Протеинкиназы регулирующие вступление клетки в митоз

Обновлено: 27.04.2024

Большая группа ферментов, объединенная под названием “протеинкиназы”, катализирует перенос концевого остатка фосфата с АТФ на различные группы в структуре белка. Протеинкиназы разделены на пять больших классов в зависимости от того, на какие группы в структуре белка переносится остаток фосфата. Протеинкиназы первого класса переносят фосфат на спиртовые группы серина и треонина. Протеинкиназы второго класса переносят фосфат на спиртовые группы тирозина. Протеинкиназы третьего класса образуют фосфоамидные связи, перенося остаток фосфата на атомы азота гистидина, лизина или аргинина. Протеинкиназы четвертого класса фосфорилируют остатки цистеина в структуре белка. Наконец, протеинкиназы пятого класса способны фосфорилировать остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Протеинкиназы, фосфорилирующие спиртовые группы серина, треонина и тирозина, наиболее подробно исследованы и имеют много общего в структуре и свойствах.

В ходе реакции, катализируемой протеинкиназами двух первых классов, нейтральная спиртовая группа белка превращается в сложный эфир, несущий большой отрицательный заряд. Введение отрицательного заряда в ранее нейтральную область может приводить к значительным изменениям в структуре белка, а значит, и к изменению его свойств.

Простая химическая модификация молекулы белка, происходящая под действием протеинкиназ, является эффективным и широко распространенным способом регуляции активности многих ферментов и других внутриклеточных белков. Остаток фосфорной кислоты, перенесенный протеинкиназой на спиртовую группу белка, может быть удален под действием другого фермента – фосфатазы. Таким образом, протеинкиназы и фосфатазы образуют две группы ферментов-антагонистов, способных осуществлять обратимую ковалентную модификацию белков-мишеней и тем самым регулировать их активность.


Рис. 1 Обратимая ковалентная модификация белков-мишеней,

Протеинкиназы относятся к группе сложно устроенных ферментов, так как они должны взаимодействовать , как минимум, с двумя субстратами. Протеинкиназы должны иметь специальный центр связывания АТФ или других нуклеозидтрифосфатов, которые используются в качестве доноров остатков фосфата, а также специальный центр связывания белка-субстрата, на который осуществляется перенос фосфатной группы.

Для того чтобы осуществить перенос фосфата с АТФ на белок, нужен специальный активный центр, содержащий определенные аминокислотные остатки, которые непосредственно участвуют в переносе фосфата от АТР на белок. Два субстрат связывающих участка (участок связывания АТФ и участок связывания белка-субстрата) должны располагаться поблизости и быть соответствующим образом ориентированы относительно друг друга. Только в этом случае становится возможным эффективный перенос остатка фосфата. Субстрат связывающие участки должны обладать достаточно высокой специфичностью.

Регуляторные участки протеинкиназ крайне разнообразны, поэтому активность этих ферментов может точно и тонко регулироваться. Вследствие всех перечисленных свойств протеинкиназы играют исключительно важную роль в передаче сигнала внутрь клетки.


Рис.2 Общая схема строения протеинкиназ

Субстратами протеинкиназ являются белки ионных каналов, ферменты, регулирующие метаболические процессы, белки рибосом, ядерные белки, белки цитоскелета и т.д.

Протеинкиназы регулирующие вступление клетки в митоз

Регуляция вхождения клетки в клеточный цикл

• Деление клеток не является непрерывным процессом и контролируется внешними стимулами и наличием питательных веществ

• Клетки узнают химические сигналы в своем окружении

• Внешние сигналы могут вызывать в клетке биохимический ответ, который приводит или к ее вхождению в цикл, или к остановке цикла в фазе G1/G0

Здоровые клетки пролиферируют только при наличии подходящих условий. В случае одноклеточных организмов, необходимые условия для пролиферации создаются при наличии питательных компонентов. Для клеток многоклеточных необходимость вступления в цикл деления определяется дополнительными факторами клеточного окружения. Такие внешние сигналы могут обладать активирующими или ингибирующими свойствами. Каким образом все эти сигналы реализуются и интегрируются в машину клеточного цикла?

Пептиды и гормоны, которые стимулируют пролиферацию, называются ростовыми факторами. Эти факторы находятся в сыворотке крови, что и объясняет ее использование в средах для культивирвоания клеток in vitro. Одним из первых идентифицированных ростовых факторов сыворотки был пептид, названный тромбоцитарным фактором роста (PDGF). Этот фактор выделяется тромбоцитами при свертывании крови и способствует быстрой пролиферации клеток, необходимой для заживления ран.

PDGF и другие ростовые факторы связываются со специфическими рецепторами на поверхности клеток-мишеней. Эти рецепторы связаны с процессами внутриклеточной системы передачи сигнала, которые индуцируют пролиферацию.

Каким образом ростовые факторы вызывают стимуляцию активности CDK, необходимую для коммитирования вступления клетки в S-фазу и митоз? После связывания фактора роста и активации рецепторов происходит множество биохимических процессов, и в клетке образуются вторичные мессенджеры. В конце концов, как показано на рисунке ниже, это приводит к изменениям экспрессии генов. Набор генов, которые экспрессируются вскоре после добавления к клеткам сыворотки, называют генами раннего ответа.

Многие из них, кодирующие факторы транскрипции, например Fos, Jun и Мус, которые активируют другие гены, называются замедленными генами раннего ответа. Одним из таких генов является ген, кодирующий G1-циклин, циклин D. Хотя активация CDK в ответ на воздействие факторов роста также требует прохождения других процессов, стимуляция экспрессии циклина D представляет собой важнейший механизм продвижения клеток через переход G1/S.

CDK и связанные с ними G1-циклины способствуют прохождению клетки через точку рестрикции за счет фосфорилирования супрессора опухоли ретинобластомы (Rb), который связывается с фактором транскрипции E2F и ингибирует его. Фосфорилирование Rb комплексом G1 CDK-циклин (главным образом, циклин D, связанный или с Cdk4 или с Cdk6) приводит к его отщеплению от E2F. Активный E2F теперь стимулирует свою собственную экспрессию, а также экспрессию других генов. К этим генам относятся циклин Е, белки инициации репликации, и другие белки, участвующие на поздних стадиях клеточного цикла.

Cdk2-циклин Е также фосфорилирует Rb, что усиливает эффект первоначального выхода Rb из комплекса с E2F. Таким образом, небольшая исходная активность CDK может привести к существенному увеличению уровня и активности G1 CDK-циклиновых комплексов. Процессы регуляции Rb и E2F CDK-циклиновым комплексом схематически представлены на рисунке ниже. Утрата функциональной активности Rb играет важную роль в развитии опухолей.

Таким образом, общие характерные свойства циклин-зависимых киназ проявляются на разных стадиях клеточного цикла. Однако, как мы увидим, при репликации эта зависимость клеточного цикла связана с дерегуляцией отдельных точек начала репликации ДНК на хромосомах.

Связывание лиганда с рецептором на наружной мембране клетки приводит к димеризации и к активации рецептора.
В представленном примере рецептор Tyr-киназы, рецептор PDGF, подвергается внутримолекулярному фосфорилированию,
что активирует адаптерные белки Shc, Grb2 и SOS. Эти белки активируют ГТФазу, называемую Ras.
В результате происходит активация сигнального каскада киназ, включающего киназы RAF, MEK и ERK,
которые, в конце концов, активируют транскрипцию.
При этом индуцируется экспрессия генов, регулирующих пролиферацию и прохождение клеток через точку рестрикции, что обеспечивает вступление клетки в цикл деления. Связывание Rb фактором транскрипции E2F приводит к инактивации последнего.
Когда Rb фосфорилируется, он не может связываться с фактором и таким образом обеспечивает ему возможность положительно регулировать экспрессию многих генов,
включая свой собственный, а также ген циклина Е.
Затем Cdk2-циклин Е может фосфорилировать большее количество Rb, что приводит к петле усиления.
Когда накапливается достаточно Cdk-циклина Е, клетка проходит точку рестрикции.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Морфологические изменения клетки в митозе

• При вступлении клетки в митоз сильно меняется структура ядра и цитоскелета

• В прохождении таких событий митоза, как разрыв ядерной оболочки, конденсация и сегрегация хромосом, сборка веретена и цитокинез, необходимо участие митотических киназ

Мы рассмотрели свойства представителей четырех семейств протеинкиназ, которые необходимы для инициации митоза и прохождения клетки через эту стадию цикла. Какие функции выполняют эти киназы в митозе?

Пока современные исследования только пытаются дать ответ на этот вопрос. Вхождение клетки в митоз сопровождается множеством морфологических и биохимических изменений, и все они происходят с участием киназ. В данной статье мы рассмотрим основные события митоза, которые находятся под контролем этих киназ. Приведем известные примеры роли киназ в конкретных процессах и обсудим общие свойства этих ферментов.

Одним из наиболее существенных изменений, наступающих в клетках эукариот при митозе, является разрушение барьера между ядром и цитоплазмой. При этом происходит разрушение ядерной оболочки и диссоциация ядерной ламины, структуры, придающей жесткость клеточному ядру.

Основные изменения происходят в структуре цитоскелета при вступлении клетки в митоз. К числу их относится образование митотического веретена. В течение всего клеточного цикла в клетке присутствуют микротрубочки, которые представляют собой полимеры, состоящие из димеров а- и b-тубулина. В интерфазе, центросома (аналог полярного тельца веретена у дрожжей) организует микротрубочки в длинные цитоплазматические филаменты.

Эти филаменты в митозе разбираются, центросомы расходятся (они дуплицировались в клеточном цикле раньше), и между ними образуется биполярное веретено, состоящее из микротрубочек.

Хромосомы присоединяются к концам микротрубочек веретена и затем связываются с центросомами. Место прикрепления микротрубочек к хромосоме называется кинетохором. Поскольку каждая сестринская хроматида имеет свой кинетохор, который связывается с микротрубочками, исходящими из противоположно расположенных центросом, в митозе происходит равномерная сегрегация сестринских хроматид.

Звездообразные (астральные) структуры микротрубочек вокруг каждой центросомы также образуются в митозе и взаимодействуют с клеточным кортексом. Эти структуры помогают позиционированию центросом, которые, в свою очередь, определяют ориентацию митотического веретена в клетке. В большинстве клеток плоскость деления задается положением веретена, и ее можно изменить, сдвинув его от центра.

Это происходит в определенные моменты развития многоклеточных организмов. При этом образуются дочерние клетки с неодинаковым составом и с разной дальнейшей судьбой.

К двум другим важным структурам, образующимся в митозе, относятся центральное веретено и остаточное тельце. Центральное веретено представляет собой просто середину веретена. В анафазе оно состоит из чередующихся концов микротрубочек, прикрепленных к противоположным центросомам. Эти микротрубочки не контактируют с кинетохорами, а связываются вместе антипараллельно. Остаточное тельце образуется из остатков центрального веретена в цитокинезе. Так же как и центросома, остаточное тельце содержит множество сигнальных молекул.

Морфологические изменения клетки в митозе

Ядерная ламина, состоящая из филаментных белков ламина А и В, подстилает ядерную оболочку в интерфазе.
ДНК хромосом находится в деконденсированном состоянии; ЭПР тубулярного характера и связан с ядерной оболочкой.
При наступлении митоза, ламин фосфорилируется киназой Cdk, что приводит к деградации ядерной ламины и оболочки ядра.
ЭПР также изменяет свое состояние, распадаясь на везикулы.
Происходит конденсация хромосом, и область их кинетохоров прикрепляется к микротрубочкам веретена, выходящим из центросом.
Происходит ошаривание самой клетки.

Во время митоза происходят также сильные изменения актинового цитоскелета. Актин представляет собой важнейший компонент цитоскелета, который в интерфазной клетке организован в цитоплазматические волокна. После вхождения клетки в митоз актин концентрируется в медиальной области клетки для подготовки к цитокинезу и образует борозду деления или кольцо цитокинеза.

Борозда деления состоит не только из актина, но содержит более 50 разных белков, которые регулируют образование актиновых нитей, их сборку, подвижность и оборот и активность которых определяет инвагинацию борозды деления.

Как можно ожидать, четыре основных киназы митоза участвуют во многих аспектах морфологических изменений клетки и реорганизации цитоскелета. Классическим примером является CDK, участвующая в разрушении ядерной оболочки. Ядерная ламина состоит из двух белков, ламина А и ламина В. Ламин А содержит сайты фосфорилирования, которое происходит с участием Cdk1 киназы.

Как показано экспериментально, мутации по этим сайтам, приводящие к образованию нефосфорилируемых остатков Ала, препятствуют диссоциации ламины. Таким образом, в результате этих исследований была установлена роль Cdk1 в одном из ранних событий митоза. На рисунке ниже представлена схема регуляции состояния ядерной ламины с участием Cdk1.

Протеинкиназы в митозе выполняют несколько функций, и они обнаружены во многих частях клетки. Одним из важных мест их локализации служат центросомы. Наряду с выполняемой ими ролью центров организации микротрубочек, центросомы являются сигнальными центрами, в которых накапливаются регуляторы клеточного цикла и их субстраты. Таким образом, сигналы клеточного цикла могут быстро интегрироваться, генерируя соответствующий морфологический ответ.

На центросомах локализованы все представители семейства Cdk1-циклина, Plk, Aurora и NIMA Исследования на моделях с выключенными функциями киназ показали, что они регулируют дупликацию и расхождение центросом. Более того, на центросомах были идентифицированы субстраты каждой киназы.

Например, Aurora А участвует в функционировании центросом и в их изменениях, обеспечивающих нуклеацию микротрубочек (созревание центросом) и сборку веретена. Также Aurora А направляет в центросому факторы, которые играют критическую роль в нуклеации микротрубочек.

Aurora А служит примером динамической локализации ферментов, которая свойственна большинству протеинкиназ митоза. Вместе, по меньшей мере, с тремя другими белками, а именно INCENP, Survivin и Borealin, Aurora В в анафазе мигрирует с кинетохора в центр веретена и затем в область расположения остаточного тельца в делящихся клетках. Из-за своей характерной миграции с хромосом в середину веретена эти белки получили название белки-пассажиры хромосом.

В отсутствие любого компонента комплекса, хромосомы надлежащим образом не конденсируются, не выравниваются в метафазной пластинке и не связываются с обеими центросомами.

Ключевой функцией Aurora В и других белков-пас-сажиров, расположенных на кинетохорах, является удаление связей между кинетохором и микротрубочками веретена, которые не приводят к развитию напряжений на обоих кинетохорах, т. е. удаление прикреплений, не являющихся биполярным. Вместе с тем, клетки с отсутствующими функциями какого-либо из белков пассажиров не вступают в цитокинез, поскольку киназа Aurora В необходима для организации центрального веретена и борозды деления.

Хотя расположение Plks и Cdk1 отличается от такового для Aurora В, локализация этих белков в митозе также носит динамический характер, обеспечивающий их взаимодействие с соответствующими мишенями.

Поскольку протеинкиназы играют критическую роль в митозе и цитокинезе, для идентификации их субстратов были использованы различные методы. Таким образом, удается понять молекулярные механизмы митоза. Особенно много внимания уделяется поиску субстратов комплекса Cdk1-циклин. Одним из специфических свойств микротрубочек, которое особенно проявляется в митозе, является быстрая скорость их роста и диссоциации. Это свойство обозначается термином динамическая нестабильность.

Динамическая нестабильность микротрубочек и свойства их моторных белков играют важную роль в процессе сегрегации хромосом. Cdk1 регулирует свойства митотического веретена, фосфорилируя молекулярные моторы, связанные с микротрубочками. К числу субстратов этой киназы также относятся белки, управляющие процессом конденсации хромосом, а также фрагментацией и компартментализацией аппарата Гольджи.

Суммируя изложенные сведения о вхождении клетки в митоз, и о самом процессе митоза, отметим, что в ядре и цитоплазме клеток эукариот при этом происходят различные морфологические изменения. Большинство этих изменений вызваны фосфорилированием соответствующих белков киназами митоза. Примерами являются разборка ядерной ламины, конденсация хромосом, реорганизация актинового цитоскелета, сборка и разборка митотического веретена и компартментализация аппарата Гольджи.

Видео процесс и фазы митоза

• Во многих эукариотических клетках основной контрольной точкой служит переход от G2 в М-период цикла

• С переходом G2-M связана активация нескольких протеинкиназ

G2-фаза клеточного цикла связана с подготовкой клетки к митозу. В течение этой фазы большинство клеток растет, и, таким образом, после деления у них сохраняется постоянное ядерно-цитоплазматическое отношение. Во время этой фазы, т. е. до момента вступления клетки в митоз и начала сегрегации хромосом, также узнаются и корректируются ошибки репликации ДНК. Как клетки начинают митоз, когда завершились все процессы? В настоящем разделе мы рассмотрим роль протеинкиназ во вступлении клетки в митоз.

Основной киназой митоза, способствующей переходу G2-M, является комплекс Cdk1-циклин В. По мере накопления митотических циклинов, они связываются с Cdk1. Комплекс накапливается, однако он находится в неактивном состоянии, поскольку белок фосфорилирован при участии представителя семейства киназ Weel. Если в клетках отсутствует активность Weel, то Cdk1 не подавляется. При этом вступающие в митоз клетки достигают небольшой величины, т. е. являются wee. Киназа Mik1 является гомологом Weel и участвует в фосфорилировании и ингибировании активности Cdk1 при пролонгировании S-фазы. Гомолог Weel, Myt1, локализован исключительно в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), в то время как другие представители этого семейства находятся в клеточном ядре. Эти киназы фосфорилируют тирозиновый (Tyr15) или расположенный рядом треони-новый остаток (Thrl4), что приводит к ингибированию активности фермента.

Дефосфорилирование остатков Tyr15 или Thr14 контролирует активацию Cdk1 и вход в митоз. Этот процесс осуществляется Cdc25 фосфатазой. У делящихся дрожжей ген cdc25, в отличие от weel, является необходимым. Если фосфатные группы не удаляются, то митоз не наступает Для гарантии в клетках млекопитающих присутствуют три разных изоформы Cdc25, которые обеспечивают наступление этого ключевого процесса.

В клетках высших эукариот наиболее подробно исследован один из этапов активации Cdk1, протекающий с участием Cdc25. В этих клетках активация Cdc25 происходит с участием Polo-киназ (PLKs), представителей семейства, отличающегося от CDK. После активации Cdc25 с участием PLK и последующего увеличения активности Cdk1 дальнейшая активация Cdc25 происходит под действием самой Cdk1. Такая форма положительной обратной связи при активации Cdk1 приводит к сильному увеличению активности киназы, что приводит клетку к вступлению в митоз. Активность Weel также отрицательно регулируется за счет фосфорилирования Cdk1 с тем чтобы обеспечить резкую активацию Cdk1, необходимую для вступления клетки в митоз. На рисунке ниже схематически представлены процессы активации Cdk1.

У многоклеточных эукариот вхождение клетки в митоз и сам митоз находятся под контролем двух различных CDK-циклиновых комплексов. Например, в клетках млекопитающих Cdk1-циклин А регулирует некоторые процессы в митозе, включающие конденсацию хромосом и их выстраивание у митотического веретена. Варианты циклина В, обладающие разной локализацией и периодически меняющие активность в цикле, вероятно, регулируют другие процессы митоза за счет фосфорилирования различных субстратов. В результате многолетних исследований было найдено много субстратов Cdk1, некоторые из них являются реальными кандидатами на роль эффекторов Cdk1 в митозе.

Хотя Cdk1 считается основным регулятором митоза, другие представители семейства киназ также играют важную роль в различных митотических процессах, и в настоящем разделе мы рассмотрим три группы таких киназ. К их числу относится уже упомянутое выше семейство PLK. Впервые эти киназы были обнаружены в мутантах Drosophila, у которых были нарушены некоторые процессы митоза, а в дальнейшем PLK были найдены в клетках многих эукариот, где они выполняют роль пускового фактора митоза, участвуют в созревании центросом, образовании веретена, сегрегации хромосом и в цитокинезе. В то время как геном Drosophila и дрожжей кодирует только одну киназу, в клетках позвоночных образуется до четырех разных представителей семейства PLK. При этом наиболее функционально близким к ферменту дрожжей и Drosophila является Plk 1. Все ферменты содержат N-концевой киназный домен и С-концевой участок, включающий одну или несколько консервативных последовательностей, которые называются доменами Polo (или Polo boxes). Строение концевых участков и активация PLK показаны на рисунке ниже.

Активация CDK

Фосфорилирование Cdk1 подготавливает фермент к активации, однако он поддерживается в неактивном состоянии.
Polo- киназы (Plks) активируют фосфатазу Cdc25, которая затем активирует небольшое количество Cdk1, удаляя фосфатные группы.
После активации эта киназа фосфорилирует Cdc25, что приводит к увеличению уровня активного фермента.
Наряду с этим, при активации некоторого количества Cdc1 она фосфорилирует и инактивирует Weel.
Этот цикл аутоамплификации приводит к резкой активации Cdc1.

Домены Polo выполняют роль внутриклеточных функциональных доменов и участвуют в позиционировании киназ на многочисленных сайтах причаливания, расположенных на центросомах, кинетохорах (белковые структуры, связывающие хромосомы с концами микротрубочек), митотическом веретене и цитокинетическом кольце. Эти домены связываются с мотивом фосфо-Сер/Трео-Про, который представляет собой фосфорилированную консенсусную последовательность в Cdk1 и в других киназах, обладающих сродством к пролин-содержащим сайтам, таких как МАР киназы. Эти данные позволяют предполагать, что PLK присоединяются к белкам, которые предварительно были фосфорилированы Cdk1 или другими киназами, хотя возможно, что in vivo сайты причаливания PLK получают дополнительную информацию от присоединяемых компонентов. Такой механизм мог бы обеспечить координацию активности различных митотических киназ, а также совместную регуляцию Plk1 и других протеинкиназ. Он также помог бы объяснить, почему в митозе PLK активируются параллельно или вслед за Cdkl и другими киназами. По-видимому, в различных сайтах для PLK существует множество субстратов. Все известные субстраты принимают участие в формировании веретена и в цитокинезе.

Еще одна группа киназ , участвующих в митозе, представлена семейством NimA-подобных киназ (NEK). Эти ферменты были обнаружены у A. nidulans. История открытия NEK хорошо иллюстрирует тезис о том, насколько важно использовать различные организмы для исследования процессов, контролирующих клеточный цикл. Каждый из объектов исследования обладает своими особенностями, а в совокупности они обеспечивают получение разнообразной ценной информации. Мутанты nimA организма A nidulans заблокированы в С2-периоде, хотя активность Cdk1 в клетках высока. Это говорит о том, что самой по себе активации Cdk1 еще недостаточно для наступления всех событий митоза. Действительно, оказалось, что активность NIMA в митозе меняется параллельно с изменением активности Cdk1. После секвенирования первой обнаруженной киназы гомологичные NEK были найдены в клетках многих эукариот, и было продеменстрировано их участие в нескольких событиях митоза, включая конденсацию хромосом и расхождение центросом.

Третья группа киназ, которая привлекла внимание исследователей в связи с участием в процессах митоза, представлена семейством Aurora. Так же как Cdkl и PLK, киназы Aurora участвуют во многих процессах, включая конденсацию и сегрегацию хромосом, функционирование кинетохора, созревание центросом, образование веретена и цитокинез. Киназы Aurora впервые были обнаружены в почкующихся дрожжах, где они представлены одной киназой. Однако впоследствии было показано их присутствие в клетках многоклеточных эукариот и человека, где они принадлежат к одной из трех следующих групп: Aurora А, В, или С.

Все ферменты семейства Aurora имеют общую структуру: киназному домену предшествует N-концевой домен, а после киназного домена расположен небольшой С-концевой участок. Уровень Aurora А увеличивается на ранней стадии митоза, а при наступлении анафазы он понижается. Снижение содержания фермента, так же как и в случае циклинов, обусловлено его протеолизом с участием убиквитина. Активность Aurora А также регулируется за счет ее фосфорилирования по сайту, расположенному в Т-петле. Как и для Cdk1, это фосфорилирование играет существенную роль в активации Aurora А, и процесс находится под контролем нескольких, пока неполностью охарактеризованных белков. В регуляции активности киназы Aurora А, и, вероятно, Aurora В также участвует протеинфосфатаза 1 (РР1).

Хотя очевидно, что киназы Aurora необходимы для процессов митоза, предстоит еще многое выяснить об их регуляции и о деталях механизма действия. Также неясно, каким образом активность киназ Aurora связана с активностью других киназ, принимающих участие в митозе. Например, неизвестно, функционируют ли они в митозе параллельно, по отдельности или в сочетании с другими киназами.

К числу важнейших выводов, полученных в результате исследований киназ Aurora, относится признание того, что эти ферменты, вероятно, участвуют в генезе опухолей. Опухоли многих типов содержат повышенный уровень киназ Aurora, и гиперэкспрессия Aurora А может приводить к злокачественной трансформации клеток грызунов. Хотя механизм этого явления неизвестен, гиперэкспрессия фермента, вероятно, вызывает амплификацию центросом и дефекты сегрегации хромосом. Более того, считается, что ген, кодирующий Aurora А, обусловливает предрасположенность к развитию рака.

Обобщая все изложенное выше, отметим, что инициация митоза и прохождение клетки через эту стадию цикла требуют функционирования CDK, Plk, NEK и протеинкиназ семейства Aurora. Поскольку активность этих киназ играет критическую роль в поддержании целостности генома, активность каждой киназы регулируется тщательным образом с тем, чтобы избежать несвоевременной активации и обеспечить своевременную ее инактивацию. Накапливаются данные, свидетельствующие о зависимости активности Plk от присутствия других киназ, особенно CDK.

Киназы Polo

Киназы семейства Polo обладают N-концевым киназным доменом и С-концевым участком,
содержащим два консервативных домена, называемых Polo-домены (РВ1 и РВ2).
Эти домены участвуют в узнавании киназой своих внутриклеточных партнеров.

Клеточный цикл контролируется путем взаимодействия трех типов
белков: циклинзависимые киназы (Cdk), циклины
- белки, взаимодействующие с Cdk c образованием комплексов
и ингибиторы комплексов Cdk-циклин.

Циклинзависимые киназы (Cdk) - ферменты фосфорилирующие другие
белки, изменяют их функцию. Клеточный цикл контролируется изменением
активности Cdk, которая регулируется периодическим образованием
и распадом их регуляторных субъединиц - циклинов. Смена синтезов
и разрушений различных циклинов обеспечивает переходы и протекания
различных фаз клеточного цикла. При этом концентрация Cdk
постоянна в течении всего клеточного цикла. В разные фазы
клеточного цикла образуются разные циклины, которые связываясь
с Cdk образуют различные Cdk-циклиновые комплексы. Эти комплексы
регулируют разные фазы клеточного цикла и поэтому называются
G1-, G1/S- , S- и М-Cdk (рис.1).

рис.1 Концентрации различных комплексов Cdk-циклин
в клеточном цикле.

Контрольные точки клеточного цикла

1. Точка выхода из G1-фазы, называемая
Старт - у млекопитающих и точкой рестрикции
у дрожжей. После перехода через точку рестрикции R в конце
G1 наступление S становится необратимым, т.е. запускаются
процессы ведущие к следующему делению клетки.
2.
Точка S – проверка точности репликации.
3.
Точка G2/M-перехода – проверка завершения репликации.

4. Переход от метафазы к анафазе митоза.

Контроль различных этапов клеточного
цикла


ARC подавляет S- и M-циклины и не подавляет G1/S-циклины.

В G1-фазе работают различные ингибиторы Cdk.

Внутренние и внешнии сигналы приводят к образованию G1/S-
и S-циклинов и активации G1/S–Cdks.

Активность G1/S–Cdk увеличивается потому что G1/S циклины
не атакуются APC и потому что G1

Cdk ингибиторы так же не действуют на G1/S–Cdks
(у мух и дрожжей) или удаляются от G1/S–Cdks другими
механизмами (у млекопитающих).

S-Cdk инактивирует ингибиторы Cdk и подавляет ARC, которые
в G1-фазе подавляли S-Cdk. S-Cdk фосфорилируют
различные белки, что ведет к началу дупликации ДНК и S-фазы.
После начала S-фазы S/G1-Cdk обеспечивают собственную
инактивацию.

В конце S-фазы, в G2-фазе начинают накапливаться
М-Cdk, приводящая к вступлению клетки в митоз. М-Cdk активирует
ARC-комплекс, управляющий метафазно-анафазным переходом. Основная
функция ARC-комплекса состоит в разрушении когезинов, приводящее
к началу расхождения хромосом

Циклин зависимые киназы Cdk1-5 в клетках млекопитающих

Cdks активируется при связывании с циклинами (так же как фосфориляция
и дефосфориляция киназ). Cdks-фосфорилируют белки участвующие
в кл цикле

M-phase Cdk (M-Cdk) запускают каскад белковых фосфориляций,
запускающих М-фазу к.ц. (конденсация хромосом, разрушение
ядра, перестройка АГ иЭР, потеря адгезии с большинством других
клеток и внеклеточному матриксу, реорганизация цитоскелета)

anaphase-promoting complex (APC) регулятор митоза – инициация
разделения и расхождения хромосом и инактивация М-Cdk в конце
митоза

При выходе из G0 под действием факторов роста начинает
синтезироваться Cdk2-циклинD: распознает в-ва, регулирующие
ферменты синтеза белков, необходимых для репликации ДНК. В
это же время выявляются Cdk4-циклинD, и Cdk5циклинD

циклин-cdks
запускает М-стадию кц, деградация циклина снижает активность
cdks

Cdk2-циклинE появляется в G1 и достигает max
на границе G1-S, после чего его концентрация
резко снижается

Cdk2-циклинА появляется в промежутке G1-S и присутствует
в высокой концентрации на протяжении S

Сdk2-циклинB в конце G2 до М – резко разрушается

в каждой стадии синтезируются свои циклины M-циклины запускают
события митоза, G1/S-циклины – связывают цзк
в конце G1 подготавливает кл к S-фазе, S-циклины
– связывают цзк, запуская репликацию, G1-циклины
обеспечивают прохождение через точку рестрикции.

Регуляция репликации

Перед началом репликации Sc ORC-комплекс (origin recognition
complex) садится на ori - точку начала репликации. Cdc6 представлен
во всем клеточном цикле, но его концентрация возрастает вначале
G1, где он связывается c ОRC комплексом, к которому затем
присоединяются Mcm белки с образованием pre-replicative complex
(pre-RC). После сборки pre-RC клетка готова к репликации.

Для инициации репликации S-Cdk соединяется с протеинкиназой
(?), которая фосфорилирует pre-RC. При этом Cdc6 диссоциирует
от ОRC после начала репликации и фосфорилируется, после чего
убиквитинируется SCF и деградирует. Изменения в pre-RC препятствуют
повторному запуску репликации. S-Cdk так же фосфорилирует
некоторые Mcm белковые комплексы, что запускает их экспорт
из ядра. Последующая дефосфориляция белков вновь запустит
процесс образования pre-RC.

Регуляция митоза

В эмбриональных клетках синтез М-циклина постоянен во всем
клеточном цикле и накопление его происходит из-за уменьшения
деградации. У большинства клеток М-циклин синтезируется во
время G2 и М-фаз. Накопление циклина ведет к накоплению M-Cdk.
Cdk ингибируется, фосфорилируясь протеинкиназой Wee1. Активация
Cdc25 в поздней G2 дефосфорилирует M-Cdk, так же происходит
репрессия Wee1. Две протеинкиназы фосфорилируют Cdc25 – Polo
kinase и M-Cdk. M-Cdk так же фосфорилирует и ингибирует Wee1.
Способность M-Cdk активировать свой собственный активатор
(Cdc25) и ингибировать свой собственный ингибитор (Wee1) предполагает,
что активация M-Cdk в митозе резко усиливается при наличии
такой позитивной обратной связи. Малое количество активированных
Cdc25 активируют M-Cdk, которые активирует еще больше Cdc25
и супрессируют Wee1. Это приводит к большей дефосфориляции
M-Cdk и активации и тд. Такой механизм обеспечивает полную
активацию всех M-Cdk

Фосфорилирование ламинов M-Cdk приводит к их деградации. М-Cdk
фосфорилирует несколько субъединиц конденсинов, запуская конденсацию
хромосом.

M-Cdk фосфорилирует различные белки, запуская реорганизацию
микротрубочек и другие события ведущие к организации веретена
деления.

Циклин-зависимые
киназы

G1/S, S, возможно М

В животных клетках имеются, по крайней мере, 7 различных
Cdk. Cdk1,2,4,6 напрямую участвуют в регуляции клеточного
цикла, тогда как остальные фосфорилируют другие Cdk и называются
Cdk-активирующие киназы (CAK).

Cdk7,8,9 являются регуляторами РНК полимеразы II. Cdk5 участвует
в дифференцировке нервных клеток.

У дрожжей Sc и Sp все события клеточного цикла контролируются
одной Cdk1. У многоклеточных организмов события контролируются
Cdk1 и Cdk2. Также у высших эукариот имеются Cdk4 и Cdk6
которые регулируют клеточный цикл в ответ на внеклеточные
сигналы.

Cdk фосфорилируют сотни различных белков по сериновым (S)
или треониновым (T) аминокислотным остаткам. Cdk узнает
мотиф другого белка по которому необходимо фосфорилировать:
[S/T*]PX[K/R], где S/T*- место фосфорилирования, X – любая
аминокислота, K/R-основные аминокислоты лизин (K) или аргинин
(R).

В отсутствии циклина активный центр Cdk заблокирован.

Cdk состоит из нескольких доменов: Т-петля (инактивирующая
петля) – закрывает активный центр в отсутствии циклина.
L12 helix, PSTAIRE helix.

Циклины

Вид G1 G1/S S M
S.cerevisiae Cln3

Циклины - цитоплазматические белки. Разрушение циклинов
происходит в протеосомах (см. обзор Протеасомы). Циклин
B – белок киназный домен, регуляторная субъединица. Начинает
синтезироваться в G1, достигает max в S и ранней профазе
и быстро разрушается в начале анафазы М. Когда концентрация
регуляторной субъединицы возрастает – активируется киназный
домен. Фосфорилирование специфических белков приводит к
компактизации х-м, разрушению ядерной об-ки и сборке веретена.

Циклин фосфорилирует сериновые и треониновые остатки ламинов
вызывая их деполимеризацию, фосфорилирует гистон H1, участвует
в фосфорилировании блокирующим везикулярный транспорт –
разрушение ЭПР и АГ, фосфорилирует участок легкой цепи миозина,
ингибируя АТФ-азную активность и связывание с F-актином
– блокировка цитокинеза в раннем митозе. После разрушения
циклина белки дефосфорилируются.

Циклины – активаторы Cdk. Циклины, так же как и Cdk вовлечены
в различные, помимо контроля клеточного цикла, процессы.
Циклины разделяются на 4 класса в зависимости от времени
действия в клеточном цикле: G1/S, S, M и G1 циклины.

G1/S циклины (Cln1 и Cln2 у S. cerevisiae, циклин E у позвоночных)
достигает максимальной концентрации в поздней G1-фазе и
падает в S-фазе.

G1/S cyclin–Cdk комплекс запускает начало репликации ДНК
выключая различные системы подавляющие S-phase Cdk в G1-фазе

G1/S циклины также инициируют дупликацию центросом у позвоночных,
образование веретенного тела у дрожжей. Падение уровня G1/S
сопровождается увеличением концентрации S циклинов (Clb5,
Clb6 у Sc и циклин A у позвоночных), который образует S
циклин-Cdk комплекс который напрямую стимулирует ДНК репликацию.
Уровень S циклина остается высоким в течении всей S, G2-фаз
и начала митоза, где помогает началу митозу в некоторых
клетках.

М-циклины (Clb1,2,3 и 4 у Sc, циклин B у позвоночных) появляется
последним. Его концентрация увеличивается, когда клетка
переходит к митозу и достигает максимума в метафазе. М-циклин-Cdk-комплекс
включает сборку веретена деления и выравнивание сестринских
хроматид. Его разрушение в анафазе приводит к выходу из
митоза и цитокиезу.

G1 циклины (Cln3 у Sc и циклин D у позвоночных) помогает
координировать клеточный рост с входом в новый клеточный
цикл. Они необычны, так как их концентрация не меняется
от фазы клеточного цикла, а меняется в ответ на внешние
регуляторные сигналы роста.

APC комплекс (Anaphase-Promoting Complex)


Убиквитин лигаза митоза - APC состоит из 12 субъединиц и регулирует
различные процессы митоза, такие как разделение сестринских
хроматид (запускает разрушение когезинов), переход к анафазе,
анафазное расхождение хромосом, выход из митоза, разрешение
S-фазы. ARC разрушает митотический циклин B.

Имеются различные белки регулирующие активность ARC комплекса,
такие как Mps1, Bub1, Bub3, BubR1, Mad1 и Mad2. Они ингибируют
ARC комплекс, что ведет к остановке клеточного цикла в метафазе
митоза.

Читайте также: