Задачи цитологического исследования. Установление природы частиц
Обновлено: 13.05.2024
Жизнь на Земле представлена организмами, состоящими из клеток. Цитология (от греческого kytos - клетка, ячейка) - это наука о биологических клетках. В XX веке она стала главным направлением биологии. Цитологические исследования направлены на познание структуры, химического состава и жизнедеятельности клеток.
Что изучает цитология?
Объектом изучения цитологии является клетка - базовая единица всего живого. Она обладает всеми признаками живого организма:
- рост;
- размножение;
- обмен веществ и энергии;
- раздражимость (способность организма отвечать на меняющиеся условия внешней среды изменением физиологических характеристик и физико-химических показателей);
- старение и гибель.
Все эти проявления жизнедеятельности клетки составляют предмет исследований в цитологии.
Задачами цитологических исследований являются:
- изучение сути клеточной жизнедеятельности;
- определение алгоритмов клеточных процессов и механизмов их регуляции.
Чтобы найти достоверные решения этих задач, требуется тщательное и всестороннее изучение клеток различных организмов.
Методы исследований
Для исследования структуры клеток и их жизненных процессов учёные использовали передовые технологии своего времени.
Световая микроскопия
Световая микроскопия — первый в истории научный метод изучения микромира. Он применяется и в наши дни. Недостаток метода - слабая мощность световых микроскопов. С их помощью не получается изучать объекты с размером меньше длины световой волны, которая составляет 400-800 нм. Световая волна попросту огибает объект такого маленького размера, а не отражается от него.
Электронная микроскопия
В ХХ веке физики реализовали идею использовать пучок электронов вместо светового луча. В 30-х годах прошлого столетия они создали первый электронный микроскоп, который позволял разглядеть клеточные составляющие размером до 1 нм.
Радиография
Радиография - передовой научный метод, позволяющий изучать химические вещества в клетке. Его суть заключается в том, что в исследуемой молекуле один из атомов заменяется радиоактивным изотопом. Этот изотоп становится своеобразной меткой. Помеченные частицы обнаруживают с помощью счётчика радиоактивных частиц или используют для этой цели их способность засвечивать фотоплёнку. В качестве радиоактивных меток обычно используют изотопы углерода (14С), водорода(3Н) или фосфора (32Р).
Ультрацентрифугирование
Этот способ применяется для извлечения и исследования отдельных клеточных органелл. Клетки разрушают, помещают в пробирки и вращают с высокой скоростью в специальном лабораторном приборе - ультрацентрифуге. Под действием центробежной силы структурные элементы клетки выделяются из субстрата. Скорость вращения ультрацентрифуги для осаждения разных типов органелл неодинакова и зависит от их размеров, формы и плотности. Чем выше скорость вращения, тем более лёгкие и мелкие частицы могут выпасть в осадок.
Кроме перечисленных методов, сегодня на вооружении науки находятся и другие физико-химические технологии выделения и исследования органелл и молекул в составе клетки.
Важность цитологических исследований
Все живые организмы, от бактерий до человека, имеют клеточное строение. Современная наука достигла понимания, что не просто важно, а жизненно необходимо знать, как устроено и функционирует всё живое. Ведь любое заболевание протекает на клеточном уровне и нарушает работу клеток, а иногда даже их структуру. Если понять, что происходит во время болезни в клетке, можно найти способ, как победить недуг.
Современные отрасли цитологии - клеточная и генная инженерия - помогают человеку в выведении новых сортов культурных растений, пород животных и получении нужных в медицине веществ.
Вопросы, решаемые судебно-цитологическим исследованием
Установление органно-тканевой принадлежности объекта экспертизы
Необходимость в таком исследовании возникает, когда следственные органы ставят перед судебно-цитологической экспертизой задачу по выявлению на орудиях травмы и других предметах частиц тканей и органов. В этих случаях сначала устанавливают природу частиц, т. е. происходят ли они из организма животного (человека) или от какого- либо растения или имеют небиологическое происхождение. Частицы снимают с предмета под контролем стереомикроскопа, а затем из них готовят препараты. Цитологическое исследование позволяет легко устанавливать клеточное строение биологических частиц и дифференцировать клетки растительного и животного происхождения. Если видовая принадлежность частиц животного происхождения неизвестна, то ее устанавливают серологическим методом (реакцией преципитации).
При достаточной величине объекта исследования для определения его органно-тканевой природы можно проводить гистологическое исследование. Кусочки высохших тканей целесообразно предварительно выдерживать во влажной камере или специальных жидкостях, чтобы по возможности восстановить их первоначальное состояние.
Выявление на орудиях травмы клеточных элементов животного происхождения и их комплексное исследование
В практической экспертной работе значительно чаще возникает необходимость выявлять на орудиях травмы не частицы органов и тканей, заметных невооруженным глазом, а микрочастицы и даже изолированные клетки. Методика такого исследования разработана и рекомендована А. П. Загрядской с сотрудниками (1982).
С поверхности предмета под контролем стереомикроскопа производят несколько смывов минимальным количеством жидкости в сочетании с соскабливанием наложений (смывы-соскобы). Если при стереомикроскопии не выявляются отчетливые участки биологических наложений, то с поверхности предмета делают смыв кусочком увлажненной марли, из которой затем экстрагируют клеточные элементы и готовят цитологические препараты. Обнаруженные в препаратах клетки животного происхождения изучаются с целью установления тканевой принадлежности. Вытяжки, полученные при экстрагировании клеточных элементов, используют для установления наличия крови хроматографическим методом и видовой принадлежности белка реакцией преципитации. Реакцией смешанной агглютинации выявляют в клетках групповые антигены АВН. После этого цитологическими методами определяют половую принадлежность клеток. Первоначально препараты красят флюорохромами для установления пола, и лищь затем осуществляют последующие исследования с соответствующими окрасками. РСА проводят всегда последней, так как после нее препараты уничтожаются.
Разработаны методики комплексного исследования клеточных элементов непосредственно на предмете. Это возможно на плоских осколках стекла и клинках острых орудий.
Цитология.Цели,задачи,этапы развития
Возникновение цитологии определено созданием и развитием оптических линз и сконструированного на базе этих линз микроскопа. Цитология изучает клетки многоклеточных организмов, ядерно-цитоплазматические комплексы, которые не расчленены на клетки, симпласты, плазмодии, синтеции, а так же одноклеточных животных, растений и бактерий.
В развитии цитологии выделяют три этапа: 1) XVII - конец XIX в. Период накопления фактов клеточного строения.1665 год.Р. Гук вводит термин «клетка».1672 год. Грю, Мальпиги на различных объектах повторяют опыты Гука.В конце XVII века цитология начала становиться. Антон ван Левенгук сконструировал примитивный микроскоп, дававший увеличение в 40 раз. Открыл в 1674 году эритроциты в клетках крови земноводных. 1675 год - одноклеточные растительные организмы. 1683 год - описал бактерии.«Пустота или воздушное пространство в оболочке» - первое определение клетки.Во второй половине XVII века Левенгук подарил Петру Iдва микроскопа. Тот заинтересовался и в 1698 году собрал русских мастеров для конструирования своего микроскопа. В результате исследований в начале XIX векаряда ученых (Линк Мондельхавер, Ламарк, Нербель, Курпена, Расспая, Пуркинье) утвердился взгляд на клетки как структурные единицы живого организма. В 1838 году ботаник Шлейден и зоолог Шванн в 1839 году сформулировали первую клеточную теорию. Благодаря этой теории сформулировалось представление, что функции организма в целом слагаются из активностей и взаимодействия отдельных клеточных единиц. В 1858 году немец Вихров, патологоанатом, применил клеточную теорию на своих объектах и доказал, что каждая клетка образуется в результате деления исходной клетки, а организмы образуются в результате слияния двух клеток, мужской и женской. Было описано ядро, как важнейший и неизменный компонент клетки. Была изучена протоплазма клетки, и первоначальное понятие о клетке превратилось в представление о массе протоплазмы, ограниченной в пространстве клеточной оболочкой и содержащей ядро. 1858 - масляный имерсионный объектив. 1873 год - линза-конденсор, собирающая и направляющая линза микроскопа. 1876 год - апохроматические объективы, устраняющие расслоение света. Былипредложен Кулибиным.Были открыты органоиды:
1876 год - клеточный центр (Бенеден, Бовери);
1897-98 - митохондрии (Бенда) в растительной (Альт);
Были открыты явления: -- амитоз, прямое деление клетки (Ремак);
--митоз,непрямое деление (Флеминг-Ж; Страсбургер-Р).
Описаны главные особенности митоза - формирования хромосом (1890) и создана теория индивидуальности хромосом.
Гертвиг опубликовал монографию «Клетка и ткани» (1892).В ней были обобщены все биологические деления, исходя из характерных свойств, строения и функций клетки . Монография подвела черту первому этапу развития цитологии.
2 ЭТАП) Конец XIX века - 20-е годы XX века.
Дальнейшее совершенствование техники. Кроме светлопольного конденсора был предложен темнопольный конденсор. С помощью этого прибора можно было исследовать объекты при боковом освещении. Эффект Тендаля - видим пылинкив луче света.Был также сконструирован поляризационный микроскоп, который позволял определять ориентацию частиц клетки. 1903 год - сконструирован ультрафиолетовый микроскоп. 1932 год - фазово-контрастный микроскоп и интерференционный микроскоп.
Метод выявления ДНК. Классическая реакция Фельгина. 1924 годСоздаются микроманипуляторы, с помощью которых можно было производить разнообразные операции.В 1909 году Гаррисон положил начало создания метода культуры ткани.В первые два десятилетия 20-го века все усилия были направлены на выяснения функций клеточных структур. Но это стало возможным только тогда, когда в 20-х годах сконструировали электронный микроскоп и появились методы рентгеноскопного анализа.Создания этого микроскопа открыло третий этап в развитии цитологии - современный.
3 ЭТАП) (С 20-х годов 20 века по наст. время)
Использование электронного микроскопа привело ксоздания субмикроскопической морфологии клетки.
Разрешение микроскопов: Световой микроскоп - не менее 0,2мкм.Электронный - 0,2 нм
Были обнаружены неизвестные детали строений клетки. Изучено строение плазматической мембраны. Изучено строение сети мембран - ЭПР.Были изучены лизосомы (гидролитические ферменты), пероксисомы, содержащие фермент каталазу и уринокиназу. Изучено строение рибосом. Открыт цитоскелет.
Сформулировались первые задачи цитологии:
1) изучить субмикроскопическое строение органоидов клетки;
2) изучить функции клеточных структур и их взаимодействие;
3) изучить способы проникновения веществ в клетку, выведения их из клетки, роли мембран;
4) реакция клеток на нервные и гуморальные стимулы окружающей среды;
5) Изучить взаимодействие клеток;
6) изучить репродукцию клеток и клеточных структур.
3)Современные положения клеточной теории:
1) Клетка - основная единица строения и развития всех живых организмов. Наименьшая единица живого.
2) Клетки всех одноклеточных и многоклеточных организмов сходны по своему строению, химическому составу, основным проявлениям жизнедеятельности и обмену веществ.
3) Размножение клеток происходит путем их деления. Каждая новая клетка образуются в результате деления исходной клетки.
4) В сложных многоклеточных организмах клетки специализированых организмах клетки образуют ткани. Из ткани состоят органы, которые тесно связаны между собой и подчинены нервным и гуморальным механизмам регуляции.
Клетка - ограниченная активной мембраной, упорядоченная структурированная система биополимеров, участвующих в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддерживание и воспроизведение всей системы.
Предмет, задачи и методы цитологии
Предметом ее изучения является клетка как структурная и функциональная единица жизни.
В задачи цитологии входит изучение строения и функционирования клеток, их химического состава, функций отдельных клеточных компонентов, познание процессов воспроизведения клеток, приспособления к условиям окружающей среды, исследование особенностей строения специализированных клеток, этапов становления их особых функций, развития специфических клеточных структур и др. Для решения этих задач в цитологии используются различные методы.
Основным методом изучения клеток является световая микроскопия. Человеческий глаз обладает разрешающей способнос-тьюоколо 100мкм(1 мкм = 0,001 мм). Это означает, что две точки, расположенн ые на расстоянии менее чем 100 мкм друг от друга, кажутся одной расплывчатой точкой. Чтобы различить более мелкие структуры, применяют оптические приборы, в частности микроскопы. Разрешающая способность микроскопов составляет 0,13—0,20 мкм, т. е. примерно в тысячу раз превышает разрешающую способность человеческого глаза. С помощью световых микроскопов, в которых используется солнечный или искусственный свет, удается выявить многие детали внутреннего строения клетки — отдельные органеллы, клеточную оболочку. Создать световой микроскоп с большим разрешением невозможно, потому что разрешающая способность связана с длиной волны световых лучей, а не только с качеством увеличительных стекол.
Для изучения ультратонкого строения клеточных структур прибегают к методу электронной микроскопии. В электронных микроскопах вместо световых лучей используется пучок электронов. Разрешающая способность современных электронных микроскопов составляет 0,1 нм, поэтому с их помощью выявляют очень мелкие детали. В электронном микроскопе видны биологические мембраны (толщина 6—10 нм), рибосомы (диаметр около 20 нм), микротрубочки (толщина около 25 нм) и другие структуры.
Для исследования химического состава, выяснения локализации отдельных химических веществ в клетке широко используются методы цито- и гистохимии, основанные на избирательном воздействии реактивов и красителей на определенные химические вещества цитоплазмы. Метод дифференциального (разделительного) центрифугирования позволяет разделить с помощью центрифуги содержимое клетки на отдельные разные по массе составляющие и затем детально изучить их химический состав. Метод рентгеноструктурного анализа дает возможность определять пространственное расположение и физические свойства молекул (например, ДНК, белков), входящих в состав клеточных структур.
Для выявления локализации мест синтеза биополимеров, определения путей переноса веществ в клетке широко используется метод авторадиографии — регистрации веществ, меченых радиоактивными изотопами. Многие процессы жизнедеятельности клеток, в частности деление клетки, фиксируют с помощью кино-и фотосъемки.
Изучение клеток разных органов и тканей растений и животных, процессов деления клетки, их дифференцировки и специализации проводят методом клеточных культур — выращиванием клеток (и целых организмов из отдельных клеток) на питательных средах в стерильных условиях.
При исследовании живых клеток, выяснении функций отдельных органелл применяют методы микрохирургии — оперативного воздействия на клетку, связанного с удалением или имплантированием отдельных органелл, их пересаживанием из клетки в клетку, введением в клетку крупных макромолекул и т. д.
Источник: Н.А. Лемеза Л.В.Камлюк Н.Д. Лисов «Пособие по биологии для поступающих в ВУЗы»
Методы цитологии
Строение, ультраструктура и функционирование клеточных органоидов исследуется в настоящее время с помощью следующих основных методов: световой и электронной, темнопольной, фазово-контрастной, поляризационной, люминесцентной микроскопии, используемых для изучения строения, ультраструктуры фиксированных клеток, и дифференциального центрифугирования, позволяющего выделять отдельные органоиды и анализировать их цитохимическими, биохимическими, биофизическими, и другими методами.
Световая микроскопия.
Принцип метода состоит в том, что пучок света, пройдя через объект, попадает в систему линз объектива, и строит первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив.
В современных микроскопах объективы сменные, что позволяют изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность, т.е. способность давать раздельное изображение двух близких друг к другу объектов.
Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например проекции на экран (до 10 5 раз). Разрешающая способность светового микроскопа ограничивается длиной волны света: чем меньше длина волны, тем выше разрешающая способность. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать фиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130 - 140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света.
Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.
Электронная микроскопия.
В принципе электронный микроскоп устроен так же, как и световой, только роль светового пучка выполняет в нем пучок электронов, а фокусируется этот пучок не линзами, а электромагнитами. Однако для пучка электронов длина волны значительно короче длин волн видимого света, что и обеспечивает более высокую разрешающую способность электронного микроскопа по сравнению со световым микроскопом. Разрешение у современных электронных микроскопов 0,2-1 нм.
В трансмиссионном электронном микроскопе электроны проходят сквозь объект подобно тому, как в световом микроскопе сквозь него проходит свет. В результате пучок электронов создает изображение объекта на фотографической пластинке.
Одно из главных неудобств электронного микроскопа заключается в том, что в камере должен поддерживаться высокий вакуум, потому что в воздушной среде электроны легко отклоняются и захватываются молекулами газа. Живая же материя не может существовать в высоком вакууме, так как в этих условиях испаряется вся содержащаяся в ней вода; поэтому при помощи трансмиссионного электронного микроскопа можно исследовать только фиксированный материал. Кроме того, срезы должны быть очень тонкими, чтобы сквозь них могли проходить электроны.
В сканирующем электронном микроскопе электроны отражаются от поверхности объекта и создают изображение при движении в обратном направлении. Предел разрешения у сканирующего микроскопа ниже, чем у трансмиссионного, и ему требуется не столь высокий вакуум. Благодаря этому с помощью сканирующего электронного микроскопа можно проводить прижизненные исследования некоторых организмов с достаточно твердыми покровами.
Он позволяет также получать превосходные фотографии, воспроизводящие в мельчайших деталях поверхности некоторых живых существ. Чтобы усилить контрастность конечного изображения, почти все объекты окрашивают. В световой микроскопии используют красители, а для трансмиссионного электронного микроскопа - фиксаторы, содержащие тяжелые металлы (например, четырехокись осмия, перманганат калия, свинец), способные поглощать электроны.
Для сканирующего электронного микроскопа материал часто замораживают, чтобы получить поверхность, покрытую льдом. При этом исключаются потери воды водорастворимых веществ, меньшими являются также химические изменения структур. При анализе данных, полученных с помощью электронного микроскопа, надо помнить, что этим методом исследуются статические состояния клетки в момент быстрой остановки движения цитоплазмы, вызванной воздействием фиксирующих химических веществ.
Темнопольная микроскопия.
Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.
Метод фазово-контрастной микроскопии основан на том, что отдельные участки прозрачной, в общем, клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света.
В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.
С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной скоростью поляризации.
После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой плоскостью поляризации. Когда между скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.
При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладают способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Этот принцип позволяет рассматривать флуоресцирующие объекты в зоне коротких волн.
В таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы. Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны. Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуоресцирующие вещества, которые избирательно связываются с определенными структурами, вызывая их вторичную люминесценцию.
Для изучения клеток органов и тканей животных используют метод клеточных культур. Простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой, помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинаются размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт.
Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. При культивировании вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру, и соблюдение стерильности. В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток. Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и генетических, вирусологических и биохимических исследований.
Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонадсадок к микроскопу. Живую клетку можно снимать и на кинопленку. Применяя такую ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная съемка), можно подробно видеть протекание важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д. Несмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале.
Задачи фиксации - это убить клетку, прекратить активность внутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежать потери структур и веществ, препятствовать появлению структур, отсутствующих в живой клетке. В качестве фиксаторов применяют альдегиды и их смеси с другими веществами, спирты, сулема, четырехокись осмия и др. После фиксации объекты подвергают дополнительной обработке - окрашиванию. Для окраски применяют различные натуральные (гематоксилин и кармин и др.) и главным образом синтетические красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Срезы до 5 -10 мкм получают на микротоме.
Существует ряд специфических красочных приемов направленных на выявление специфических химических веществ получил название гистохимических или цитохимических. Это собственно цитохимические реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность, связывание красителя, неизменность, локализация вещества. Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить с помощью цитофотометрии.
Основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны (например, при определении количества ДНК на клетку после реакции Фельгена). Количественную оценку получают не только поглощающие объекты и вещества, но и излучающие. Разработаны приемы количественной флуорометрии, позволяющие по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.
Для выявления белков, отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК-ДНК - гибридных молекул используют метод иммунофлуоресценции.
Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отдельных клеток широко используют метод авторадиографии - регистрации веществ, меченых изотопами. Например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.
В цитологии применяют различные аналитические и препаративные методы биохимии. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные клеточные компоненты и изучать их химию, ультраструктуру и свойства. В настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры.
Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения состоит в том, что время для оседания частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Чтобы ускорить этот процесс оседания используют ускорения, создаваемые центрифугой.
При повторном дробном центрифугировании смешанных подфракции можно получить чистые фракции. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе. Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическими способами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронного микроскопа.
Контрольные вопросы:
1. Уровни организации живой материи
2. Клеточная теория организации организмов
3. Методы исследования в цитологии
4. Задачи и предмет цитологии
5. Устройство светового микроскопа
6. Устройство электронного микроскопа
7. Техника безопасности при цитологических работах
8. Требования к подготовке биологического материала для цитологического исследования
9. Фиксирующие вещества, механизм действия
10. Цитохимия, требования к материалу и возможности
11. Количественный анализ (морфометрия), требования и возможности
12. Артефакты в цитологии, пути объективизации результатов
Рекомендуемая литература:
1. Заварзин А.А., Харазова А.Д. Основы общей цитологии. - Л., 1982.
2. Ченцов Ю.С. Основы цитологии. - М., 1984.
3. Шубникова Е.А. Функциональная морфология тканей. - М., Изд-во МГУ, 1981.
Читайте также: