточную агаровую культуру исследуемых бактерий и тщательно эмульгируют. При положительной реакции, если суспензия в капле становится вязкой, нити слизи тянутся за петлей на 0,5 - 2,0 см и даже дальше, это - грамотрицательные бактерии, если нет - грамположительные бактерии. Учет этой пробы более удобен на черном фоне.

Образование слизистой консистенции после обработки грамотрицательных бактерий КОН обусловлено выходом из их клеток ДНК, являющейся вязким компонентом.

Микроскопический метод исследования. Простые и сложные методы окрашивания. Метод окраски по Граму.

Микроскопические методы исследований включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. Методы микроскопического исследования микроорганизмов используют при изучении формы и структуры клетки, определении подвижности микробов, изучении включений микробной клетки., а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.

ОКРАСКА МИКРООРГАНИЗМОВ применяется для изучения морфологических свойств микроорганизмов. В нативном (естественном) состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы под микроскопом. Благодаря О. м. можно изучать их морфол. особенности, что необходимо при проведении бактериологического исследования.

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов: приготовление мазка, его высушивание, фиксация и окраска. Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды и с помощью бактериальной петли помещают в нее исследуемый материал. Материал равномерно распределяют на стекле таким образом, чтобы образовался тонкий мазок круглой или овальной формы размером 1-2 см 2. Затем препарат высушивают и подвергают фиксации, вследствие чего он прикрепляется к стеклу (фиксируется), микробы инактивируются и становятся безопасными, возрастает их восприимчивость к окраске.

Самым распространенным способом является фиксация жаром - нагреванием на пламени горелки (препарат несколько раз проводят через наиболее горячую часть пламени горелки).

После фиксации производят окраску мазка. Наиболее пригодными для окраски микробов являются основные и нейтральные анилиновые красители. Окрашенный препарат промывают водой и высушивают. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.

Существуют простые и сложные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно используют только один краситель, чаще - фуксин (окраска производится в течение 1-2 мин) или метиленовый синий (время обработки мазка краской 3-5 мин). При сложных методах окраски применяют два или более контрастных красителя.

Среди сложных методов окраски различают дифференциальные методы и методы, предназначенные для выявления отдельных структур клетки. К дифференциальным методам относятся методы Грама и Циля-Нельсена, позволяющие различать по цвету микроорганизмы, сходные по морфол. свойствам.

Метод окраски по Граму - наиболее распространенный способ окраски. Бактерии в зависимости от того, подвергаются они окраске по этому методу или нет, разделяют на две группы: граммположительные (красящиеся по Граму) и грамотрицательные (не красящиеся) Различие в окраске обусловлено разным строением клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Методика окраски по Граму заключается в последовательной обработке фиксированного мазка: окраске генцианвиолетом через фильтровальную бумагу (1-2 мин), обработке р-ром Люголя (1 мин), обесцвечивании спиртом (1/2-1 мин - до отхождения фиолетовых струек краски), промывании водой, окрашивании фуксином (1-2 мин). Сущность метода состоит в том, что грамположительные бактерии удерживают комплекс краситель - йод и не обесцвечиваются спиртом, грамотрицательные не обладают этим свойством, т. е. обесцвечиваются спиртом (дифференцирующим веществом) и докрашиваются фуксином. В результате грамположительные бактерии приобретают фиолетовый цвет, грамотрицательные - красный.

Метод Циля-Нельсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых. При окраске по этому методу используют фуксин Циля, серную кислоту (дифференцирующее вещество) и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет фуксином Циля, не обесцвечиваясь кислотой, а некислотоустойчивые теряют красную окраску при обработке кислотой, и докрашиваются метиленовым синим.

Способы фиксации мазков из микробов и смешанного материала

Фиксация необходима для инактивации бактерий и прикрепления (фиксации) их к стеклу, предотвращения аутолизиса клеток и улучшения восприятия красителя.

а) Самым распространённым методом фиксации бактерий считается обработка жаром, что осуществляется путём трёхкратного проведения препарата мазком кверху через пламя спиртовки или газовой горелки. Препарат находится в пламени спиртовки З секунды. После чего препараты из бактерий окрашиваются разными способами. Метод применим при работе с чистой культурой микробов.

б) Фиксация химическими веществамииспользуется для выявления и дифференциации структурных элементов: жгутиков, протоплазмы, нуклеоида, оболочки, при работе со смешанным материалом (кровь, отпечатки органов, соскобы со слизистых, гной, мокрота). В качестве фиксаторов используют:

- метиловый спирт (фиксируют 5 минут),

- этиловый спирт (фиксируют 20 минут),

- смесь Никифорова: равные объёмы спирта и эфира (фиксируют 20 минут),

- спирт - формол: смесь 5мл неразведённого формалина мл и 96 % этилового спирта (фиксируют 15 минут),

- жидкость Боуэна: неразбавленный формалин 10 мл, ледяная уксусная кислота 2 мл, насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 30 мл (фиксируют 30 минут),

- жидкость Карнуа - ледяная уксусная кислота 10 мл, хлороформ 30 мл и 96 % спирт (фиксируют 15 минут).

Приложение 7

Ориентировочная окраска бактерий простыми методами.

Окраска выявляет морфологию и частично структуру клетки.

Для простой окраски используют один из красителей:

а) разведённый (1:10) карболовый фуксин, окрашивают 10-30 сек. (метод Леффлера), промывают водой, высушивают на воздухе;

б) водньий раствор метиленовой синьки Леффлера окрашивают 3-10 минут, промывают водой, высушивают на воздухе.

Приложение 8

Микроскопия препарата с иммерсионным объективом

Иммерсионный объектив даёт увеличение х90 при условии отсутствия рассеивания потока лучей в связи с неоднородностью среды при их прохождении.

В этой связи, во избежание такого дефекта применяется иммерсионное кедровое масло или его заменитель - вазелиновое масло. Процесс микроскопии с иммерсионным объективом х90 ведут с окулярами х7, х10, но чаще с первым из них. Техника микроскопии состоит из нескольких этапов:

1. На готовый окрашенный мазок наносят каплю масла.

2. Под контролем глаза сбоку осторожно опускают тубус, погружая объектив в каплю масла. При неосторожном выполнении можно раздавить либо линзу объектива, либо предметное стекло.

3. После прикосновения объектива к маслу дальнейшее опускание тубуса ведётся с помощью микровинта микроскопа до появления микрообъектов в окуляре.

4. Просмотр препарата ведут только за счёт манипуляций с микровинтом и движения стекла.

5. После окончания микроскопии тубус поднимают, объектив выходит из капли масла.

6. Масло с объектива удаляют чистой ваткой или марлей и протирают жирорастворителем - либо ксилолом, либо спиртом, либо хлороформом. Оставлять масло на линзе объектива нельзя.

7. Револьверную часть на тубусе устанавливают на объектив х8, конденсор и тубус опускают, переводя в нерабочее состояние, и закрывают микроскоп колпаком.

Читайте также: