Изучение сердечно-сосудистых заболеваний на животных. Перенос генов в соматические клетки животных

Обновлено: 15.05.2024

1. Левенкова М.В. Свойства и регуляция активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса в печени крыс при токсическом гепатите: дис. … канд. биол. наук. - Воронеж, 2006. - 180 с.

2. Крыльский Е.Д. Содержание диеновых конъюгатов в тканях крыс при экспериментальном ревматоидном артрите / Е.Д. Крыльский, Т.Н. Попова, Е.М. Кирилова // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ: материалы 5-й международной научно-методической конференции “Фармобразование-2013”. - Воронеж, 2013. - С. 356-359.

3. Попова Н.А. Модели экспериментальной онкологии // Соросовский Образовательный Журнал. - 2000. - Т. 6, № 8. - С. 33-38.

Одним из методов познания сложных механизмов развития патологических процессов в организме является биологическое моделирование. Для создания моделей, которые могли бы быть максимально полезными, необходимо выбрать один или два существенных признака, общих для оригинала и модели. Организм человека подвергается действию физических, химических, биологических, социальных факторов, что приводит в ряде случаев к развитию патологического процесса или болезни. Исследования, проводимые на животных, позволяют ответить на ряд вопросов, касающихся пусковых механизмов, общих звеньев патогенеза, и принципов терапии и профилактики ряда болезней. В настоящее время возможно воспроизвести в экспериментальных условиях практически любую модель патологии. Приведем несколько примеров видов моделирования патологических процессов на животных.

Создание модели экспериментального токсического гепатита. Для создания модели экспериментального токсического гепатита часто используется ССl4, который является органоспецифическим токсином, обладающим гепатотропным эффектом. После суточной пищевой депривации крысам с помощью специального зонда в пищевод вводят ССl4 в вазелиновом масле (доза - 0,064 мл на 100 г веса животного). Максимальный цитолиз гепатоцитов наблюдается на 3-4 сутки после однократного введения ССl4 /1/. Печень крыс, подвергнутых токсическому гепатиту, используется для дальнейших биохимических, морфологических, гистологических и других исследований. СС14-гепатит характеризуется развитием некроза, белковой и жировой дистрофии гепатоцитов, локализованных преимущественно в центральной зоне печеночной дольки, где максимальна активность зависимых от цитохрома Р-450 монооксигеназ и преобладает продукция повреждающих метаболитов гепатотоксина. Создание моделей патологических состояний на животных также позволяет изучать влияние новых гепатопротекторов на процессы регенерации паренхимы печени.

Создание моделей аутоиммунных заболеваний на примере ревматоидного артрита. Аутоиммунную патологию можно характеризовать как атаку иммунной системы против органов и тканей собственного организма, в результате которой происходят их структурно-функциональные повреждения. Морфологические изменения при аутоиммунных болезнях характеризуются воспалительными и дистрофическими изменениями в поврежденных органах. В клетках паренхимы выявляются зернистая дистрофия и некроз. В кровеносных сосудах отмечается мукоидное и фибриноидное набухание и некроз их стенок, тромбоз, вокруг сосудов формируются лимфоцитарно-макрофагальные и плазмоцитарные инфильтраты. В соединительной ткани стромы органов выявляются дистрофия в форме мукоидного и фибриноидного набухания, некроз и склероз. В селезенке и лимфатических узлах выражена гиперплазия, интенсивная инфильтрация лимфоцитами, макрофагами и плазматическими клетками. Адъювантный артрит у крыс. Хроническое иммунное воспаление моделируют у крыс субплантарным введением в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда. Воспалительная реакция, как правило, оценивается в динамике каждые 2 дня /2/. Могут учитываться также и другие симптомы генерализованной реакции организма на введение адъюванта (отек ушей, хвоста, полиартрит, ухудшение общего состояния, снижение массы тела, гибель). Первичная реакция (отек на правой лапе) оценивается онкометрически на 3-й день после инъекции адъюванта. Вторичная иммунологическая реакция (отек на левой лапе) оценивается на 14-й день после введения адъюванта (при профилактической схеме введения) или на 25-й день (при лечебной схеме введения).

Модели экспериментальной онкологии. Арсенал моделей экспериментальной онкологии включает спонтанные, перевиваемые и индуцированные опухоли животных, культуры опухолей человека и животных, опухоли человека, привитые животным, и молекулярно-генетические модели. Спонтанныеопухоли обнаруживаются у животных, не подвергшихся каким-либо воздействиям со стороны экспериментатора. Показано, что у кроликов часто возникает вызываемая ДНК-содержащим вирусом спонтанная папиллома. Она представляет собой доброкачественные бородавчатые разрастания на коже ушей, которые впоследствии превращаются в злокачественную опухоль, метастазирующую в легкие и лимфоузлы. Эта модель с успехом применяется для решения проблем вирусологии и иммунологии опухолей. Из домашних животных в большей степени опухолями поражаются собаки. У них возникают опухоли разных органов, чаще молочных желез. Спонтанные опухоли собак иногда используют на последних предклинических этапах испытания противоопухолевых химических соединений. Опухоли могут быть индуцированы различными видами облучения, химическими канцерогенами, онковирусами. Модели индуцированных вирусами опухолей животных, а также модели злокачественно трансформированных под влиянием вирусов клеток, культивируемых в условиях in vitro, позволили не только раскрыть многие тайны вирусного канцерогенеза, но и создать общую концепцию молекулярных механизмов возникновения опухолей. Молекулярно-генетические модели. С развитием молекулярной биологии появилась возможность исследования механизмов злокачественной трансформации на молекулярном уровне. Интересующий экспериментатора ген может быть выделен из генома, клонирован (то есть получено много его копий) и расшифрована его структура. Кроме того, ген может быть перенесен в геном другого животного, которое будет называться трансгенным. Манипулирование с генами позволяет также осуществить выбивание (нокаут) определенного гена /3/.

Моделирование гипертонической болезни. В опытах на животных (собаки, обезьяны) была показана принципиальная возможность моделирования гипертонической болезни путем создания тяжелых невротических расстройств. Использование столкновения наиболее сильных врожденных рефлексов - полового и оборонительного приводило к невротическим состояниям со стойкими соматическими нарушениями в виде стабильного повышения артериального давления. В этих и других опытах было установлено, что сердечно-сосудистая патология, гипертоническая болезнь как ее изначальное проявление - наиболее частое соматическое проявление неврозов /4/.

Таким образом, моделирование патологических состояний на животных помогает выяснить этиологию, патогенез заболеваний, методы лечения и профилактики. Биологическое моделирование также широко используется на доклинической стадии при исследовании механизмов действия новых лекарственных препаратов.

Генетическая инженерия животных

Однихми из носителей для введения чужеродной ДНК в животную клетку являются векторы на основе ДНК вирусов (например, SV40, вируса бычьей папилломы и т. д.) или на основе ретровирусов (например, на основе вируса лейкоза мышей) (рис. 4.12). Они легко проникают в клетку хозяина, встраиваются в ее ДНК путем обычной инфекции и обеспечивают высокоэффективный перенос генов. В основном трансформации животных клеток осуществляют либо с помощью ретровирусов (около 40 % от всех трансформаций), либо путем упаковки ДНК в липосомы (25 %), реже используют другие способы.

Все генно-инженерные методы работы с клетками животных можно разделить на две группы: эксперименты с соматическими клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат — получение трансгенных организмов.

Генетическая трансформация соматических клеток животных

Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ. Помимо создания клеток-продуцентов, трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, а при необходимости и человека, что имеет огромное значение для медицинской генетики.

Рис. 4.12. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов (по Б. Глику и Дж. Пастернаку, 2002). Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион, производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мышат, несущих трансген в клетках зародышевой линии, проводят ряд скрещиваний

Хотя культуры клеток животных при массовом выращивании гораздо менее экономичны, чем бактериальные и дрожжевые культуры, они обладают существенным преимуществом — способностью осуществлять мелкие, но весьма важные модификации белков — продуктов гена млекопитающих. Например, для эффективного функционирования ряда белков необходимо присоединение к ним цепочек из молекул углеводов или липидов. Образование и присоединение таких цепочек — обычный процесс для клеток млекопитающих, тогда как бактериальная клетка не способна производить подобные модификации.

Культуры клеток животных служат эффективным источником выделения некоторых вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека. Получение таких вакцинных культур клеток осуществимо с помощью техники рекомбинантных ДНК и эффективных векторов экспрессии для клеток млекопитающих и человека. При использовании ДНК-вакцин в организм вводится не антиген, а ген, кодирующий синтез этого антигена. Ген встраивается в плазмиду, плазмида вводится в организм путем обыкновенной инъекции, выработка вирусного белка провоцирует синтез специфических антител, т. е. вызывает иммунный ответ.

ДНК-вакцины имеют хорошие перспективы в животноводстве. Достоинством таких вакцин является маленький объем: для иммунизации одной мыши достаточно 10-50 мкг плазмиды, одной коровы — 200-300 мкг. Плазмида сохраняется в организме до одного года. В стадии клинических испытаний в настоящее время находятся ДНК-вакцины против микоплазм, возбудителя туберкулеза, сальмонеллеза, лейшманиоза.

Роль Y-хромосомы в «делах сердечных»

Новость

Сердечная мышца. TEM фибрилл здоровой сердечной мышцы. Митохондрии (оранжевые) снабжают мышечные клетки энергией; миофибриллы пересекают поперечные канальца (темно-синие линии), которые разделяют миофибриллы на сократительные единицы (саркомеры).
Увеличение: 3900x

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Как связана потеря Y-хромосомы с заболеваниями сердечно-сосудистой системы? Ученые из Национальных институтов здравоохранения провели исследование, в ходе которого удалили Y-хромосому из клеток красного костного мозга у мышей и выявили изменения в тканях сердца. А при изучении данного явления у человека было обнаружено, что мужчины, в большом количестве клеток которых отсутствовала Y-хромосома, имели повышенный риск сердечно-сосудистых заболеваний.

Конкурс «Био/Мол/Текст»-2022/2023

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2022/2023.

Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

Часто при упоминании Y-хромосомы на первый план выходят пол и половое развитие. Однако не все так просто. Как выяснилось недавно, маленькая по размеру хромосома, на которой расположены более 70 белок-кодирующих генов, может с возрастом исчезать из клеток [1]. Кроме того, ее отсутствие, возможно, приводит не только к бесплодию и дефектам полового развития у мужчин, но и к заболеваниям сердца [2].

Гены, расположенные на Y-хромосоме, преимущественно связаны с проявлением и развитием мужских половых признаков. При этом соматические клетки способны делиться и функционировать и при утрате этой хромосомы [3]. Таким образом, у мужчин в разных органах и тканях в течение жизни увеличивается количество клеток, имеющих кариотип 45,X. При описании хромосомного набора используют следующую структуру: сначала записывают общее количество хромосом, а через запятую указывают половые, в соответствии с этим мужской кариотип в норме обозначают как 46,XY. Явление, при котором в тканях присутствуют клетки с разным набором хромосом, называется «мозаицизм» («Биомолекула» уже писала о мозаицизме в статье «Геномная головоломка: открой в себе мозаика» [4]).

Как происходит потеря Y-хромосомы?

Исследования данного процесса еще продолжаются. Предполагается, что потеря Y-хромосомы происходит в процессе митоза соматических клеток. В этом случае отдельные клетки будут иметь кариотип 45,X. Укорочение теломерных участков и другие явления, влияющие на микроархитектуру хромосом, могут приводить к неправильному расхождению Y-хромосомы при делении клеток [1].

Кроме того, Y-хромосома человека обогащена палиндромными последовательностями [5]. Палиндромные последовательности — это участки ДНК, в которых последовательность нуклеотидов при чтении от 5’-конца к 3’-концу совпадает с последовательностью в комплементарной цепи. Высокая частота данных последовательностей является причиной образования изодицентрических хромосом — хромосом, состоящих из идентичных плеч и содержащих два близко расположенных центромерных региона, что приводит к нарушениям сегрегации хромосом во время митоза (рис. 1) [6].

Рисунок 1. Структура Y-хромосомы.

(а) — нормальная структура Y хромосомы.
(б) — перицентрическая инверсия, затрагивающая перицентромерную область p-плеча и проксимальный район q-плеча. В результате произошла перестройка проксимальной области q-плеча в p-плечо.
(в) — сестринские хроматиды, формирующиеся во время гаметогенеза.
(г) — структура изодицентрической Y-хромосомы.

Последующая клональная экспансия одной или нескольких стволовых клеток с кариотипом 45,X приводит к клиническим проявлениям мозаичной потери Y хромосомы (mosaic loss of Y, mLOY) в различных органах и тканях [1].

Это явление преимущественно характерно для людей пожилого возраста. Исследования показывают, что мозаичная потеря Y-хромосомы (mLOY) ассоциирована с болезнями сердца, онкопатологией, синдромом Альцгеймера и другими «возрастными» заболеваниями. Более того, mLOY может являться одной из возможных причин более короткой продолжительности жизни у мужчин по сравнению с женщинами. У мужчин молодого возраста случаи mLOY встречаются реже и проявляются нарушениями сперматогенеза, а также дефектами развития половой системы (рис. 2) 8.

Рисунок 2. Последствия мозаичной потери Y-хромосомы. В зависимости от этапа развития человека, последствия mLOY будут иметь разные фенотипические эффекты.

При чем тут сердце?

На 38 мышах было проведено исследование, в ходе которого с помощью технологии CRISPR-Cas9 из клеток красного костного мозга была удалена Y-хромосома [2]. Как известно, в процессе митоза к центромерным районам хромосом прикрепляются нити веретена деления, благодаря чему происходит сегрегация хромосом к полюсам клетки. После воздействия CRISPR-Cas9 на центромерные области происходит их фрагментация, а впоследствии нарушается расхождение хромосом во время деления, из-за чего возможна частичная утрата хромосом [10]. Для таргетного воздействия CRISPR-Cas9 на нужные участки генома необходимо участие направляющих РНК (gRNA). В рамках проведенного эксперимента были использованы gRNA, которые нацелены на повторяющиеся последовательности в центромерных районах Y-хромосомы. Доставку комплекса gRNA и Cas9 осуществляли с помощью лентивирусных векторов (подробнее можно прочитать в статье «Лентивирусные векторы: как они стали лучшими векторами для терапии ex vivo» [11]). После этого клетки, модифицированные подобным образом, подсадили молодым самцам мышей, у которых был удален костный мозг. В результате данной процедуры было обнаружено, что в крови реципиентов 49-81% лейкоцитов не имеют хромосому Y. В контрольной группе 37 мышей также подвергли трансплантации костного мозга, но потеря Y-хромосомы у них отмечена не была [2].

Период наблюдения за грызунами составил 2 года. Выяснилось, что 40% мышей с удаленной Y-хромосомой выжили в течение 600 дней после трансплантации. В то время как в контрольной группе этот показатель составил 60% [2].

Также были отмечены заболевания сердца у мышей с отсутствующей Y-хромосомой. Примерно через 15 месяцев после начала исследования у мышей в экспериментальной группе сила сокращения сердца снижалась на 20%. Кроме этого, начинался фиброз сердечной мышцы [2].

Помимо опытов с мышами, исследователи провели анализ образцов от более 15 000 мужчин, полученных в UK Biobank. Было выявлено, что мужчины, как минимум 40% лейкоцитов которых были лишены Y-хромосомы, на 30% чаще умирали от заболеваний системы кровообращения, чем те, у которых количество клеток с нормальным кариотипом было больше [2].

Заключение

Анализируя полученные данные, пока рано делать однозначные выводы относительно связи сердечных патологий и mLOY. Однако данное явление необходимо учитывать в клинической практике и продолжать исследования не только механизмов потери Y-хромосомы клетками, но и влияния mLOY на другие органы и системы организма.

Достижения генетической инженерии животных

Трансгенные животные являются удобной моделью для изучения болезней человека, их также планируют использовать для производства необходимых человеку биомедицинских препаратов.

Трансгенные животные как модели наследственных заболеваний человека

Трансгенные линии животных служат для моделирования различных генетических болезней человека, что имеет огромное значение для медицинской генетики. По данным секвенирования генома мыши, у человека содержится около 70-80 % гомологичных генов (генов-ортологов). На мышах можно получать мутации, осуществлять генно-инженерные манипуляции и изучать механизмы регуляции экспрессии генов, проводить скрещивание трансгенных животных и анализ наследования в потомстве.

На трансгенных животных можно изучать наследственные заболевания мозга и нервной системы. Гены болезни Альцгеймера (отложение белка Р-амилоида приводит к образованию бляшек) и гены, отвечающие за развитие эпилепсии и болезней мозга, вводят в геном нормальных животных; при этом получают трансгенных животных-моделей, на которых можно испытывать различные терапевтические препараты.

Трансгенных животных стали использовать для исследования воспалительных и иммунологических заболеваний человека, например ревматоидного артрита. С их помощью моделируют болезни — атеросклероз, мышечную дистрофию (миодистрофия Дюшенна), образование опухолей, гипертонию, сердечно-сосудистые и прионные заболевания и др.

На основе изучения трансгенных животных разрабатывают методы генетической терапии (способы лечения различных наследственных заболеваний). При этом используют соматическую трансфекцию — метод, при котором генетические конструкции вводят в определенные клетки и ткани организма пациента.

Генетическая трансформация животных клеток

Внедрение вирусов в животные клетки является ярким примером генетической трансформации последних в природных условиях. Что касается искусственного введения чужеродных генов в клетки животных, то впервые это было выполнено в 1976 г. в США, когда Р. Ениш встроил в геном мыши чужеродные гены, передававшиеся по наследству. Схема проведения генно-инженерных процедур подобна таковым для микробных и растительных клеток, однако в связи со сложностью структур животных клеток имеются некоторые особенности. Для клонирования генов животных используют векторы на основе вирусной ДНК, чаще всего вируса SV-40. Часть генома этого вируса удаляется, а вместо него встраиваются гены, которые необходимо ввести в животную клетку. Отбор трансформированных клеток проводят с помощью точечного мутагенеза и селективных сред. Например, используют животные клетки с мутацией по тимилинкиназе (ТК). аленозинфосфорибозилтрансферазе (АФРТ) и гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ). Если клетки с мутациями по данным ферментам поместить на среду, содержащую гипоксантин, аминоптс- рин и тимидин (ГАТ-среду), то они на ней расти не будут, в отличие от клеток, содержащих вектор с этими генами.

Трансформацию животных клеток можно проводить не только за счет введения в них векторов, несущих чужеродный генетический материал, но и в результате микроинъекций целевых генов непосредственно в ядро животной клетки. Этот метод получил широкое распространение в последние годы. При помощи микрокапиллярной пипетки под микроскопом в ядро клетки вводится Ю“ 10 — 10" 12 л раствора трансформирующей ДНК (несколько тысяч копий генов).

Трансгенные животные.

Методы генетической трансформации животных клеток позволяют получить животных с видоизмененным геномом. Введение клонированных генов в клетки животных — достаточно трудоемкая процедура. Основные ее этапы заключаются в следующем (рис. 31.6).

Читайте также: