Характеристики питательных сред для культивирования бактерий. Консервирующие среды для бактерий. Среды обогащения для бактерий. Элективные и селективные питательные среды для выращивания бактерий.

Обновлено: 15.05.2024

Быть питательными
Иметь оптимальный pH
Бактерии pH=7,2-7,4
Холерный вибрион pH=8,5-9,0
Возбудитель туберкулеза pH=6,2-6,4
Быть изотоническим
Быть стерильным
Влажными и с оптимальной консистенцией
Иметь определенный окислительновосстановительный потенциал
5) прозрачными
1)
2)
1)
2)
3)
4)

5. Классификация сред

6. Классификация по исходным компонентам

7. По консистенции

жидкие
полужидкие
плотные
1,5—2% агаровые среды,
бульон мясо-пептонный 0,5% агар мясопитательная желатина,
(см.), пептонную воду
пептонный
свернутая сыворотка,
сахарный бульон, бульон
свернутый яичный белок,
Хоттингера

8. Классификация по составу

простые
мясопептонный бульон(МПБ),
мясопептонный агар(МПА),
питательный желатин
сложные
готовят, прибавляя к
простым средам
аминокислоты, витамины,
микроэлементы
СРЕДА ПЛОСКИРЕВА
-дифференциальнодиагностическая и
селективная

9. Классификация по назначению

основные
• Растет все
специальные
• служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих
на простых средах.
элективные(избирательные)
• служат для выделения определённого вида микробов, росту которых
они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих
микроорганизмов.
дифференциально-диагностические
• позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной
активности.
консервирующие
• содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов,
что способствует сохранению их жизнеспособности.

10. Основные питательные среды

11. Специальные питательные среды

Сывороточный
агар
Пневмококки,
менингококки
Кровяной агар
Желчный агар
Стрептококки,
пневмококки
брюшнотифозные,
паратифозные и
дизентерийные
палочки

среда Китта-Тароцци
Желатин
для культивирования и хранения
клостридий
для изучения
протеолитических
ферментов

13. Элективные среды

Селенитовая среда
Сальмонеллы и
дезинтерийные микробы
Зонне
Теллуритовые среды
Также дизентерийные
возбудители

16. Дифференциально-диагностические среды

17. Консервирующие среды

а) глицериновая смесь,
состоящая из 0,5 л химически
чистого глицерина и 1,0 л
физиологического раствора
б) боратная смесь
в) фосфатно-буферная смесь

18. Методы посева

Глубинный метод посева в плотные среды
1.1. Жидкий продукт или разведение навески вносят
параллельно в две чашки Петри и заливают
расплавленной и охлажденной питательной средой.
Высота слоя питательной среды должна быть 4-5 мм.
1.2. Среду перемешивают с посевным материалом
круговыми .После застывания среды чашки с посевами
вверх дном помещают в термостат.

Поверхностный метод посева на плотные среды
2.1.Среду наливают в чашку Петри и после застывания
подсушивают.
2.2.На подсушенную среду наносят жидкий продукт или
разведение навески и немедленно равномерно растирают по
поверхности шпателем
2.3.Засеянную поверхность подсушивают

Классификация питательных сред

Естественные среды представляют собой природные субстраты (молоко, кровь, желчь, сыворотка, картофель). Искусственные содержат смесь природных органических веществ и продуктов их кислотного или ферментативного распада. Синтетические среды состоят из буферной солевой основы и растворов аминокислот, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеотидов, нуклеозидов, жирных кислот, витаминов в точно установленных дозировках. В качестве источников азота в них используются аминокислоты. Достоинство этих сред в том, что они имеют постоянный состав, по ним можно определить потребности микробов в тех или иных питательных веществах.

Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар - продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Для иммунологических и бактериологических полей используется вымороженный, осветленный агар, который при кипячении или автоклавировании смеси порошка с водой расплавляется при температуре 85-100°С, а при охлаждении до 45-48°С образует гель.

Для приготовления, плотных питательных сред агар-агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3%.

Простые среды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона - это так называемый мясо-пептонный бульон;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина - бульон Хоттингера, пепсина - бульон Мартена).

Мясо-пептонный агар (МПА) - получают путей добавления к МПБ arap-arapa (1,5-3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона - это скошенный агар. Для его получения пробирки для засты­вания среды оставляют в наклонном положении. Если среда распределе­на в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки - пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

Специальные питательные среды - среды, на которых создаются условия для выращивания тех бактерий, которые не растут на простых средах.

Кровяной агар или кровяной бульон - получают путем добавле­ния к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности.

Сывороточный бульон или сывороточный агар получают путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков.

Желчный бульон или желчный агар получают путем добавления к питательной среде медицинской желчи без консерванта, или свежеполученной от крупного рогатого скота. Среда применяется для выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизенте­рийных палочек.

Специальные среды для культивирования анаэробных бактерий: среда Китта-Тароцци состоит из питательного бульона, глю­козы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода.

Желатин - животный белок, продукт частичного гидролиза коллагена. Имеет вид бесцветных или светло-желтых пластинок без запаха и вкуса. В холодной воде набухает, сильно поглощая воду. При темпера­туре 30°С растворяется, при охлаждении до 20-22°С превращается в гель (студень). Используется в микробиологии для изучения протеолитических ферментов.

Дифференциально-диагностические среды позволяют различить один вид микроба от другого. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входит основная пи­тательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагнос­тическим признаком, индикатор, изменение цвета которого свидетельству­ет о разложении субстрата и образовании кислых продуктов.

Агар Эндо - плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными.

Среда Левина (лактозоэозинметиленовый агар) - среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет, колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды (светло-фиолетового цвета).

Среды Гисса - набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам.

Элективные питательные среды содержат дополнительные вещества, задерживающие рост грамположительных бактерий. Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. Селективные условия получают путем добавления в сре­ду химических веществ. Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения.

Среда Плоскирева - плотная питательная среда, содержащая со­ли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. Эта среда является не только селективной, так как подавляет рост многих микробов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии, но и дифференциально-диагностической, так как лактозоотрицательные бактерии (шигеллы) образуют на ней бесцветные колонии, а лактозоположительные - кирпично-красные.

Селенитовая среда - является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питатель­ной среде добавляют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.

Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) - содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний чернота цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) - среда для выделе­ния стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта сре­да является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщеп­ляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кисло­ты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Теллуритовые среды (сывороточно-теллуритовый агар, кровяно-теллуритовый агар) - селективные среды для выделения дифтерийных бактерий, содержат теллурит калия. Бесцветная соль теллура, содержащаяся в питательной среде, восстанавливается дифтерийными бактерия­ми до металла, окрашивающего колонии в черный цвет.

Щелочной агар элективен для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.

Консервирующие среды - среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Консервирующие среды применяются, когда нет возможности быстрого посева на питательные среды.

Для бактерий наиболее употребительны консерванты:

а) глицериновая смесь, состоящая из 0,5 л химически чистого глицерина и 1,0 л физиологического раствора;

б) боратная смесь;

в) фосфатно-буферная смесь.

Для длительного сохранения свежевыделенных и производствен­ных культур применяют полужидкий голодный агар, в этой среде при пониженной жизнедеятельности микробов продукты обмена накапливаются незначительно, что способствует хорошему сохранению культур.

Специальные среды.

В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин).

Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышлен­ность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.

Термостаты

Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.

Термостат - это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется тер­морегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.

Методика приготовления пластинчатого агара

МПА расплавляют на водяной бане, затем остужают до 50-55°С. Горлышко флакона обжигают в пламени спиртовки, открывают чашки Петри так, чтобы вошло горлышко флаконы, не прикасаясь к краям чашки, выливают 10-15 мл МПА, закрыв крышку, покачивают чашку, чтобы среда равномерно распределилась, оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. После подсушивания чашки с пластинчатым агаром хранят на холоде.

Посев петлей

Стерильной остуженной петлей берут каплю материала, левой рукой приоткрывают один край чашки, вносят петлю внутрь и у противоположного края делают петлей несколько штрихов на одном месте, затем петлю отрывают и засевают материал параллельными штрихами от одного края чашки к другому с интервалом 5-6 мм. В начале посева, когда микробов на петле будет много, они дадут сливной рост, но с каждым штрихом микробов на петле остается все меньше, и они будут оставаться одиночными и давать изолированные колонии.

Посев по методу Дригальского

Этот метод используется при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой (гной, испражнения, мокрота). Для посева по методу Дригальского берут шпатель и несколько чашек (3-4). Шпатель - это инструмент, изготовленный из металлической проволоки или стеклянного дрота, загнутого в виде треугольника или Г-образно. Материал петлей или пипеткой вносят в первую чашку и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды, этим же шпателем, не прожигая его, втирают материал в питательную среду во второй чашке, а затем - в третьей. При таком посеве в первой чашке будет сливной рост, а в последующих чашках вырастают изолированные колонии.

Выделение чистой культуры по Щукевичу

Для посева берут свежеприготовленную питательную среду с конденсатом. Исследуемый материал забирают петлей и вносят его осторожно, соблюдая правила асептики, не касаясь среды и стенок, в конденсационную воду. Бактерии с высокой подвижностью «выползают» на влажную поверхность скошенного агара.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1. Классификацию, морфологию грибов, их методы изучения.

2. Классификацию и морфологию актиномицетов.

3. Правила противоэпидемических режимов и техники безопасности.

Уметь:

1. Дифференцировать микроорганизмы при микроскопии.

2. Микроскопировать окрашенные препараты.

3. Обеззараживать материал, обрабатывать руки дезинфирующими препаратами.

При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.

Мясо-пептонный агар (МПА) — получают путем добавления агар-агара (1,5-3%) к МПБ. Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона — это скошенный агар. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде штастшки — пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

Классификация питательных сред по исходным компонентам:

1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.

Могут быть:

- Растительные (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.п.).

- Животные (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови и т.п.).

- Смешанные (МПА, среда Левенштейна - Йенсена и т.п.).

2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды, получают полусинтетические среды.

Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полужидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые — 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.

Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.

Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ — мясо-пептонный бульон, МПА — мясо-пептонный агар, МПЖ — мясо-пептонный желатин и т.п.

Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.

Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.

Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон). Кровяной агар или кровяной бульон — получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.

2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Еh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NаС1, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:

Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Висмут-сульфит агар — содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) — среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.

Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3-5 сут. Ж

3. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.

- Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т.п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаясялошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

- Среды для изучения гликолитических свойств включают три основных компонента: питательная основа (бульон, агар), субстрат (моно- и дисахара, многоатомные спирты) и индикатор для выявления соответствующих ферментов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа.

Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу.

Такой средой является среда Эндо. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они не сбраживают лактозу.

4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.

5. Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Эти среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.

Стерилизация питательных сред.

Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С и давлении 1-1,5 атмосферы.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, про-изводят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких об-разцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Существует также биологический контроль сред. В этом случае несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.

Среды для культивирования бактерий

оптимальное содержание
питательных веществ в
легкоусвояемой форме (органические
источники углерода,
набор минеральных солей, факторы
роста),
адекватное для соответствующей
группы бактерий значение pH,
определенный окислительновосстановительный потенциал,
достаточное содержание воды,
стерильность.

3. Классификация питательных сред

• Питательные среды делят по консистенции и назначению.
• В зависимости от консистенции различают жидкие
(мясопептонный бульон, сахарный бульон), плотные (1-2%
мясопептонный агар), полужидкие (0,3-0,9% мясопептонный
агар) питательные среды. Для приготовления плотных
питательных сред в жидкие среды добавляют 1,5-2% агара -
экстракта из морских водорослей, основным компонентом
которого является полисахарид агароза. Агар плавится при
температуре около 90оС и застывает при температуре около
40оС, обеспечивая питательной среде после застывания
консистенцию геля. Агар не расщепляется абсолютным
большинством микроорганизмов, выступая в средах как
инертный формообразующий компонент.
• В зависимости от назначения выделяют простые
(универсальные), обогащенные, селективные,
дифференциально-диагностические среды и среды с
комбинированными свойствами

4. Приготовление питательной среды


Для получения готовой среды
необходимо взвешиванием отмерить
нужное количество порошка,
растворить его в воде, нагреванием
расплавить находящийся в нем агар,
провести стерилизацию, асептически
добавить нетермостойкие добавки и
разлить в стерильную лабораторную
посуду.

5. Простые (универсальные, основные) питательные среды

Основа сред - пептоны, которые готовят из природных
источников с высоким содержанием белка (отходы мясного
производства, рыбная мука, соя, казеин) путём частично
гидролиза пепсином или трипсином.
Пептоны содержат аминокислоты и пептиды, а также липиды,
витамины и многие другие органические и минеральные
вещества.
Добавляется NaCl (изотоничность)
Иногда вносятся мясной или дрожжевой экстракт.
Простые среды подходят для культивирования широкого
спектра неприхотливых микроорганизмов, таких как Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
Могут использоваться для приготовления сложных сред
Примеры:
мясо-пептонный бульон (МПБ) — жидкая среда
мясо-пептонный агар (МПА) — плотная среда
ГРМ (гидролизат рыбной муки+ натрияхлорид+агар)
триптон-соевый агар

6. Обогащенные питательные среды

• Помимо компонентов простых сред они
содержат дополнительные
ингредиенты, стимулирующие рост
прихотливых микроорганизмов.
• Обогащенные углеводами (сахарный
бульон/агар)
• Обогащенные белками (шоколадный
агар, сывороточный, асцит бульон/агар;
Brain-heart broth - бульон с сердечномозговой вытяжкой для
культивирования требовательных
патогенных микроорганизмов)
«Шоколадный» агар - содержит эритроциты,
разрушенные нагреванием. Высвобождаемые из них
вещества (в том числе гемоглобин и NAD)
обеспечивают рост таких микроорганизмов, как
Haemophilus influenzae и Neisseria meningitidis.

7. Селективные (избирательные) питательные среды


Обеспечивают выделение определенных групп микроорганизмов, подавляя
рост сопутствующей микрофлоры. Создание неблагоприятных условий для
нежелательных микроорганизмов может достигаться различными способами.
Минимальные питательные среды
имеют строго определенный химический состав, что
достигается использованием высокоочищенных
синтетических компонентов.
Обычно содержат одно или несколько органических
веществ и набор минеральных солей.
Селективность достигается за счёт нехватки источников
энергии, аминокислот или витаминов для посторонних
микроорганизмов.
Например, среда, не содержащая триптофана, будет
ингибировать рост штаммов, не синтезирующих
самостоятельно триптофан.
Основными областями применения минимальных
питательных сред являются исследования метаболизма и
генетики бактерий.
минимальная среда М-9, в которой источником энергии и
углерода является глюкоза, а азота — NH4C1

8. Селективные (избирательные) питательные среды

• Питательные среды с нестандартным pH используются для
избирательного выделения ацидофильных или алкалифильных
микроорганизмов. Так, закисленные среды используются для выделения
представителей рода Lactobacillus, щелочные - для Vibrio cholerae.
Среда MRS
(аббревиатура фамилий
разработчиков) (рН 6,2)
для представителей рода
Lactobacillus
Среда ЛевенштейнаЙенсена (рН 5,9) для
Мycobacterium
tubercculosis
Рост Vibrio cholerae
на щелочном агаре
через 18 часов в
отраженном
свете.

9. Селективные (избирательные) питательные среды

• Питательные среды с селективными добавками содержат
различные вещества, токсичные для нежелательных микроорганизмов. Так,
среды с желчью (например, желчный бульон) используются для выделения
сальмонелл. Высокая концентрация соли позволяет селективно выделять из
биологического материала стафилококков. Часто в качестве селективных
добавок используются смеси антибиотиков.
ЖЕЛЧНЫЙ БУЛЬОН С
БРИЛЛИАНТОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ
2%
Среда содержит два
ингибитора роста
грамположительных и
некоторых
грамотрицательных
микрооганизмов краситель бриллиантовый
зеленый и бычья желчь.
Солевой агар для S. aureus
Желчный бульон 20%
Для выделения
сальмонелл

10. Селективные (избирательные) питательные среды

Среда Леффлера
(свернутая сыворотка
крови с сахарным
бульоном) эффективна для
дифтерийной палочки
Агар Сабуро
для обнаружения Candida и
плесневых грибов

11. Дифференциально-диагностические среды

• Состав данных сред подобран таким образом,
чтобы микроорганизмы с разными
физиолого-биохимическими свойствами
различались внешне по характеру роста -
окрашивали бы среду в разные цвета или
отличались бы по цвету колоний.
• Позволяют дифференцировать визуально
группы или виды бактерий по
ферментативной активности
• В основе дифференциально-диагностических
питательных сред могут лежать различные
принципы

12. Дифференциально-диагностические среды

• Среды, содержащие субстрат и индикатор -
позволяют определять способность бактерий
утилизировать соответствующие субстраты.
• Углеводы (например, сахароза, лактоза,
арабиноза) или многоатомные спирты (сорбитол,
маннитол, инозитол) могут подвергаться
брожению с образованием в качестве конечных
Среды Гисса
продуктов органических кислот. Поэтому их
(МПА, набор
использование в энергетическом метаболизме
углеводов,
приводит к закислению среды.
индикатор)
• Другие субстраты (лимонная кислота, мочевина,
аргинин, орнитин, лизин), напротив, могут
вызывать защелачивание питательной среды при
их расщеплении бактериями.
• Соответствующие изменения pH приводят к
Среда Симмонса для
изменению цвета добавленного в среду
определения способност
вещества-индикатора.
микроорганизмов
утилизировать цитраты

13. Дифференциально-диагностические среды

• Среды с хромогенными субстратами - содержат вещества,
которые дают окрашенные продукты при их расщеплении
бактериальными ферментами (например, X-Gluc расщепляется
бета-глюкуронидазами с образованием синего пигмента).
• Принцип действия основан на выявлении высокоспецифичных
ферментов у искомых микроорганизмов.
• К таким ферментам относятся, например, бета-Dглюкуронидаза Escherichia coli или бета-D-глюкозидаза
энтерококков.
Е.coli

14. Дифференциально-диагностические среды

• Среды для выявления продукции H2S - содержат SO42- или SO32в качестве источника серы, а также ионы железа.
Производимые бактериями ионы S2- в данных средах будут
образовывать черный нерастворимый сульфид железа.
• Например, среда Вильсон-Блэр, клостридиум агар
Часто используется комбинации перечисленных
подходов в одной питательной среде, что
позволяет дифференцировать сразу несколько
групп микроорганизмов(например, среда
Клиглера).
Наибольший спектр сочетаний предоставляет
использование хромогенных субстратов,
окрашивающихся в разные цвета.
На фото рост
клостридий на
среде ВильсонБлер

15. Содержит 1% лактозу, 0.1% глюкозу, тиосульфат натрия и сульфат железа, индикатор фенол рот. Посев по поверхности и уколом в столбик агара. При ф

Среда Клиглера:
Содержит 1% лактозу,
0.1% глюкозу, тиосульфат
натрия и сульфат железа,
индикатор фенол рот.
Посев по поверхности и
уколом в столбик агара.
При ферментации только
глюкозы - желтый
столбик, скошенная часть
не меняет окраску.
При ферментации и
глюкозы, и лактозы (E.coli)
- весь агар желтый
При образовании
сероводорода
(сальмонеллы, протей) -
агар чернеет

16. Среды с комбинированными свойствами

• Кровяной агар и его производные - являются одновременно
обогащенными и дифференциально-диагностическими питательными
средами.
В данных средах содержится 5-10% крови, которая стимулирует рост
различных прихотливых микроорганизмов.
Дифференциально-диагностические свойства проявляются как образование
зон гемолиза вокруг колоний некоторых микроорганизмов, хорошо
заметных на фоне непрозрачно-красного кровяного агара:
Альфа-гемолиз выглядит как зеленовато-коричневая зона, возникающая в
результате перехода гемоглобина в метгемоглобин (Streptococcus
pneumoniae).
Бета-гемолиз (полный гемолиз) представляет собой полное разрушение
эритроцитов и выглядит как прозрачная зона вокруг колонии (Streptococcus
pyogenes и Staphylococcus aureus).

17. Среды с комбинированными свойствами

• Желточно-солевой агар (среда Чистовича) -
используется для выделения золотистых
стафилококков, является одновременно
селективной и дифференциальнодиагностической питательной средой.
• Селективный компонент представлен
содержанием 7.5%-10% NaCl, что ингибирует рост
большинства бактерий за исключением
стафилококков.
• Дифференциально-диагностические свойства
обеспечиваются добавленным в среду яичным
желтком. Для Staphylococcus aureus характерна
продукция лецитиназы, которая расщепляет
лецитин желтка, что проявляется образованием
мутных венчиков вокруг колоний.

18. Среды с комбинированными свойствами


Маннит-солевой агар с феноловым красным (среда
Чапмена)- используется для выделения золотистых
стафилококков, является одновременно селективной и
дифференциально-диагностической питательной средой.
Селективный компонент представлен содержанием 7.5%10% NaCl, что ингибирует рост большинства бактерий за
исключением стафилококков.
Штаммы Staphylococcus aureus, вырастающие на этой
среде, ферментируют маннит и образуют желтые колонии,
окруженные зоной пожелтения среды.
Большинство коагулазоотрицательных стафилококков и
микрококков не ферментируют маннит и растут, образуя
мелкие красные колонии, окруженные красной или
лиловой зоной.
Цвет среды и колоний определяется реакцией индикатора
фенолового красного

19. Среды с комбинированными свойствами

• Среда Эндо - является одной из сред для выделения
представителей семейства Enterobacteriaceae, к которому
относятся бактерии родов Escherichia, Shigella, Salmonella,
Yersinia.
Состав: мясопептонный агар, лактоза,фуксин,сульфит
натрия (Na2SO3),
Принцип действия: фуксин обесцвечивается сульфитом
натрия и образуется бесцветная фуксинсернистая кислота
(реактив Шиффа)- селективный компонент, подавляет
рост грамположительных микроорганизмов.
Лактозо-негативные
• Лактоза в составе среды может сбраживаться многими
представителями Enterobacteriaceae до муравьиной
кислоты,которая реагирует с реактивом Шиффа, что
приводит к высвобождению фуксина, в результате чего
колонии и среда вокруг них окрашиваются в малиновокрасный цвет с металлическим блеском или без него.
• Исходный цвет среды - бледно-розовый
• лактозо-негативные (не сбраживающие лактозу) бактерии
образуют на ней прозрачные колонии,
• лактозо-позитивные - пурпурные с металлическим
Лактозо-позитивные
блеском.

20. Среды с комбинированными свойствами

• Среда Левина (EMB-агар- Eosin Methylene Blue Agar) - аналог
среды Эндо
• вместо фуксинсернистой кислоты содержит красители эозин и
метиленовый синий, формирующие темный осадок с
металлическим блеском при снижении pH вокруг лактозопозитивных колоний

Питательные среды. Классификация питательных сред. Методы посева и культивирования бактерий

16. Классификация микроорганизмов по источнику углерода

18. Классификация питательных сред

Питательные среды делят по консистенции,
составу, назначению.
В зависимости от консистенции различают жидкие
(мясопептонный бульон, сахарный бульон),
плотные (1-2% мясопептонный агар, свернутая
сыворотка), полужидкие (0, 2-0, 5%
мясопептонный агар) питательные среды. Для
получения П. с. плотной консистенции к жидкой
среде добавляют обычно агар-агар - полисахарид,
добываемый из морских водорослей, или желатин
- вещество белковой природы животного
происхождения.
По составу среды могут быть простыми и
сложными
В зависимости от назначения выделяют
элективные, среды обогащения,
дифференциально-диагностические.

19. Простые(универсальные, основные) питательные среды

мясо-пептонный бульон
(МПБ) — жидкая среда
мясо-пептонный агар
(МПА) — плотная среда
Обеспечивают рост
большинства бактерий
Служат основой для
приготовления сложных
сред

20. Сложные среды с повышенной питательной ценностью

Обогащенные
углеводами (сахарный
бульон/агар)
Обогащенные
белками (кровяной,
сывороточный, асцит
бульон/агар)
Рост гноеродного
стрептококка на кровяном
агаре(вокруг колоний видны
зоны гемолиза)

21. Элективные (избирательные) питательные среды

Обеспечивают преимущественный рост
определенной группы бактерий
Среда Леффлера
(свернутая сыворотка
крови с сахарным
бульоном) - эффективна
для дифтерийной палочки

22. Элективные (избирательные) питательные среды (продолжение)

23. Элективные (избирательные) питательные среды (продолжение)

24. Дифференциально-диагностические среды

Позволяют дифференцировать группы
или виды бактерий по ферментативной
активности
Среды Эндо, Левина, Плоскирева -
используются для выделения чистой
культуры энтеробактерий на 1 этапе;
позволяют дифференцировать бактерии,
способные и неспособные
ферментировать лактозу
Среды Гисса - используются на 3 этапе
выделения чистой культуры для
определения спектра сахаролитической
активности.

Среда Эндо
Состав: мясопептонный агар,
лактоза,фуксин,сульфит натрия
(Na2SO3),
Принцип действия: фуксин
обесцвечивается сульфитом натрия
(образуется бесцветная
фуксинсернистая кислота);
Энтеробактерии, сбраживающие
лактозу, в процессе брожения
выделяют муравьиную кислоту,
которая даёт цветную реакцию с
реактивами на альдегтды, в том числе
и с фуксинсернистой кислотой с
образованием свободного фуксина, в
результате чего их колонии
E. coli
окрашиваются в малиново-красный
ферментирует
цвет с металлическим блеском или без
лактозу
него.
Колонии бактерий, не
сбраживающих лактозу, имеют белый
или слабо-розовый цвет (цвет
питательной среды).
Salmonella и Shigella
не способны
ферментировать
лактозу

26. Среда Плоскирева

селективная среда для выделения шигелл
и сальмонелл.
В состав среды Плоскирева входят
ингибирующие вещества (желчные соли,
бриллиантовый зеленый, йод), вследствие
чего она должна полностью подавлять рост
грамположительной флоры, значительно
задерживать (первые 24 ч) рост эшерихий и
другой сопутствующей микрофлоры,
подавлять роение протея.
Дифференцирующие свойства агара
Плоскирева основаны на изменении рН в
кислую сторону при росте
лактозоферментирующих бактерий, которые
образуют колонии брусничного цвета
(индикатор нейтральный красный).
Лактозоотрицательные бактерии вырастают
в виде бесцветных или слабоокрашенных
колоний.

Среды Гисса :
Состав: МПА, набор
углеводов, индикатор
Принцип действия:
при ферментации
углевода
образующиеся кислые
продукты меняют рН,
при этом изменяется
окраска индикатора

28. Содержит 1% лактозу, 0.1% глюкозу, тиосульфат натрия и сульфат железа, индикатор фенол рот. Посев по поверхности и уколом в

Среда Клиглера:
Содержит 1% лактозу,
0.1% глюкозу,
тиосульфат натрия и
сульфат железа,
индикатор фенол рот.
Посев по поверхности и
уколом в столбик агара.
При ферментации
только глюкозы -
желтый столбик,
скошенная часть не
меняет окраску.
При ферментации и
глюкозы, и лактозы
(E.coli) - весь агар
желтый
При образовании
сероводорода
(сальмонеллы, протей)
- агар чернеет

29. Дифференциально-диагностические среды (продолжение)

Среда Симмонса для
определения
способности
микроорганизмов
утилизировать
цитраты
Окислительноферментативные
среды для
опледеления типа
дыхания бактерий

Выделение отдельных видов бактерий из
исследуемого материала, содержащего, как правило,
смесь различных микроорганизмов, является одним из
этапов любого бактериологического исследования,
проводимого с различными целями: диагностики
заболеваний, определения микробной обсемененности
окружающей среды и т.д.
Для выделения чистой культуры применяют методы,
основанные на:
1) механическом разобщении бактериальных клеток
(см.метод Дригальского);
2) предварительной обработке исследуемого
материала с помощью физических или химических
факторов, оказывающих избирательное
антибактериальное действие;
3) избирательном подавлении размножения
сопутствующей микрофлоры физическими или
химическими факторами во время инкубации посевов;
4) способности некоторых бактерий быстро
размножаться в организме чувствительных к ним
лабораторных животных (биопробы)

31. Определение числа бактерий

Общее число клеток определяется а) путем
Число живых клеток определяется по числу
подсчета клеток под микроскопом в
окрашенном мазке б) по бактериальному
стандарту (набор эталонов для определения
концентрации бактериальных клеток в
микробной взвеси по ее мутности;
представляет собой запаянные пробирки,
содержащие водную взвесь мелких частиц
стекла пирекс).
колоний, образуемых жизнеспособными
клетками

Читайте также: