Выделение грибов. Неселективные среды для грибов. Селективные среды для грибов. Выявление противогрибковых антител ( AT ). Выявление грибковых антигенов ( Аг ).

Обновлено: 21.09.2024

Мате­риалом для исследования являются пораженные волосы, чешуйки кожи, кусочки ног­тей, кожные и ногтевые соскобы, гной, мокрота, пунктаты лимфатических узлов, костного мозга, внутренних органов, кровь, спинномозговая жидкость, желудочный сок, желчь, испражне­ния, биоптаты и др. Материал берут стерильными инструментами (пинцетом, скальпе­лем, иглой, ножницами, ло­жечкой Фолькмана и т.д.); тампоны для взятия ма­териала не используются. Пато­логический материал обрабатывают смесью едкого калия с диметисульфоксидом (20 г КОН + 100 мл 60%-го ДМСО). Препараты «раздавленной капли» исследуют под большим увеличением (х40) обычного или фазово-контрастного микроскопа.

У больных микроспорией в лучах люминесцентной лампы пораженные волосы имеют изумрудно-зеленое свечение.

Для диагностики микозов применяется широкий комплекс лабораторных исследований (микроскопический, микологический, аллергический, серологический, генетические методы, биопроба - схема 23).

Схема 23. Лабораторные методы диагностики микозов

Мате­риал для исследования: пораженные волосы, чешуйки кожи, кусочки ног­тей, кожные и ногтевые соскобы, гной, мокрота, пунктаты лимфатических узлов, костного мозга, внутренних органов, кровь, спинномозговая жидкость, желудочный сок, желчь, испражне­ния, биоптаты и др.

Экспресс-диагностика: РИФ, ПЦР

Микроскопический метод: исследование нативных и окрашенных препаратов с целью обнаружения элементов гриба (мицелия, спор)

Микологический метод: посев на специальные питательные среды (Сабуро и др.). Идентификация выделенной культуры гриба на основании характеристики колоний, микроскопического строения гриба, а также по биохимическим и другим признакам.

Серологический метод: определение антител к грибам или их антигенам в сыворотке крови больных микозами с помощью РА, РСК, РНГА, РИФ, ИФА, иммуноблотинга

Аллергический метод: постановка внутрикожных аллергических проб с грибковыми аллергенами

Биопроба: заражение чувствительных жи­вотных с последующим выделением чистой культуры гриба

Микроскопический метод играет важную роль в диагностике микозов, т.к. дает возможность быстро выявить в нативных и окрашенных препаратах наличие и расположение клеток, спор гриба и нитей мицелия в патологическом материале. Наиболее часто для окраски грибов применяют общепринятые методы Грама, Романовского-Гимза, Циля-Нильсена, Бурри. Разработан также широкий набор специальных методов окраски грибов.

Экспресс-диагностика микозов осуществляется с помощью прямой РИФ.

Микологический метод (выделение чистой культуры гриба и ее идентификация) является важнейшей составной частью лабораторного исследования при микозах. Посевы производят на специальные плотные и жидкие (неселективные и селективные) питательные среды (среды Сабуро - мальтозо-пептонная, сусло-агар, Чапека; кукурузный, рисовый, картофельный, кровя­ной, шоколадный, сердечно-мозговой, угольно-дрожжевой агар и т.д.). Селективные среды содержат антибиотики (левомицетин, стрептомицин, пенициллин и др.), красители (бенгальский розовый и др.) или дезинфицирующие вещества. В отличие от слабощелочных сред для выращивания большинства бактерий, среды для культивирования грибов имеют кислую или слабокислую рН (5,7-6,8).

Для первичной дифференциации грибов разработан агар CHROM с хромогенными субстратами, расщепляющимися ферментами грибов с образованием окрашенных соединений, в результате чего колонии различных видов грибов окрашиваются в разные цвета - красный, желтый, белый, кремовый, ко­ричневый, черный и т.д.

Культивирование грибов осуществляют обычно при температуре 22-28 0 С в течение 2-4 недель. Идентификацию выделенной культуры гриба проводят на основании характеристики колоний (внешний вид, форма, консистенция, цвет), микроскопического строения гриба (строение мицелия, форма и расположение конидиеносцев и конидий - спор), а также по биохимическим и другим признакам.

Серологический метод - определение антител к грибам или их антигенам в сыворотке крови больных микозами с помощью РА, РСК, РНГА, РИФ, ИФА, иммуноблотинга

Аллергический метод - постановка внутрикожных аллергических проб. Проводят с грибковыми аллергенами, представляющих собой взве­си из убитых грибов, фильтраты обезвреженных нагреванием культур, полисахаридные и бел­ковые фракции клеток гриба. Результаты аллергических проб учитывают через 20 мин (не­медленные) и через 24-48 ч (замедленные реакции).

Для выявления грибковой сенсибилизации орга­низма также применяют иммунологические тесты in vitro (дегрануляция базофилов как тест гиперчувствительно­сти немедленного типа, а для выявления гиперчувстви­тельности замедленного типа - реакцию торможения миграции лейкоцитов или бласттрансформации лимфоцитов).

Биопроба - заражение чувствительных жи­вотных (мыши, крысы, хомяки, кролики, морские свинки, соба­ки, кошки) различными способами (накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутрисердечно, интрацеребрально, перорально, интратрахеально) для выделения чистой культуры гриба.

Гистологический метод направлен на обнару­жение гриба в тканях, полученных при биопсии и аутопсии.

Генодиагностика. Разработана ПЦР для выявления в материале от больного специфических фрагментов ДНК грибов, позволяющая вы­явить около 40 видов грибов, в том числе Candida albicans и ее варианты, Т. rubrum и С. neoformans, различные виды Aspergillus, возбудителей паракокцидиоидомикоза (Paracoccidioides brasiliensis) и гистоплазмоза (Histoplasma capsulatum).

Выделение грибов. Неселективные среды для грибов. Селективные среды для грибов. Выявление противогрибковых антител ( AT ). Выявление грибковых антигенов ( Аг ).

Медицинская микробиология:

Диагностические питательные среды для грибов

а) Агар Сабуро — основа сред для выделения и культивирования грибов.

Состав:
• питательный агар — 1000 мл,
• глюкоза 40,0 г.
• pH-5,6±0,2.
• Стерилизовать при 121°С 15 мин.

Для придания селективных свойств в среду перед стерилизацией вносят 0,05 г левомицетина сукцината (хлорамфеникола)

б) Селективная и дифференциальная среда с 2,3,5-трифенил- тетразолиумхлоридом для выделения и дифференциации видов рода Candida.

Состав:
• агар Сабуро — 1000 мл,
• 2,3,5-тетразолиум-хлорид — 0,1 г.

Приготовление:
Перед употреблением в расплавленный питательный агар Сабуро вносят навеску 2,3,5-тетразолиума хлорида, растворенную в небольшом количестве стерильной воды, перемешивают и разливают по чашкам Петри.

в) Картофельно-морковная среда с желчью (РСВ) для идентификации С. albicans на основании микроморфологических признаков.

Состав:
• очищенная от кожуры морковь (натертая на терке) — 20,0 г,
• очищенный от кожуры картофель (натертый на терке) — 20,0 г,
• агар — 25,0 г,
• свежая бычья желчь — 150 мл,
• дистиллированная вода — 1000 мл.
• pH-6,0 ± 0,2.

Приготовление:
Агар и натертые овощи помещают в колбу с водой, доводят агар до растворения при подогревании, устанавливают pH, стерилизуют при 121°С -15 минут. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной агаровой среде добавляют свежую бычью желчь, среду разливают в чашки Петри.

г) Кукурузно-агаровая среда для идентификаци C.albicans на основании микроморфологических признаков.

Состав:
• настой кукурузной муки — 50,0 г,
• глюкоза — 2,0 г,
• агар — 15,0 г,
• вода дистиллированная — 1000 мл.
• pH-6,0 ± 0,2.

Приготовление:
Готовят настой кукурузной муки до полного ее растворения в воде. К готовому настою добавляют основные ингредиенты, устанавливают pH, стерилизуют при 121°С — 15 мин.

д) Агаровая среда (модифицированная) для теста на использование нитрата.

Состав:
• нитрат калия KNO3 1,6 г,
• глюкоза — 40,0 г,
• бромтимоловый синий — 0, 12 г,
• агар — 16,0 г,
• вода дистиллированная — 1000 мл.
• рН - 6,0±0,2.

Приготовление:
Ингредиенты смешивают, помещают в воду, смесь нагревают при помешивании до кипения и полного растворения. Смесь должна иметь желтый цвет. Для доведения pH до 5,9-6,0 к смеси но каплям добавляют 1 N NaOH до приобретения зеленого цвета. Реакцию среды проверяют с помощью индикаторной бумаги или другим способом. Среду разливают по флаконам, стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Готовую среду разливают по чашкам или пробиркам (для получения скошенного агара). Среду засевают тестируемым грибом и инкубируют не менее 7 суток при температуре 25-30°С. При отрицательной реакции цвет среды — зеленовато-желтый, при положительной — голубой.

е) Агар Диксона.

Состав:
• солодовый экстракт — 18,9 г,
• пептон — 18,0 г,
• агар — 7,25 г,
• обезвоженная бычья желчь — 10,0 г,
• твин-40 - 5 мл,
• глицерина моноолеат — 2,5 мл,
• дистиллированная вода — 500 мл.
• рН-5,6±1.

Приготовление:
Ингредиенты увлажняют частью взятой воды, а остальную часть воды нагревают до кипения и вносят в емкость с увлажнёнными ингредиентами, смешивают и стерилизуют при 12Г’С в течение 10 мин. Разливают по пробиркам или чашкам Петри.
На среде можно выращивать культуры малассезий или патологический материал, например, чешуйки кожи от пациента.

ж) Варианты солевого агара (солетолерантная среда) с различными концентрациями хлорида натрия.

Состав:
• глюкоза — 20,0 г,
• дрожжевой экстракт — 10,0 г,
• агар — 10,0 г,
• натрия хлорид (NaCl) — 110, 120 или 130 мг
• дистиллированная вода — 1000 мл
• pH 5,6±0,2.

Среду стерилизуют при 121°С в течение 15 мин., а затем разливают в чашки Петри.

з) Дифференциальная среда Штайба (для выделения Cryptococcus neoformans).

Состав:
• семена Guizotia abissinica (продаются в зоомагазинах) — 50,0 г,
• глюкоза — 1,0 г,
• креатинин — 1,0 г,
• калия дигидрофосфат КН2PO4 —1,0 г,
• агар — 15,0 г,
• дистиллированная вода — 1000 мл
• pH 5,5.

Приготовление:
50,0 г растертых семян Guizotia abissinica добавить к 1000 мл дистиллированной воды, кипятить в течение 30 мин и затем профильтровать через бумажный фильтр. Довести водой объем фильтрата до 1000 мл и добавить остальные ингредиенты. Автоклавировать при 110°С в течение 20 мин. Среда должна быть бесцветной и иметь pH 5,5. Для подавления бактериальной микробиоты к охлажденной среде добавить 40 ЕД/мл стрептомицина и 20 ЕД/мл пенициллина. Коричневая окраска колоний С. neoformans (в отличие от других микроорганизмов) появляется на 4-10-й день культивирования.

и) Агаризованная среда L-DOPA (для идентификации Cryptococcus neoformans).

Состав:
• L-аспарагин — 1,0 г,
• глюкоза — 1,0 г,
• КН2РО4 - 3,0 г,
• MgSO3*7H2O - 0,25 г,
• тиамин — НС1 — 1,0 г,
• биотин — 5,0 мкг,
• L-DOPA — 100,0 мг,
• агар — 20,0 г.
• дистиллированная вода — 1000 мл • pH 5,6.

к) Сусло-агар. Солодовое сусло профильтровать, разбавить в 2 раза водопроводной водой, разлить в пробирки или колбы и стерилизовать при 121°С 30 минут. Затем из сусла приготовить 2%-ную агаровую среду.

л) Картофельный агар для выделения и быстрой идентификации плесневых грибов.

Состав:
• обезвоженные картофельные хлопья — 20,0 г,
• глюкоза — 10,0 г,
• агар — 15,0 г,
• дистиллированная вода — 1000 мл.

Смешивают ингредиенты и доводят смесь до кипения при постоянном помешивании. Стерилизуют среду при 121°С 15 мин Разливают в чашки Петри или пробирки. Картофельные хлопья оседают на дно, но среду не нужно взбалтывать.

м) Агар Чапека-Докса.

Состав:
• глюкоза — 20,0 г,
• калий моногидрофосфат К2НРО4 - 1,0 г,
• нитрат натрия NaNO3 - 3,0 г,
• хлористый калий КС1 — 0,5 г,
• MgSO4 • 7Н2O — 0,5 г,
• FeSO4 - 0,015 г,
• агар — 20,0 г,
• водопроводная вода 1000 мл.

Стерилизовать в течение 30 минут при 0,5 атм.

н) Окраска калькофлуором белым.

Приготовление реактива. Растворить 0,1 г калькофлуора белого (M2R) и 0,05 Эванса голубого в 100 мл дистиллированной воды, тщательно перемешать и хранить в темной емкости при комнатной температуре.

Окрашивание: добавить 1 каплю раствора калькофлуора белого и 1 каплю 10 %-ного раствора едкого кали КОН к исследуемому образцу на предметном стекле, накрыть покровным стеклом. Просматривать в УФ-свете, используя возбуждающий фильтр К530 и барьерный фильтр В12 (или G365 возбуждающий и LP420 барьерный фильтры).

Элементы гриба флуоресцируют зеленым или голубовато-белым светом (в зависимости от сочетания фильтров) на тусклом красноватом фоне.

Микологический (культуральный) метод диагностики микозов (грибковой инфекции)

Культуральные методы исследования до сих пор остаются предпочтительными при диагностике микозов. В медицинских микологических лабораториях основной средой для выделения патогенных грибов различных систематических групп является среда Сабуро, жидкая и агаризованная. Для предотвращения роста бактерий в среду добавляют антибиотики — пенициллин и стрептомицин (по 50-100 Ед/мл), либо хлорамфеникол и гентамицин (0,05 г/л), а также циклогексимид (актидион: 0,5 г/л) для сдерживания роста быстрорастущих сапрофитных грибов при изоляции дерматофитов и агентов подкожных микозов.

а) Методы посева патологического материала. После предварительного исследования биосубстратов под микроскопом клинический материал засевают на питательные среды. Посев проводят в стерильном боксе стерильной пастеровской пипеткой, пинцетом, шприцем и т.д. с использованием пламени спиртовки или газовой горелки. При проведении количественных исследований разведенные биосубстраты (мокрота, промывные воды бронхов, гайморовых полостей, моча, кал и пр.) засевают на агар мерно в количестве 0,1 мл. Перед посевом проводят контрольный забор воздуха в боксе на стерильность, чашку инкубируют при 25-30°С.

При проведении исследований на диморфные грибы для выявления психрофильных возбудителей, не растущих при 37°С (Geotrichum candidum, Absidia coerulea), или термотолерантных, слабее растущих при 25-30°С (Rhizopus arrhizus), а также для дифференцированного выделения из патологического материала нескольких видов грибов при смешанных инфекциях, делают парные посевы, так как быстро растущие психрофильные виды при исследовании в одном температурном режиме (25-30°С) могут вытеснять более термотолерантные виды. Посевы проводят в двух емкостях.

1. Кератиновые ткани. В случаях поверхностных микозов используют две среды Сабуро: для выделения дерматофитов — агар Сабуро с циклогексимидом (0,5 г/л) для предотвращения роста сапрофитных грибов и агар Сабуро без циклогексимида, но с гентамицином или хлорамфениколом для выделения не дерматофитных плесневых и дрожжеподобных грибов. Посевы инкубируют в течение 2 недель при температуре 25-30°С.

Соскобы со слизистой полости рта, вагины, уретры засевают на среду Сабуро и инкубируют при 37(’С в течение 7 дней.

Соскобы с роговой оболочки глаз, слизистой носа, отделяемое наружного слухового прохода, поверхностных ран, язв после посева инкубируют на среде Сабуро при 25-30°С. Срок инкубации — 7-10 дней.

2. Кровь засевают в соотношении 1:3 или 1:10 в следующие среды: во флаконы для гемокультур, в бульон Сабуро (среда накопления) или в сердечно-мозговую двухфазную среду. Посевы выращивают в течение 10 дней при температуре 37°С.

При посеве крови в среду накопления (жидкая среда Сабуро) на второй, пятый и седьмой день делают контрольный высев осадка на чашки с агаром Сабуро, которые выдерживаю т в термостате 2-5 суток при температуре 25-30°С и 37°С.

Использование двухфазной среды значительно увеличивает процент выявления грибов и сокращает время инкубации. При посеве крови в двухфазную среду необходимо смачивать поверхность агара засеянным бульоном дважды в день в течение 2 дней и один раз в день — последующие 5 дней. Контрольные высевы не производятся.

3. Спинномозговая жидкость (ликвор). Осадок ликвора засевают на две чашки с агаром Сабуро по 0,1 мл, а остаток спинномозговой жидкости — в пробирки с жидкой средой Сабуро. Чашки инкубируют при 25-30°С и 37°С, жидкую среду — при 25-30"С. Срок инкубации — 10 дней. Посевы начинают просматривать со второго дня. Если на 5-й день рост не обнаружен, производят высев из жидкой питательной среды на чашки с агаром Сабуро. Повторный посев также инкубируют при двух температурах.

4. Жидкости тела. Мокроту, промывные воды бронхов, гайморовых полостей, мочу, сок простаты, желчь, дуоденальный сок, абдоминальную, синовиальную жидкости и др. после предварительной обработки засевают в количестве 0,1 мл на агар Сабуро и инкубируют при 25-30"С и 37°С в течение 7-10 дней.

5. Гной. Материал засевают на агар Сабуро и/или сердечно-мозговой агар, инкубируют при 25-30°С и 37°С в течение 7-10 дней, а в случаях мицетомы — до 4 недель.

6. Ткани. Небольшие фрагменты ткани растирают шпателем по поверхности агара Сабуро. Одновременно кусочки ткани помещают в жидкую среду Сабуро. Посевы инкубируют при 25-30°С и 37°С в течение 10-14 дней.

7. Фекалии. Фекалии разводят 1:10 (1,0 г фекалий и 9 мл физиологического раствора или стерильной воды), размешивают, отстаивают 10 мин для осаждения крупных частиц, затем надосадочную жидкость в количестве 0,1 мл засевают на агар Сабуро. Посев инкубируют при 25-30°С и 37°С в течение 7 дней.

б) Культивирование и интерпретация результатов. Засеянные чашки начинают просматривать на второй день после посева с целью обнаружения начала роста возбудителей и дифференциации их от сапрофитов окружающей среды, которые могут контаминировать посевы. Особенно это важно при исследовании биосубстратов на наличие мицелиальных грибов. При обнаружении плесневых колоний отмечают рост культуры в точке посева и отсутствие роста идентичных штаммов в контрольной чашке (проверка микробиологической чистоты воздушной среды в боксе). Рост грибов Candida и Aspergillus можно видеть уже на 2-3-й день. При наличии медленно растущих патогенов время инкубации продлевается с одновременным пересевом на селективные среды для идентификации и предотвращения зарастания культур сапрофитными контаминантами.

При мерном посеве патологического материала проводят количественный учет выросших колоний в колониеобразующих единицах на 1 мл исследуемого биосубстрата (КОЕ/мл) по формуле п=а*b*с, где а — среднее число колоний, b=10 при объеме посевного материала 0,1 мл, с — степень разведения материала (10, 100, 1000). При интерпретации результатов исследования на кандидоз учитывают количественные критерии содержания Candida в биосубстратах. Так, в норме у здорового человека грибы рода Candida могут присутствовать в смывах с гениталий, в содержимом желудка — до 10 2 КОЕ/мл, в мокроте, смывах с полости рта, в носоглоточной слизи — до 10 3 КОЕ/мл, в кале — до 10 4 КОЕ/мл. В стерильных жидкостях организма (крови, ликворе, содержимом желудочков мозга, желчи, синовиальной суставной жидкости, соке простаты, моче и т.д.) грибы должны отсутствовать. Бронхоальвеолярный лаваж от иммуносупрессированных пациентов расценивают как стерильный биосубстрат для всех возбудителей, кроме Candida.

При посевах отделяемого невскрывшихся абсцессов, биоптатов и пр. количественный учет грибов не проводят, диагностическое значение имеет наличие роста возбудителя. Выявление дерматомицетов при исследовании кожи, волос и ногтей почти всегда свидетельствует о наличии микоза. Клиническое значение выделения различных микромицетов из нестерильных в норме биосубстратов: с поверхности кожи, в соскобах со слизистых оболочек, язв и т. п. неодинаково. При оценке результатов анализа учитывают характер роста выявляемых культур (единичный, умеренный, значительный; рост в точках посева, идентичность возбудителя в парных посевах и т. п.), данные предварительного микроскопического исследования патологического материала, наличие характерных клинических проявлений и сопоставление с литературными данными других исследователей.

Помимо основной среды Сабуро, в современных микологических лабораториях широко используются хромогенные среды («CandiSelect 4»,«Candida ID 2 Agar» и пр.) для первичного выделения дрожжевых грибов, которые позволяют визуально выявлять смешанные культуры дрожжевых возбудителей и значительно облегчают идентификацию Candida spp. Наиболее распространенные виды Candida (С. albicans, С. kmsei, С. tropicalis, С. glabrata и др.) на хромогенных средах идентифицируют по специфическому для вида окрашиванию колоний.

В случае отсутствия в лаборатории хромогенных сред и идентификационных тест-систем для определения дрожжевых грибов используют сыворотку крови, картофельный или кукурузный агары (идентификация С. albicans), агар с дигидроксифенилаланином — для определения Cryptococcus neoformans и т.д.

Плесневые грибы при наличии спороношения можно идентифицировать на среде Сабуро. Но если позволяют время и возможности, грибы пересевают на селективные среды, на которых грибы образуют типичные для своего вида колонии, стимулирующие образование конидий или других характерных структур, важных для определения возбудителя. С целью идентификации видов аспергиллов, пенициллов и других плесневых возбудителей используют агар Чапека, картофельный, кукурузный и дугие агары. Для выявления дрожжевой фазы диморфных грибов применяется сердечно-мозговой агар. Кукурузный агар с сахарозой и дрожжевым экстрактом подходит для спорообразования у некоторых зигомицетов и т.д. Для выполнения посевов разработаны также коммерческие стандартные среды.

Идентификацию выделенных культур производят, прежде всего по морфологическим признакам колоний (по цвету, размеру, структуре, характеру поверхности, пигментации, наличию экссудата и пр.), по микроморфологии гриба (по наличию перегородок в мицелии, псевдомицелия, почкующихся клеток, артроспор, строению конидиеносцев, расположению и форме конидий и т.д.) и биохимическим особенностям (ферментативной и ассимиляционной активности). Микроморфологию гриба изучают в нативных препаратах с добавлением смеси равных объемов спирта, воды и глицерина.

в) Определение чувствительности выделенных культур грибов к антимикотическим препаратам. При диагностике микозов, вызванных дрожжевыми грибами, помимо видовой идентификации возбудителя нужно проводить определение чувствительности к антимикотикам. При невозможности таких исследований в лечении можно использовать имеющиеся в литературе сведения об устойчивости выделенного вида к определенным препаратам. Но часто этого недостаточно, так как даже хорошо изученная и описанная лекарственная чувствительность у ряда видов Candida значительно варьирует у разных штаммов этого вида. У внутрибольничных патогенов возможно развитие резистентности к постоянно применяемым в стационаре ранее эффективным антимикотикам, и простое определение вида возбудителя теряет клиническое значение без последующего проведения теста на чувствительность.

Для определениия чувствительности дрожжевых грибов к антимикотикам применяют стандартизованный метод микроразведений в среде RPMI 1640, используемой в коммерческих тест-системах (например, «Fungitest», Bio-Rad).

Выбор антимикотиков для лечения плесневых микозов представляет определенные трудности, так как стандартизированный метод серийных разведений для плесневых грибов еще не разработан в полном объеме. Можно проводить определение чувствительности диско-диффузионным методом. Но результаты, полученные in vitro, могут не соответствовать эффективности проведенной терапии. На данном этапе установлены минимальные подавляющие концентрации современных антимикотиков (амфотерицин В, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, вориконазол) в отношении основных возбудителей плесневых микозов, с учетом которых проводят эмпирическую терапию, одновременно руководствуясь опубликованным опытом других клиницистов.

Иммунологический метод и ПЦР диагностика микозов (грибковой инфекции)

Диагностическая ценность иммунологических тестов возрастает при висцеральных микозах из-за трудности выделения тканевых форм возбудителей. Традиционные микологические методы (микроскопия, посев, гистологическое исследование) нередко недостаточно чувствительны и не всегда специфичны. Они могут потребовать длительного времени, а для получения материала может быть необходимо проведение инвазивных процедур. При диагностике микозов среди различных иммунологических методов исследования наибольшее распространение получили реакция связывания комплемента (РСК), реакция иммунодиффузии (РИД), иммуноэлектрофореза (ИЭФ). С помощью иммунодиагностики можно проводить мониторинг эффективности проводимого лечения по снижению титров антител. Для более точной диагностики рекомендуется параллельно использовать несколько методов.

Однако все серологические методы по определению вида и титра специфических антител в крови имеют ограничения в возможности диагностики заболевания. Так, их специфичность и чувствительность зависят от качества и стандартизации антигенных препаратов. Наличие перекрестных реакций может давать ложноположительный ответ, а в случаях снижения или отсутствия иммунного ответа у иммуносупрессированных пациентов — ложноотрицательный. В данной области чувствительные и специфичные стандартизованные серологические методы разработаны лишь для криптококкоза, инвазивного аспергиллеза и эндемичных микозов (кокцидиоидоз, гистоплазмоз, бластомикоз, паракокцидиоидоз).

В рутинной лабораторной практике наиболее распространены исследования по выявлению в крови антигенов грибов (ИФА или латекс-агглютинация). Быстрый и эффективный метод диагностики криптококкоза — определение полисахаридного антигена капсулы Cryptococcus в ликворе и сыворотке крови («Pastorex Cryptoplus», Bio-Rad) обладает чувствительностью и специфичностью соответственно в 90-95% и 60-70% случаев. Ложноположительные результаты возможны при наличии ревматоидного фактора и при злокачественном новообразовании.

а) Инвазивный аспергиллез диагностируют по наличию антигена галактоманнана в сыворотке крови. Чувствительность и специфичность теста «Platelia Aspergillus» (Bio-Rad) составляет 80 -90 %. Ложноположительные результаты могут вызываться эмпирической антифунгальной терапией, применением некоторых антибактериальных препаратов (пиперациллина), наличием галактоманнана в продуктах питания (крупа, макароны), а также перекрестными реакциями с экзоантигенами бактерий и других грибов. Определение антител не применяют в связи с нарушением их продукции у иммуносупрессированных пациентов. Эти исследования имеют значение для диагностики хронического некротизирующего аспергиллеза и аспергилломы.

б) Инвазивный кандидоз. Существующие методы определения специфических антител характеризуются низкой чувствительностью и специфичностью в связи наличием антител у больных с поверхностной колонизацией желудочно-кишечного тракта, а также нарушением продукции иммуноглобулинов у пациентов с иммуносупрессией. Выявление антигена маннана — компонента клеточной стенки Candida затруднено в связи с коротким временем выведения из кровотока и связыванием с антиманнановыми антителами. Чувствительность и специфичность имеющихся тестов для определения маннана не превышают 50%.

в) Молекулярные методы исследования патологического материала. В настоящее время широко и интенсивно изучается возможность применения ПЦР в диагностике микозов. В качестве исследуемого материала берут кровь, возможно использование мочи, слюны или ногтевых пластинок при выявлении дерматофитов. Разработаны праймеры к разным возбудителям. Диагностическая чувствительность, специфичность и скорость проведения реакции зачастую превосходят таковые при культуральном и серологических методах исследовании патологического материала. Однако ПЦР не может полностью заменить другие методы исследования, так как разработанные тест-системы не охватывают весь спектр условно-патогенных возбудителей. Кроме того, при работе этим методом возникает ряд проблем: ложноположительные результаты из-за контаминации образцов, сверхчувствительности этой реакции, а также из-за наличия ингибиторов ПЦР в образце и др.

Реже применяется газожидкостная хроматография, выявляющая некоторые компоненты клеточной стенки гриба в крови. Хроматография, как правило, ограничивается диагнозом кандидозов.

47. Антигены грибов.

Антигенное строение грибов достаточно сложное и требует дальнейшего изучения. Условно антигены грибов можно разделить на 2 группы по биохимической природе: белковые и полисахаридные. Белковые — сильные иммуногены и ответственны за развитие гуморального иммунного ответа в макроорганизме с образованием иммуноглобулинов классов G и М. Белковые антигены грибов и антитела к ним можно выявить в реакции агглютинации, РСК и использовать эти реакции в иммунодиагностике микозов — заболеваний, вызываемых грибами. Вторая группа антигенов (полисахаридной природы) обусловливает клеточный иммунный ответ и развитие гиперчувствительности замедленного типа. Сенсибилизация организма грибами и проявление микозов всегда сопровождаются состоянием инфекционной аллергии, что позволяет использовать в диагностике этих заболеваний внутрикожные аллергические пробы с соответствующими аллергенами из грибов-возбудителей.

48. Антигены простейших.

49. Протективные антигены микробов.

Особую группу составляют протективные антигены ( Аг ) [от лат. protectio, защита] — термолабильные белки, иммунизация которыми защищает лабораторных животных от гибели после заражения летальными дозами патогенных микроорганизмов. В настоящее время подобные Аг выделены у возбудителей сибирской язвы, чумы, бруцеллёза, туляремии и коклюша. Нередко протективные

Антигены ( Аг ) применяют для изготовления вакцин. Это единственное что я нашел.

50.Антигены эритроцитов человека: значение при переливание крови.

В мембране эритроцитов человека содержится более 300 различных антигенных детерминант, молекулярное строение которых закодировано соответствующими генными аллелями хромосомных локусов. Количество таких аллелей и локусов в настоящее время точно не установлено.

Термин «группа крови» характеризует системы эритроцитарных антигенов, контролируемых определенными локусами, содержащими различное число аллельных генов, таких, например, как A, B и 0 в системе AB0. Термин «тип крови» отражает её антигенный фенотип (полный антигенный «портрет», или антигенный профиль) — совокупность всех групповых антигенных характеристик крови, серологическое выражение всего комплекса наследуемых генов группы крови.

Две важнейшие классификации группы крови человека — это система AB0 и резус-система.

Известно также 46 классов других антигенов, из которых большинство встречается гораздо реже, чем AB0 и резус-фактор.

Система AB0

Известно несколько основных групп аллельных генов этой системы: A¹, A², B и 0. Генный локус для этих аллелей находится на длинном плече хромосомы 9. Основными продуктами первых трёх генов — генов A¹, A² и B, но не гена 0 — являются специфические ферменты гликозилтрансферазы, относящиеся к классу трансфераз. Эти гликозилтрансферазы переносят специфические сахара — N-ацетил-D-галактозамин в случае A¹ и A² типов гликозилтрансфераз, и D-галактозу в случае B-типа гликозилтрансферазы. При этом все три типа гликозилтрансфераз присоединяют переносимый углеводный радикал к альфа-связующему звену коротких олигосахаридных цепочек.

Структура олигосахаридов H-антигена, отвечающего за группы крови системы АВ0

Субстратами гликозилирования этими гликозилтрансферазами являются, в частности и в особенности, как раз углеводные части гликолипидов и гликопротеидов мембран эритроцитов, и в значительно меньшей степени — гликолипиды и гликопротеиды других тканей и систем организма. Именно специфическое гликозилирование гликозилтрансферазой A или B одного из поверхностных антигенов — агглютиногена — эритроцитов тем или иным сахаром (N-ацетил-D-галактозамином либо D-галактозой) и образует специфический агглютиноген A или B.

В плазме крови человека могут содержаться агглютинины α и β, в эритроцитах — агглютиногены A и B, причём из белков A и α содержится один и только один, то же самое — для белков B и β.

Таким образом, существует четыре допустимых комбинации; то, какая из них характерна для данного человека, определяет его группу крови:

A и B: четвёртая (AB)

Система Rh (резус-система)

Резус-фактор

Резус крови — это антиген (белок), который находится на поверхности красных кровяных телец (эритроцитов). Он обнаружен в 1940 году Карлом Ландштейнером и А.Вейнером. Около 85 % европейцев (99 % индейцев и азиатов) имеют резус и соответственно являются резус-положительными. Остальные же 15 % (7 % у африканцев), у которых его нет, — резус-отрицательный. Резус крови играет важную роль в формировании так называемой гемолитической желтухи новорожденных, вызываемой вследствие резус-конфликта иммунизованной матери и эритроцитов плода.

Известно, что резус крови — это сложная система, включающая более 40 антигенов, обозначаемых цифрами, буквами и символами. Чаще всего встречаются резус-антигены типа D (85 %), С (70 %), Е (30 %), е (80 %) — они же и обладают наиболее выраженной антигенностью. Система резус не имеет в норме одноименных аг­глютининов, но они могут появиться, если резус-отрицательному человеку перелить резус-положительную кровь.

Теория совместимости групп крови AB0 возникла на заре переливания крови, во время Второй Мировой войны, в условиях катастрофической нехватки донорской крови.

Схема переливания разногруппной крови

Доноры и реципиенты крови должны иметь «совместимые» группы крови. В России по жизненным показаниям и при отсутствии одногруппных по системе АВ0 компонентов крови (за исключением детей) допускается переливание резус-отрицательной крови 0(I) группы реципиенту с любой другой группой крови в количестве до 500 мл. Резус-отрицательная эритроцитная масса или взвесь от доноров группы А(II) или В(III), по витальным показаниям могут быть перелиты реципиенту с AB(IV) группой, независимо от его резус-принадлежности. При отсутствии одногруппной плазмы реципиенту может быть перелита плазма группы АВ(IV).

В середине XX века предполагалось, что кровь группы 0(I)Rh- совместима с любыми другими группами. Люди с группой 0(I)Rh- считались «универсальными донорами», и их кровь могла быть перелита любому нуждающемуся. В настоящее время подобные гемотрансфузии считаются допустимыми в безвыходных ситуациях, но не более 500 мл.

Несовместимость крови группы 0(I)Rh- с другими группами наблюдалась относительно редко, и на это обстоятельство длительное время не обращали должного внимания. Например, обладатель группы A(II)Rh− может получать кровь групп 0(I)Rh− или A(II)Rh− и отдавать кровь людям, имеющим кровь групп AB(IV)Rh+, AB(IV)Rh−, A(II)Rh+ или A(II)Rh−.

Читайте также: