Механизм гликолизирования белков при транслокации

Обновлено: 11.05.2024

В просвете мембранных органелл секреторного транспортного пути мембранные белки, также, липиды, как и растворимые, могут подвергаться различным модификациям. Наиболее характерной из них для эндоплазматической сети является первичное гликозилирование ? ковалентное связывание белковой цепи со сложным олигосахаридом. В результате этого синтезирующийся белок становится гликопротеидом. Процесс присоединение моносахаров с формированием полисахаридных цепочек носит название гликозилирования белков. Гликозилирование белков обычно происходит в просвете органелл секреторного транспортного пути и редко бывает в цитоплазме.

Ферменты транс-гликозидазы переносят олигосахариды в блоке с долихолом (длинноцепочечным изопреноидом) на определенные остатки аспарагиновой кислоты в белке, тем самым осуществляя N-гликозилирование белка. Гликозидазы правильно "подстригают" олигосахариды, отщепляя избыточные остатки глюкозы и маннозы.

Растворимые и мембранные белки, попавшие в эндоплазматическую сеть подвергаются так называемому гликозилированию, то есть процессу, в результате которого к полипептидных цепочкам присоединяются цепочки полисахаридов. Эту работу совершают специальные ферменты гликозидазы и гликозилтрансферазы. Они вместе с мембранными переносчиками моносахаров, перемещающими моносахара из цитоплазмы через липидный бислой в просвет цистерн аппарата Гольджи, составляют основу белкового состава аппарата Гольджи. Олигосахаридное ядро, состоящее из 14 мономеров моносахаров, присоединяется к той части мембранного белка, которая расположена в просвете эндоплазматической сети и также ко многим гликозилируемым белкам. Ферментов гликозилирования в АГ около 200 штук (200).

Но вначале белки должны быть правильно свернуты в пространстве. Эту задачу решают специальные белки шапероны, которые в условиях высокого восстановительного или редокс-потенциала среды, созданного в просвете эндоплазматической сети, правильно свертывают белки и закрепляют свертывание путем образования двойных соединений остатков серы.

После того, как сигнальный пептид оказывается внутри просвета эндоплазматической сети он отрезается от полипептидной цепочки, следующей за сигнальным пептидом, и эта цепочка, после завершения синтеза белка на информационной РНК, оказывается свободно диффундирующей внутри просвета эндоплазматической сети. Для того, чтобы она была правильно упакована в трехмерном пространстве, существуют специальные белковые машины, так называемые шапероны (или формообразователи). Они связываются с неправильно или неполностью свернутыми в пространстве белками и не выпускают тем самым их из эндоплазматической сети, поскольку они сами взаимодействуют с резидентными, то есть постоянно расположенными в эндоплазматической сети белками. Как только секретируемый белок свертывается правильно, шаперон уже не может к нему прикрепиться, так как локусы, ответственные за это прикрепление, оказываются внутри свернутой цепочки, будучи недоступными для шаперона. Тем самым секретируемый белок оказывается доступным для других белковых машин, ответственных за выход из эндоплазматической сети.

Большинство белков, синтезированных в гранулярной эндоплазматической сети, относится к гликопротеидам. Связывание синтезирующейся белковой цепи с олигосахаридами происходит в процессе синтеза аминокислотной цепи. При этом на белковую молекулу переносится готовый блок олигосахаридов, который связывается с аспарагиновыми остатками белковой молекулы. Этот олигосахаридный комплекс содержит 2 молекулы N-ацетилгликозамина, 9 молекул маннозы и 3 молекулы глюкозы и связан со специальным липидом долихолом на внутренней поверхности мембраны эндоплазматической сети. По мере транслокации (переноса) белковой цепи во время ее синтеза, каждый аспарагиновый остаток связывается с олигосахаридным комплексом, с помощью фермента, являющегося интегральным белком мембран эндоплазматической сети. Первичной модификации, гликозилированию, подвергаются как растворимые, так и мембранные белки, синтезирующиеся в эндоплазматической сети.

В процессе О-гликозилирования происходит присоединение одного-двух углеводных остатков преимущественно к аминокислотам серину и триптофану, но иногда и по другим аминокислотным остаткам (например, по гидроперину, как это происходит в растительных белках интенсинах). В одной молекуле полипептида может быть множество участков так называемого

О-гликозилирования. О-гликозилирование происходит без участия мембрано-связанного посредника. Существуют данные о том, что процесс О-гликозилирования начинается очень скоро после покидания белком эндоплазматического ретикулума, возможно, уже в промежуточных органеллах, то есть органеллах, которые располагаются на пути из эндоплазматической сети к аппарату Гольджи и продолжается, вероятно, вероятно, в нескольких отделах аппарата Гольджи.

N-гликозилирование осуществляется путем присоединения полисахаридной цепи к аминокислоте аспарагину, расположенному через один аминокислотный остаток от триптофана, и происходит постадийно. Процесс этот имеет следующие стадии.

1. Находясь в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, белок взаимодействует с мембрано-связанным донором олигосахаридов долихол- фосфатом, переносящим на белок слаборазветвленную олигосахаридную цепочку, состоящую из девяти остатков маннозы и трех остатков глюкозы. Эта цепочка прикрепляется к белку через два остатка N-ацетилглюкозамина.

2. В эндоплазматическом ретикулуме работают также глюкозидаза I и глюкозидаза II, которые затем удаляют остатки глюкозы от получившегося гликопротеина. Локализованный в цис-отделе аппарата Гольджи фермент маннозидаза I удаляет четыре остатка маннозы. В так называемом медиальном Гольджи работают ферменты N-ацетилглюкозамин-трансфераза-! маннозидаза II и N-ацетилглюкозамин-трансфераза-II.

3. На транс стороне аппарата Гольджи располагаются и активно функционируют ферменты фукозилтрансфераза, галактозилтрансфераза и сиалилтрансфераза. Они завершают модификацию сахарозной цепочки, соответственно присоединяя к получившемуся гликозилированному белку моносахарид фукозу и три остатка сиаловой кислоты, то есть гликозного кольца с окисленным атомом углерода.

Важнейшее значение в регуляции посттрансляционной модификации секретируемых и мембранных белков имеют так называемые белки ферменты гликозилирования, расположенные в эндоплазматической сети и в области пластинчатого комплекса. Эти белки относятся к мембранным белкам 2 типа. Они имеют очень короткий хвост, выступающий в цитоплазму и большой участок, расположенный в просвете эндоплазматической сети и пластинчатого комплекса. Этот участок имеет ферментативную активность и именно этот свернутый в глобулу участок переносит моносахарид на цепи сахаров, прикрепленных к одной из аминокислот на цепи молекулы белка.

В аппарате Гольджи осуществляются следующие ферментативные стадии модификации белка: фосфорилирование и отщепление с последующим переносом (перегруппировка) остатков сахаров с помощью гликозидаз и гликозилтрансфераз. Эта модификация имеет целью образование специфической олигосахаридной структуры в гликопротеинах. Наконец, в мембранной тубулярной сети, расположенной на уровне транс-Гольджи отщепляется еще один пептид, прежде чем содержимое секретируется посредством экзоцитоза. Это отщепление, катализируемое специфичными пептидазами, выполняет функцию активации секретируемого белка. Например, отщепление С-пептида от неактивного про-инсулина приводит к образованию активного гормона инсулина.

Если убрать ферменты гликозилирования с помощью лекарств или с помощью модификации внешней среды, то какая-то полисахаридная цепочка будет или ингибирована или будет сверхэксперсироваться.

Если обратиться снова к аналогиям, которые я уже использовал в данной книге, то можно сказать, что во время прохода белков по транспортному внутриклеточному пути часть участков узкой магнитофонной ленты обрезается, с другой стороны, к узкой магнитофонной ленте приклеиваются куски широкой магнитофонной ленты, то есть формируется цепь, состоящая из моносахаров. Более подробное описание того, как функционирует внутриклеточный транспорт, заинтересованный читатель найдет в Приложении V.

Механизм гликолизирования белков при транслокации

• Энергия, необходимая для посттрансляционной транслокации, поставляется при гидролизе АТФ, который происходит в люмене ЭПР при участии белка BiP

• Об источнике энергии, необходимой для котрансляционной транслокации, известно меньше, однако это может быть тот же самый источник, что и для посттрансляционной транслокации

• У бактерий в большинстве случаев транслокация осуществляется посттрансляционно, через канал, эволюционно близкий к комплексу Sec61

За счет чего происходит транслокация в люмен эндоплазматического ретикулума (ЭПР)? В экспериментах по исследованию переноса флуоресцентных проб через мембрану микросомальных везикул было показано, что рибосома настолько прочно связывается с каналом, что перенос цепи в люмен любым другим путем, исключая канал, становится невозможным.

Однако исследование комплекса рибосома-транслокон в электронном микроскопе позволило предположить, что между рибосомой и каналом существует промежуток. В биохимических экспериментах было показано, что во многих случаях при переносе белковая цепь оказывается в цитозоле, и т. о. транслокация в ЭПР происходит не всегда. Вместе с тем, подобный механизм не объясняет, как при посттрансляционном позиционировании возможно продвижение белка по транслокационному каналу.

Хотя определенную роль в «проталкивании» новообразованной цепи в люмен ЭПР может играть рибосома, в настоящее время кажется более вероятным, что движение цепи направляется белками люмена. Это предположение высказано на основании изучения механизма посттрансляционной транслокации. Хотя источник энергии для осуществления котрансляционной транслокации остается пока неизвестным, роль гидролиза АТФ в посттрансляционной транслокации исследована в достаточной степени и обсуждается в настоящем разделе. Не исключено, что аналогичный механизм реализуется и при котрансляционной транслокации.

Источником энергии для посттрансляционной транслокации белков в ЭПР служит АТФ, который гидролизуется белком hsp70 BiP, находящимся в люмене. Этот белок позиционируется на посттрансляционном канале за счет обратимого связывания с доменом Sec63p, который также локализуется со стороны люмена. Как показано на рисунке ниже, свободный полипептид за счет беспорядочного броуновского движения может двигаться в канале в двух направлениях.

Как постулирует механизм транслокации, носящий название модель броуновского храпового колеса, функция BiP заключается в связывании с растущей цепью по мере ее выхода из канала. Такое связывание предотвращает ее поступление назад, в цитозоль (белок BiP находится в скрученной форме, так что он не проходит через канал). По мере выхода в люмен очередного участка цепи он связывается с новой молекулой BiP, и таким образом осуществляется процесс транслокации. Следовательно, BiP обеспечивает продвижение белковой цепи в одном направлении. Энергия гидролиза АТФ расходуется на усиление взаимодействия BiP с белком, а в дальнейшем, при обмене АДФ/АТФ. происходит диссоциация BiP и субстрата. В пользу этой модели свидетельствуют эксперименты, в которых было показано, что удаление BiP из люмена ЭПР приводит к нарушению транслокации, однако при добавлении в люмен любых сравнительно больших молекул, способных связывать новообразующуюся цепь, транслокация возобновляется.

Возможно даже, что скручивание новообразующейся цепи в люмене может препятствовать ее попаданию назад, в цитозоль. При этом предполагается, что белки, склонные к сворачиванию, переносятся легче, чем белки, которые во время значительного периода транслокации остаются в нескрученном состоянии (хотя это не доказано). Для того чтобы предложенная модель функционировала нормально, необходимо, чтобы при образовании связи цепи с каналом перед началом транслокации разорвалась связь цепи с hsp70 и другими белками цитозоля. В противном случае цепь с одинаковой вероятностью может остаться вне ЭПР или пройти в канал. Однако взаимодействие цепи с белками цитозоля в процессе транслокации пока не исследовано. Стоит заметить, что единственные белки, абсолютно необходимые для транслокации, представлены комплексами Sec6l и SR, но эффективность переноса для большинства белков очень низкая при таком минимуме белков. По-видимому, это связано с тем, что в люмене отсутствуют белки, способные облегчить продвижение цепей.

В отличие от модели транслокации по принципу броуновского храпового колеса, модель активного протягивания предполагает, что гидролиз АТФ вызывает кон-формационные изменения в белке BiP, которые приводят к активному протягиванию связанной цепи через канал. По такому механизму происходит посттрансляционный импорт белков в митохондрии. Хотя посттрансляционная транслокация некоторых белков в ЭПР может происходить по броуновскому храповому механизму, цепи определенной структуры или связанные с hsp70 в цитозоле переносятся по механизму активного протягивания.

Поскольку протягивание (образование тянущей силы) молекулы по каналу трудно воспроизвести экспериментально, пока сложно оценить роль, которую играют обе модели в посттрансляционной транслокации.

Хотя в настоящем разделе в основном рассматривается транслокация белков в эукариотических клетках, проблема сортировки белков важна и для прокариот, которые также образуют секреторные и мембранные белки. Посттрансляционная транслокация характерна для бактерий Е. coli. Она напоминает посттрансляционную транслокацию у дрожжей в том отношении, что субстраты заранее не образуют нативной структуры, и узнавание сигнальной последовательности происходит внутри канала.

Так же как и у эукариот, транслокация у бактерий происходит по водному каналу, который в основном состоит из трех белков, вместе называемых комплексом SecYEG. Белок SecY представляет собой бактериальный гомолог Sec61p и Sec61a. Однако, поскольку у бактерий нет органелл окруженных мембранами, белки переносятся непосредственно через плазматическую мембрану. Следствием этого является то, что источником энергии служит белок SecA (SecAp), действующий с цитозольной стороны мембраны, а не с противоположной ее части, как это имеет место у эукариот при посттрансляционной транслокации. Одна из возможных моделей функционирования SecAp представлена на рисунке ниже.

Модель предполагает, что этот белок, расположенный с цитозольного конца канала, неоднократно входит в канал, каждый раз втягивая в канал и высвобождая из него новый участок субстрата. Связывание и высвобождение полипептида белком SecA происходят за счет цикла гидролиза АТФ. Неизвестно, почему в перерыве между функционированием SecAp полипептидная цепь не поступает назад, в цитозоль. Существование у прокариот трансмембранного электрохимического потенциала служит дополнительным фактором, облегчающим транслокацию, хотя механизм этого остается малопонятным.

Сравнение между собой котрансляционного, посттрансляционного и бактериального путей транслокации показывает, что основные механизмы переноса белков через мембраны являются консервативными и в то же время могут адаптироваться к разнообразным условиям. Во всех случаях сохраняется фундаментальная особенность процесса — перенос через водный канал. Однако субстраты, а также пути их позиционирования и переноса по каналу различаются между собой.

После непродолжительного взаимодействия с Sec62/63 молекулы BiP связывается с новообразующимся полипептидом.
Поскольку белок BiP слишком большой для того, чтобы поместиться в канале,
он позволяет полипептиду проходить внутрь канала, но ограничивает его продвижение назад, в цитоплазму.
Каждая молекула BiP в люмене захватывает новый участок полипептида. Белок SecAp расположен с цитоплазматической стороны канала.
Он многократно связывается с новообразующимся полипептидом и постепенно вставляет его в канал, что в конце концов приводит к транслокации всего белка.
При этом один домен белка SecAp периодически проникает в канал и выходит из него.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Целенаправленное вмешательство в патогенетические механизмы: так действует Мильгамма композитум

Биологически активным веществом бенфотиамина является тиаминдифосфат (ТДФ), который ранее назывался также тиаминпирофосфатом. ТДФ - это кофермент различных многоферментных комплексов, среди которых наибольшее значение для нервных клеток имеют ферменты, участвующие в углеводном обмене. Тиамин-зависимые ключевые ферменты играют важную роль в окислительных процессах расщепления глюкозы.

Кроме того, в пентозофосфатном цикле участвует транскетолаза. Данный путь обмена веществ, который происходит в цитозоле клетки, предназначен в первую очередь для того, чтобы предоставлять пентозофосфаты (например рибозо-5-фосфат) для синтеза нуклеиновых кислот и никотинамидадениндифосфат (восстановленная форма - НАДФН), например для синтеза жирных кислот. Обратной реакцией с помощью транскетолазы 5-атомный сахар превращается в гексозу или глицеральдегид-3-фосфат. ТДФ в этой реакции выполняет роль простетической группы транскетолазы, которая переносит С₂-фрагмент. После прохождения через мембраны митохондрий пируват декарбоксилируется с образованием ацетил-КоА. Катализатором реакции служит пируват-дегидрогеназный комплекс (ПДК), α ТДФ выполняет роль кофермента. В начальном энергетическом процессе, так называемом цитратном цикле, также участвует ТДФ-зависимый фермент. При участии а-кетоглутарат-дегидрогеназы (или 2-оксоглутарат-дегидрогеназы) а-кетоглутарат декарбоксилируется, дегидрируется и превращается в сукцинил-КоА, который затем, проходя стадии фумарата и малата, снова преобразуется в оксалоацетат. В результате проведения ряда исследований по распределению тиамина в нервной клетке был получен следующий основной факт. В цитоплазме находится только транскетолаза, в то время как пируват-дегидрогеназа и а-кетоглутарат-дегидрогеназа локализованы в митохондриях (Cooper, 1979). На основе представлений о значении тиамина в метаболизме глюкозы сделан вывод о том, что между распределением тиамина и расщеплением глюкозы существует прямая взаимосвязь.

Такие исследования были проведены у 25 пациентов с циррозом печени (Hassan, 1991). У этих пациентов отмечалась гипергликемия и были выявлены отличающиеся от нормальных показателей параметры во время проведения орального теста толерантности к глюкозе (ОТТГ). После приема тиамина уровень глюкозы, определяемый натощак, непрерывно снижался вплоть до завершения исследования к 30-му дню (от 11 7,6±2,9 до 87,6±2,4) (p≤0,01). В ОТТГ, который выполнялся 30 дней, все показатели значительно улучшились (p≤0,01). На этом основании для улучшения утилизации глюкозы пациентам с циррозом печени рекомендуется дополнительный прием тиамина или бенфотиамина. Витамин В₆ в своей фосфорилированной форме (пиридоксаль-5'-фосфат, ПФ) является коферментом большого числа ферментов, которые участвуют в общем неокислительном обмене аминокислот. Реакцией образования Шиффова основания ПФ своей альдегидной группой присоединяется к аминогруппе аминокислот апофермента. Ферментативные реакции включают декарбоксилирование, при котором синтезируются биогенные амины (гистамин, тирамин, триптамин) или нейромедиаторы (серотонин, допамин, γ-аминомасляная кислота [ГАМК]), трансаминирование, которое происходит при анаболических и катаболических процессах обмена веществ (например, в них участвуют глутамат-оксалацетат-трансаминаза, глутамат-пируват-трансаминаза, а-кетоглутарат-трансаминаза), а также различные процессы расщепления и синтеза аминокислот. Так, например, превращение гомоцистеина в цистеин катализируется двумя ПФ-зависимыми коферментами. Кроме того, ПФ выполняет роль кофермента для гликогенфосфорилазы.

5.2. "Нетрадиционная функция" бенфотиамина

Независимо от функций коферментов, ТТФ и ТДФ в клеточных мембранах проявляют также самостоятельные "нетрадиционные функции". Этот тезис базируется на первых экспериментах, выполненных von Muralt (1947), который после стимуляции нервов наблюдал повышенное высвобождение тиамина.

Такое высвобождение, по-видимому, является результатом гидролиза ТТФ и ТДФ. Исходя из этого, тиамину отводится функция высвобождения ацетилхолина в холинергических нервных окончаниях (Eder, 1976). У крыс с тиаминовой недостаточностью синтез ацетилхолина снижен примерно до 35% нормы и может быть нормализован путем приема тиамина (Barclay, 1980). ТТФ связан с белком натриевых каналов (Bassler, 1992). Относительно роли ТТФ и ТДФ при возбуждении нервов постулируются две гипотезы: одна исходит из каталитической функции, обеспечивающей проницаемость мембраны для Na + , в то время как другая подчеркивает фиксацию отрицательных зарядов на внутренней поверхности мембраны (Iwata, 1982).

Тиамин связывается также с изолированными никотинергическими рецепторами. Нервная проводимость может зависеть от влияния антиметаболитов тиамина (Waldenlind, 1978). Существенное значение может иметь при этом контроль состояния натриевых каналов в аксональных мембранах, реализуемый посредством ТТФ (Schoffeniels, 1983).

5.3. Какую роль играет бенфотиамин при сахарном диабете?

Вследствие центральной роли тиамина в метаболизме глюкозы ставится вопрос об обеспеченности тиамином или потребности в нем при патологических нарушениях обмена веществ, которые развиваются при сахарном диабете. В экспериментальном исследовании у крыс с сахарным диабетом в периферической крови и различных органах определялся уровень тиамина с тиаминовой компенсацией и без нее (Hobara, 1983). В печени животных контрольной группы содержание тиамина оказалось наибольшим по сравнению с остальными исследованными органами. У животных с сахарным диабетом, не получавших тиаминовую компенсацию, содержание тиамина в печени было статистически достоверно сниженным (p<0,001), в то время как в других органах оно оставалось стабильным или слегка возрастало. Согласно данным другой работы, у крыс уже после двухнедельного течения сахарного диабета наблюдалось значительное снижение концентрации тиамина в печени и сердце по сравнению с животными контрольной группы (Reddi, 1992). Приведенные результаты указывают на то, что у животных с сахарным диабетом относительный дефицит тиамина может вызывать повышение потребности в нем.

На существование непосредственной связи между тиамином и усвоением глюкозы у больных сахарным диабетом указывают результаты следующего исследования. Известно, что при применении определеных салуретиков может индуцироваться гипергликемия, которая является обратимая и проходит после прекращения приема лекарства. У 20 больных сахарным диабетом было проведено исследование, имевшее целью установить, существует ли взаимосвязь сахарного диабета и тиамина, так как при дефиците тиамина могут происходить похожие изменения в обмене веществ (Standl, 1968). Критерием количества применения глюкозы служил коэффициент усвоения глюкозы у пациентов, которым назначался гидрохлоротиазид (ГХТ) в сочетании с тиамином или без него. После приема ГХТ данный коэффициент значительно ухудшался по сравнению с контрольной группой (p≤0,05), в то время как дополнительный прием тиамина улучшал усвоение глюкозы (p≤0,05). Если учесть ту важнейшую роль, которую играет ТДФ в метаболизме глюкозы, то такой результат легко объясним. Вследствие повышенного уровня глюкозы в крови у больных сахарным диабетом развивается повышенная потребность в тиамине.

Результаты исследования, выполненного Berndt (1977), подтверждают эту повышенную потребность. Радиактивно меченый препарат тиамина назначался перорально, и по содержанию тиамина в моче судили о степени обеспеченности организма тиамином. Как у хронических алкоголиков, так и у обследованных больных диабетом с полиневропатией и без нее отличался значительно более низкий уровень выделения тиамина в сравнении со здоровыми людьми, составлявшими контрольную группу. Это является достоверным показателем наличия дефицита тиамина или повышенной потребности в нем. С помощью эритроцитарной транскетолазы (ЭТК) у 100 больных сахарным диабетом 1 типа определялась обеспеченность организма тиамином (Havivi, 1990). Дефицит тиамина был выявлен у 18% больных сахарным диабетом, в то время как у здоровых людей аналогичная ситуация наблюдалась лишь в 1% случаев (p≤0,001).

В рамках клинического исследования 35 больных диабетом 1 и 2 типов с симптоматичной дистально симметричной полиневропатией в течение 90 суток получали бенфотиамин-содержащий комбинированный препарат (Wolf, 1995).

Таблица 7. Значения а-ЭТК (среднее значение и стандартное отклонение) после приема активного препарата (n=18) и плацебо (n=17) (Wolf, 1995)

Группа больных, принимавших	а-ЭTK
	1-е сутки	7-е сутки		45-е сутки	90-е сутки
	утро	утро	вечер	утро	утро
Активный препарат	1,11±0,05	1,02 *o ±0,01	1,02 *o ±0,01	1,03 *o ±0,01	1,03 *o ±0,02
Плацебо	1,11±0,05	1, 1 6±0,06	1,14±0,07	1,13±0,07	1,10±0,04

* достоверные различия за сутки (p≤0,05)
o достоверные различия между группами с активным препаратом и плацебо (p≤0,05)

5.4. Антиноцицептивное действие

Наряду с описанными выше эффектами тиамину и пиридоксину может быть свойственно также антиноцицептивное действие. Такие исследования в большинстве случаев проводились в сочетании с цианокобаламином. Возможными точками приложения действия являлись непосредственно болевые рецепторы, чувствительность которых варьирует в результате влияния различных тканевых гормонов (например брадикинина) и нейропептидов. Сенсибилизация болевых рецепторов проявляется, например, как воспалительная гипералгезия (повышенная болевая чувствительность). И здесь возможна взаимосвязь, так как недостаток в тиамине и пиридоксине сопровождается симптомами воспаления кожи и слизистых оболочек. Наряду с этим в стволе головного мозга имеются несколько областей, которые через нисходящие пути в спинном мозге осуществляют тормозящее влияние на вторичный нейрон и таким образом вызывают притупление болевой чувствительности. По всей видимости, медиатором в данном случае выступает серотонин. В то время как пиридоксальфосфат участвует в синтезе серотонина в качестве кофермента, тиамин выполняет важную функцию при его депонировании и транспорте. Именно здесь, возможно, находится точка реализации анальгетического действия фармакологических доз тиамина и пиридоксина (Reeh, 1988). Антиноцицептивное действие довольно просто подтверждается в экспериментах на животных. При использовании модели, предусматривающей проведение импульсов в таламус крыс после стимуляции Nervus suralis (икроножный нерв), проявлялось отчетливое тормозящее действие вышеописанной комбинации (тиамин или пири-доксин + кобаламин). Факт того, что эффект развивался только через 1 час после внутрибрюшинного введения, позволяет сделать вывод о том, что данный эффект оказывает влияние на синтез ингибиторного медиатора (Jurna, 1988). Тест "теплого глотка" у крыс позволяет провести термически индуцированную ноцицептивную реакцию. Петлевый тест приводит в действие абдоминальную реакцию путем внутрибрюшинного введения насыщенного раствора фенилбензохинона, при этом изучается химически индуцированная ноцицептивная реакция. При использовании обеих моделей описанная выше комбинация проявляла антиноцицептивный эффект, причем каждый из компонентов самостоятельно также оказывал действие. Применение комбинации усиливало анальгезирующий эффект диклофенака или метамизола (Wild, 1988).

Весьма существенно, что эти результаты подтверждались неоднократно, в том числе и при проведении двойного слепого клинического исследования. В качестве модели в большинстве случаев выступал болевой синдром позвоночного столба, при котором комбинация витаминов В₁ и В₆ демонстрировала временами значительные преимущества как сама по себе (Schwieger, 1988), так и в сочетании с диклофенаком (Koch, 1991).

5.5. Регенерирующее влияние на поврежденные нервные волокна

Следует также подчеркнуть влияние высоких доз нейротропных витаминов группы B на регенерацию поврежденных нервов. При экспериментальном аллергическом неврите в первую очередь нарушается миелиновый обмен. В этом случае происходит активация фосфолипазы-A, следствием чего является чрезмерный гидролиз эфиров жирных кислот, а также оказание влияния на жидкую субстанцию миелиновых оболочек. Одновременно происходит активация ацилтрансферазы.

Одновременное применение тиамина, пиридоксина и кобаламина при использовании данной модели сопровождается более поздним и ослабленным проявлением неврологической симптоматики, причем результаты указывают на то, что при этом стимулируется "восстановительный механизм" (Woelk, 1982). У кроликов с помощью теста криопоражения можно вызывать изолированное аксональное повреждение нервных волокон. Данная модель позволила установить, что через 21 день после поражения в дистальном регенерирующем отделе икроножного нерва числа регенерированных волокон было значительно увеличено после введения вышеупомянутой комбинации витаминов (Becker, 1990). На модели экспериментального неврита у кроликов было выявлено, что парентеральное введение высоких доз тиамина, пиридоксина гидрохлорида и цианокобаламина существенно увеличивает возможность встраивания холина в поврежденные нервы. Согласно методике, радиактивно меченый холин впрыскивался внутримедуллярно. Действие комбинации витаминов могло быть основано на стимуляции аксоплазматической части транспорта структурных элементов мембраны или миелиновой оболочки, например холина.

Встраивание холина было существенно повышено по сравнению с контрольной группой, что может интерпретироваться как проявление ускоряющего действия исследуемой комбинации на регенерацию периферических нервов. Существенным моментом являлось то, что животные не имели дефицита исследуемых компонентов. Авторы пришли к заключению, что способствующие регенерации свойства тиамина, пиридоксина и цианокобаламина основаны на фармакологических эффектах, характерных для высоких доз этих витаминов, и не зависящих от их дефицита. Возможно, тиамин посредством усиления энергообеспечения в форме ATФ поддерживает аксоплазматический транспорт, в то время как пиридоксин участвует в синтезе транспортных белков, а цианокобаламин обеспечивает доставку жирных кислот для клеточных мембран и миелиновой оболочки (Reiners, 1996).

Предотвращение образования конечных продуктов ускоренного гликозилирования белков (AGE-продуктов)

Результаты самых новых исследований подтверждают, что тиамин или его фосфаты, а также витамин В₆ могут предотвращать образование конечных продуктов ускоренного гликозилирования белков (AGE-продуктов). Образование AGE-продуктов представляет собой важный патогенетически активный механизм токсичности глюкозы при сахарном диабете и диабетической полиневропатии (Brownlee, 1999 и 2001).

После инкубации клеточных культур с высокими концентрациями глюкозы (28 ммоль/л) наблюдались уменьшенная клеточная пролиферация и увеличенное образование лактата по сравнению с физиологическими концентрациями глюкозы (5,6 ммоль/л). В этих исследованиях использовались клетки сетчатки быков (BREC - bovine retinacels) и клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC - human umbilikal vein endothelial). Патологические изменения при глюкозной нагрузке предотвращались в клеточных культурах путем дополнительного введения тиамина (1 50 ммоль/л). AGE-продукты дополнительно определялись в HUVEC. В то время как при концентрации глюкозы 28 ммоль/л образовывалось повышенное количество AGE-продуктов (p≤0,05), в клеточных культурах с добавлением тиамина происходило лишь минимальное повышение их содержания. Не отмечалось существенных различий содержания AGE-продуктов в клеточных культурах при концентрации глюкозы 5,6 ммоль/л с тиамином и без него (рис. 8). Авторы объясняют ингибирование образования AGE-продуктов как результат стимуляции тиамином - посредником окислительного расщепления глюкозы в пентозо-фосфатном и цитратном циклах (La Selva, 1 996).

Рис. 8. Образование AGE-продуктов в клетках эндотелия HUVEC при инкубации с 5,6 ммоль/л или 28 ммоль/л глюкозы (Глю)сдобавлением тиамина (Тиа)150 ммоль/л и без него (La Selva, 1996)

В одном из современных исследований изучалось влияние бенфотиамина или тиамина на клеточные культуры HUVEC при глюкозной нагрузке (28 ммоль/л). В то время как при глюкозной нагрузке наблюдалось угнетение клеточной пролиферации, при добавлении бенфотиамина или тиамина она почти нормализовалась.

В экспериментальной работе изучалось влияние тиамина и его фосфатов, а также аминогуанидина и витамина В₆ на образование AGE-продуктов при использовании в качестве субстратов альбумина бычьей сыворотки, рибонуклеазы A и метгемоглобина человека. При этом оказалось, что ТДФ и пиридоксамин, в отличие от аминогуанидина, являются более действенными ингибиторами образования AGE-продуктов (Booth, 1996).

Отправные точки вышеназванных биоактивных веществ в сложном процессе гликозилирования более подробно изучались в последующем исследовании с использованием альбумина бычьей сыворотки и рибонуклеазы A (Booth, 1 997). Было выявлено, что на этапе "позднего гликозилирования" ТДФ и пиридоксамин способны эффективно ингибировать образование AGE-продуктов. В отличие от них, аминогуанидин не оказывал практически никакого влияния на "позднее гликозилирование".

Активация транскетолазы бенфотиамином

Бенфотиамин препятствует активации патогенетических механизмов изменения направления промежуточных продуктов распада глюкозы - фруктозо-6-фосфата и глицеральдегид-3-фосфата - в пентозо-фосфатный цикл веществ. Это происходит в результате активации транскетолазы - витамин В₁-зависимого фермента, активность которого у больных сахарным диабетом снижается. Бенфотиамин повышает активность транскетолазы до 400% и таким образом устраняет "задержку утилизации" (Brownlee, 2001 ). Метаболизм глюкозы может снова нормализоваться.

Фармакодинамика бенфотиамина основывается на множестве принципов. Новейшие данные подтверждают возможность ингибирования образования AGE-продуктов. Бенфотиамин и витамин В₆ препятствуют образованию AGE-продуктов и обеспечивают при диабетической полиневропатии возможность целенаправленного терапевтического вмешательства с помощью препарата Мильгамма ® композитум.

Модификация и сворачивание белков после трансляции

Котрансляционные и посттрансляционные модификации представляют собой важные этапы транслокации, активации, регуляции и распада белков. В действительности существует, вероятно, лишь небольшое количество белков, которые не подвергаются каким-либо химическим изменениям во время синтеза или по его завершении. Из многих белков удаляется N-концевой остаток метионина, а прочие излишние участки некоторых белков подвергаются расщеплению.

Другие распространенные модификации включают (но не ограничиваются ими) гликозилирование, ацетилирование, жировое ацилирование и формирование дисульфидных связей. Несмотря на повсеместное присутствие модификации белков в природе, многое из того, каким образом эти изменения влияют на деятельность каждого отдельно взятого белка, остается неизвестным.

Это объясняется главным образом тем, что единичный вид модификации запускает различные функции в зависимости от целевого белка. Например, аспарагин-связанное гликозилирование может стабилизировать процесс сворачивания одного полипептида, тогда как у другого белка оно может играть важную роль в распознавании клетки или ее функции.

Механизм этих и других изменений белка в процессе трансляции и после нее разнообразен и сложен. Однако важно отметить, что мутации в генах, участвующие в модификациях белков, приводят к разнообразным расстройствам, например врожденным нарушениям гликозилирования типа I, мультисистемному заболеванию, при котором происходит аномальное гликозилирование гликопротеинов слизистой оболочки кишечника.

Нарушения гликозилирования типа I проявляются такими кишечными симптомами, как воспаление и аномальный транспорт липидов энтероцитами или нарушение кишечной проницаемости. Эти заболевания у человека подчеркивают тот факт, что котрансляционные и посттрансляционные модификации являются тесно связанными событиями в регулировании синтеза белка, а также его распада.

Трансляции мРНК в основном начинаются на цитозольных рибосомах. В отдельных классах белков образующийся полипептид нацелен (с помощью распознающей сигнал частицы) на эндоплазматический ретикулум для завершения обработки и осуществления некоторых трансляционных и посттрансляционных модификаций. К этим классам белков относятся белки ЭПР и резидентные белки аппарата Гольджи, белки, связанные с мембраной, белки эндосомнолизосомальной системы и белки, предназначенные для секреции.

После трансляции и модификации образующиеся пептиды, расположенные в ЭПР, должны быть правильно свернуты и собраны до того, как перейдут во внутриклеточные органеллы либо на поверхность клетки. Семейство белков, известное как молекулярные шапероны (chaperones), решает эту задачу, функционируя как система «контроля качества» на стадии образования пептидов.

Несвернутые или неправильно свернутые белки на время задерживаются в просвете эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в ожидании правильной компоновки. Белки, которые не могут быть свернуты правильно, перемещаются из ЭПР для целенаправленной деградации в цитозоле протеосомами.

Для гомеостаза ЭПР необходимо, чтобы емкость аппарата сворачивания белка оставалась в состоянии баланса с потребностями. Этот баланс может быть нарушен в результате стресса, вызванного состоянием окружающей среды (например, недостатком глюкозы или нарушением гомеостаза Са2+ во время гипоксии), генетическими мутациями в белках, которым необходима сборка в ЭПР (например, CFTR), или нарушениями в самом аппарате сворачивания белка.

Дисбаланс между потребностью в сворачивании и сворачивающей способностью создает в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) стресс, приводящий у млекопитающих к тройственной реакции несвернутых белков (стрессовая реакция ЭПР).
Триада стрессовых рецепторов отслеживает изменения, происходящие в ЭПР и устанавливает временные модели экспрессии генов, которые совместными усилиями активируют обработку, накопление и транспорт секреторных белков, несмотря на подавление синтеза новых белков.
Один из стрессовых сенсоров, трансмембранный фактор транскрипции (ATF) 6, представляет собой связанный с мембраной аппарата Гольджи белок, который после протеолитического расщепления направляется в ядро, чтобы управлять транскрипцией генов, подвергающихся UPR.
Вторым сенсором является IRE1, трансмембранная протеинкиназа ЭПР, РНКазная активность которой важнее для сплайсинга ХВР-1 мРНК в мощный фактор транскрипции, который также руководит генами, нацеленными на UPR.
Третьим сенсором UPR является PERK, другая трансмембранная протеинкиназа ЭПР, которая угнетает общий синтез белков путем фосфорилирования elF2. Возникающий в результате этого пониженный синтез белков будет предупреждать дальнейшую перегрузку ЭПР и давать клетке достаточно времени для того, чтобы перестроить экспрессию генов.
elF — эукариотический фактор инициации; ERAD — расщепление белка, связанное с эндоплазматическим ретикулумом; IRE1 — трансмембранный белок, выполняющий функции и киназы, и эндонуклеазы; PERK — PKR-подобная протеинкиназа эндоплазматического ретикулума; ХВР-1 — X-box-связывающий белок 1; мРНК — матричная РНК.

Когда этот баланс нарушается, несвернутые или неправильно свернутые белки накапливаются на мембране эндоплазматического ретикулума (ЭПР) как «клеточный мусор». В результате инициируется адаптивный механизм, который называют реакцией несвернутых белков (UPR) или стрессовой реакцией ЭПР. UPR включает три отдельных процесса.

Во-первых, снижается общая скорость синтеза белка для уменьшения нагрузки на эндоплазматический ретикулум (ЭПР) по сворачиванию белков и непосредственного ингибирования трансляции циклина D1, способствуя тем самым приостановке клеточного цикла.

Во-вторых, шапероны, резиденты эндоплазматического ретикулума (ЭПР), транскрипционно индуцированы для увеличения сворачивающего потенциала в этих органеллах.

В-третьих, для удаления накапливающихся клеточных отходов инициируется система расщепления белка, связанного с эндоплазматическим ретикулумом. Активация ERAD имеет важное значение для распада несвернутых белков через убиквитин-протеасомный путь. Если стресс ЭПР не может быть уменьшен этими тремя процессами, тогда активируется клеточный механизм, вызывающий апоптоз.

Накопление несвернутых белков распознают несколько резидентных молекул эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Одной из них является еIР2-киназа PERK. Как было упомянуто ранее, PERK индуцирует фосфорилирование фактора трансляции eIF2, что приводит к выключению трансляции на начальных этапах. Эта реакция блокирует синтез новых белков и предупреждает дальнейшее накопление несвернутых белков, образующих токсические скопления.

В это же время увеличение фосфорилирования eIF2 делает возможной трансляцию специфической мРНК, которая кодирует ATF4. ATF4 способствует транскрипции генов, уменьшающих стресс, а также генов, которые связаны с апоптозом.

Стимуляция трансляции специфической мРНК вопреки общей репрессии является скоординированным процессом (например, общей стрессовой реакцией), что подчеркивает способность клетки в организованном порядке разделять и направлять в определенное русло множественные биологические процессы. Кроме того, на накопление несвернутых белков реагируют и другие резидентные белки ЭПР, такие как IRE1 (трансмембранный белок, выполняющий функции и киназы, и эндонуклеазы) и ATF6, путем активации транскрипции других генов, и все это увеличивает сворачивающий потенциал в ЭПР.

Хотя клеточный стресс, вне сомнения, является основным активатором UPR, следует отметить, что UPR вызывается не только стрессовыми событиями. Напротив, последние исследования показывают, что дифференцировка клеток, связанных с увеличением производства секреторных белков, сочетается с активацией тех же самых сигнальных путей. Например, для конечной дифференцировки В-лимфоцитов в зрелые плазматические клетки, которые секретируют антитела, необходимо, чтобы ЭПР набирал и выделял большое количество антител с исключительной эффективностью.

При дифференцировке В-клеток нужно огромное увеличение белоксворачивающей способности ЭПР. При переходе В-клеток к секреции антител с высокой скоростью UPR регулирует гомеостаз ЭПР и события, необходимые для гуморального иммунитета.

Ясно также, что UPR необходима для нормальной функции клеток. Пациенты с синдромом Уолкотта-Раллисона с периода новорожденности и раннего детства страдают тяжелой формой инсулинозависимого диабета, а также имеют дефекты в формировании костей и замедление темпов роста. Генетическая мутация у этих пациентов затрагивает ген EIF2AK3, который у человека кодирует еIF2-киназу PERK.

У мышей с функциональным нарушением гена EIF2AK3/PERK выявляется массовый апоптоз экзокринной части поджелудочной железы спустя несколько недель после рождения, приводящий к уничтожению производящих инсулин b-клеток.

Некоторые исследования показывают, что сигнальные пути, связанные с UPR, эволюционировали, чтобы соответствовать потребностям в питании при некоторых метаболических процессах. Клеточная реакция на стресс, которая связана с реакцией несвернутого белка, но отличается от нее, включает реакцию клеток на недостаток аминокислот.

В дополнение к активации фосфорилирования eIF2 недостаток аминокислот вызывает передачу каскада сигналов на mTOR, чтобы снизить его чувствительность к инсулину и факторам роста. Доминирующим проксимальным регулятором сигналов для TORC1 и активности киназы является ген Rheb (ras-like small GTPase).

Истощение аминокислотного запаса препятствует способности Rheb активировать mTOR, что действенно ингибирует рост сигналов, вызванных последующими звеньями сигнального пути Rheb, а именно передачу сигнала, связанную с инсулиновым путем.

Стимулирование mTOR сигналами для содействия увеличению анаболизма через биогенез рибосом, синтез белков, импорт нутриентов и ускорение клеточного цикла требует удвоенного поступления как инсулина и факторов роста, так и аминокислот. Поэтому важным моментом в питании новорожденных является то, что для нормального функционирования основных механизмов роста человека как in vitro, так и in vivo чрезвычайно важны экзогенные аминокислоты.

• Во время переноса многих белков в ЭПР олигосахарилтрансфераза катализирует процесс их N-гликозилирования.

Во время переноса многих белков в ЭПР к ним ковалентно присоединяются большие комплексы сахарных остатков. Такая форма ковалентной модификации очень распространена: более половины секреторных и мембранных белков могут присоединять сахарные остатки, а многие модифицируются в нескольких местах полипептидной цепи.

Поскольку этот процесс затрагивает аспарагиновые остатки (обозначаемые N-остатки), то он называется N-гликозилированием.

Гликозилирование может выполнять несколько функций. Выяснение этих функций достаточно затруднительно, поскольку многие гликозилированные белки не утрачивают своих функций при ингибировании этого процесса. Однако в некоторых случаях удалось выяснить роль гликозилирования.

Пока белки находятся в ЭПР, присоединение к ним остатков сахаров способствует приобретению ими нативной структуры или же облегчает их деградацию. Роль этих модификаций у белков, находящихся вне ЭПР, остается менее ясной. По некоторым данным, гликозилирование белков служит механизмом изменения их функций.

Например, секреция и активность фолликулостимулирующего гормона меняются в соответствии с изменением степени гликозилирования. В других случаях углеводные остатки могут способствовать растворимости белков или защищать их от деградации внеклеточными протеазами.

В процессе N-гликозилирования к белку, находящемуся в люмене ЭПР, присоединяются крупные промежуточные компоненты. Синтез интермедиатов начинается в цитозольном слое мембраны с добавления двух остатков GlcNAc и пяти остатков маннозы к фосфатной группе долихолфосфата, одного из минорных мембранных фосфолипидов.

Затем этот предшественник переносится на противоположную сторону мембраны при помощи неидентифицированной флиппазы. Там к нему добавляются четыре дополнительных остатка маннозы, что приводит к образованию трех ответвлений. Наконец, к одной из трех маннозных ветвей добавляются три остатка глюкозы, образуя молекулу, которая служит источником углеводов при гликозилировании.

Перенос разветвленной углеводной структуры с долихолфосфата на субстрат происходит при транслокации. Процесс катализируется сложным мультисубъединичным ферментативным комплексом олигосахаридтрансферазой (ОСТ). Две субъединицы ОСТ, рибофорин I и II, пронизывают мембрану ЭПР и могут взаимодействовать со связанной рибосомой (отсюда их название), позиционируя комплекс ОСТ в непосредственной близости от канала.

ОСТ модифицирует аспарагиновые остатки, когда за ними расположены любые аминокислоты, кроме пролина, а затем серин или треонин (N-X-S/T). После того как сайт выйдет из канала, гликозилирование происходит очень быстро; до его начала в люмен необходимо войти только 10-12 аминокислотным остаткам. Узнавание сайтов происходит достаточно эффективно: в клетке используется примерно 90% потенциальных сайтов, однако некоторые сайты не используются никогда.

В зависимости от условий, степень гликозилирования того или иного белка меняется. После прохождения начального гликозилирования в ЭПР и в аппарате Гольджи в разные моменты происходят различные модификации структуры олигосахаридов, которые включают удаление и добавление сахарных остатков.

Сложная углеводная структура образуется на фосфолипиде долихолфосфате в результате протекания нескольких последовательных реакций.
Синтез начинается на мембране ЭПР со стороны цитоплазмы, а заканчивается на стороне, обращенной в сторону люмена.
Образующаяся олигосахаридная структура переносится на транслоцируемые белки ферментом олигосахаридтрансферазой.
Модификация происходит по аспарагиновым остаткам, присутствующим в последовательности.

Читайте также: