Молекулярная биология сердечно-сосудистых заболеваний. Клетка млекопитающих и трансдукция сигнала

Обновлено: 21.09.2024

Для цитирования: Прионы - особый класс возбудителей медленных инфекций человека и животных. РМЖ. 2013;30:1559.

Формальное знакомство с прионными болезнями уходит своими корнями в далекое прошлое, когда более 280 лет назад была описана в Англии (1732 г.), а вскоре и в Германии (1750 г.) одна из «классических» прионных болезней - скрепи у овец. Эта болезнь с 1755 г. уже столь широко распространена, что становится даже предметом петиции в Британский парламент, поданной фермерами-овцеводами графства Линкольншир. Только в 1899 г. удается доказать инфекционную природу скрепи. Постепенно болезнь широко распространяется среди племенных овец и в различных странах получает свои названия [1].

Литература
1. Тимаков В.Д., Зуев В.А. Медленные инфекции. М.: Медицина, 1977. С. 7-17.
2. Sigurdsson B.// Brit. Vet. J. 1954. Vol. 110. P. 255-270.
3. Idem ibid. P. 307-322.
4. Idem ibid. P. 341-354.
5. Gajdusek D.C., Gibbs C.J. Slow, latent, and temperate virus infections; eds. D.C. Gajdusek, C.J. Gibbs, M. Alpers. Monograph. № 2. Washington, 1965. P. IX-X.
6. Sigurdsson B., Thormar H., Polson P.A. // Arch. ges. Vidusforsch. 1960. Vol. 10. P. 368-381.
7. Horta-Barbosa L., Fucillo D., Sever J. et al. // Nature. 1969. Vol. 221. P. 974.
8. Weller T.H., Neva F.A. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1962. Vol. 3. P. 215-225.
9. Зуев В.А. Медленные вирусные инфекции человека и животных. М.: Медицина, 1988. C. 115-136.
10. Сuille J., Chelle P.L. C.R. // Acad. Sci. 1936. Vol. 203. P. 1552-1554.
11. Gajdusek D.C., Zigas V. // New Engl. J. Med. 1957. Vol. 257. P. 974-978.
12. Alpers M.P. // Am.J. trop. Med. Hyg. 1970. Vol. 19. P. 133-137.
13. Lampert P.W., Gajdusek D.C., Gibbs C.J. // Am. J. Pathol. 1972. Vol. 68. P. 626-646.
14. Hadlow W.J. // Lancet. 1959. Vol. 2. P. 289-290.
15. Gibbs C.J., Gajdusek D.C., Asher D.T. et al. // Science. 1968. Vol. 161. P. 388-389.
16. Alperovich A. // Eur. J. Neurol. 1996. Vol. 3. P. 500-506.
17. Brown P., Gibbs C.J., Rodgers-Johnson P. et al. // Ann. Neurol. 1994. Vol. 35. P. 513-529.
18. Duffy P., Wolf J., Collins G. et al. // New Engl. J. Med. 1974. Vol. 290. P. 692-693.
19. Bradley R. Prion Diseases; td. J. Collinge and M.S. Palmer. Oxford Univ. Press. 1997. P. 89-129.
20. Williams E.S., Young S. J. // Wildi Dis. 1980. Vol. 16. P. 89-98.
21. Gajdusek D.C. Virology; ed. B.N. Fiedds. New York,1985. P. 1519-1557.
22. Gajdusek D.C. Subviral Parthogenesis of Plants and Animals: Viroid and Prions. New York, 1985. P. 483-544.
23. Prusiner S.B., McKinley M.P., Groth D.F. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. Vol. 78. P. 6675-6679.
24. Prusiner S.B. // Science. 1982. Vol. 216. P. 136-144.
25. Bolton D.C., McKinley M.P., Prusiner S.B. // Scvience. 1982. Vol. 218. P. 1309-1311.
26. McKinley M.P., Bolton D.C., Prusiner S.B. // Cell. 1983. Vol. 35. P. 57-62.
27. Imran M., Mahmood S.V. // Virol. Journal. 2011. Vol. 8. P. 559.
28. Tobler J., Gaus T., Deboer P. et al. // Nature. 1996. Vol. 380. P. 639-642.
29. Harris D.A., Falls D.L., Johnson F.A. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. Vol. 88. P. 7664-7668.
30. Lugaresi E., Medori P., Baruzzi A. et al. // New Engl. J. Med. 1986. Vol. 315. P. 997-1003.
31. Boldin E., Capellari C., Provini F. et al. // J. Neurol. 2009. Vol. 256. P. 778-779.
32. Зуев В.А., Завалишин И.А., Ройхель В.М. Прионные болезни человека и животных. М.: Медицина, 1999. C. 136-142.
33. Bradley R. Prion Diseases; eds. J. Collinge, M.S. Palmer. Oxford, 1997. P. 89-129.
34. Покровский В.И., Киселев, Черкасский Б.Л. Прионы и прионные болезни. М.: Изд-во РАМН, 2004. C. 45-55.
35. Colby D.W., Prusiner S.B. Prions. // Cold Spering Harb. Perspect. Biol. 20011. Vol. 3. P. 1-22.
36. Chazot G., Brousolle E., Lapras C.I. et al. // Lancet. 1996. Vol. 347. P. 1181.
37. Collinge J., Palmer M. Prion Diseases; eds. J. Collinge, M. Palmer. Oxford, 1997. P. 18-55.
38. Parchi P., Saverioni D. // Folia Neuropathol. 2012. Vol. 50(1). P. 20-45.
39. Григорьев В.Б., Покидышев А.Н., Кальков С.Л. и др. // Вопр. вирусол. 2009. T. 5. P. 4-9.
40. Трубачева Е.С. Материалы 2-й Межрегиональной научно-практич. конф. «Тольяттинская осень». Тольятти, 2009. C. 296-299.
41. Brown H. // Antiviral. Chem. Chemother. 1990. Vol. 1. P. 75-83.
42. Gambetti P., Cali I., Notari S. et al. // Acta Neuropathol. 2011. Vol. 121 (1). P. 79-90.
43. Safar J.G. // Prion. 2012. Vol. 6(2). P. 108-115.
44. Зуев В.А., Игнатова Н.Г., Автандилов Г.Г. // Успехи геронтол. 2005. T. 17. C. 108-116.
45. Villeda S., Luo J., Mosher K. et al.// Natura. 2011. Vol. 477. P. 90-96.
46. Carp R.A. Int. Virol. 2nd int. // Congr. Virol. Budapesht. 1971. Karger. Basel. 1972. P. 210.
47. Haralambiev H., Ivanov I., Vesselinova A. // Zbl. Vet. 1973. Vol. 201. P. 201-209.
48. Ройхель В.М., Фокина Г. И., Кондакова Л.И. // Вопр. вирусол. 1997. № 5. C. 203-205.
49. Gambetti P., Dong Z., Yuan J. et al. // Annal. Neurol. 2008. Vol. 63. P. 697-708.
50. Zou W.Q., Puoti G., Xiao X. et al. // Annal. Neurol. 2010. Vol. 68. P. 162-172.
51. Bendheim P.E., Barry R.A., DeArmond S.J. et al. Antibodies to a scrapie prion protein // Nature. 1984. Vol. 310(5976). P. 418-421.
52. Ройхель В.М. Медленные болезни человека и животных, вызванные прионами // Природа. 2002. № 2.

Важнейшие стрелочники клеток организма: белки Wnt

Обзор

Дилемма стрелочника

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Говорят «стрелочник во всем виноват», а ведь он только выполняет переданную команду: скажут ему «переводи стрелку», он и направит поезд по другому пути, а не скажут — так он и не переведет. Таким же образом действуют и сигнальные молекулы нашего организма, в том числе в сигнальном пути Wnt. Задача этих биомолекул — передать «приказы» клеток-«начальников» клеткам-«подчиненным».

Конкурс «био/мол/текст»-2012

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2012 в номинации «Лучший обзор».

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific.

Введение от редакции

Wnt-путь — один из важнейших молекулярных сигнальных путей, который регулирует эмбриональное развитие и дифференцировку клеток. Весь путь назван по имени одного из лигандов, который активирует путь в клетках — Wnt. Это сокращение произошло от слияния названий двух генов — Wg + Int. Прототип гена был открыт у дрозофилы, где мутация в гене Wg (wingless) подавляла развитие крыльев. Гомологичный ген у позвоночных — Int — связан с развитием раковых опухолей.

На сегодняшний день известно, что Wnt-путь регулирует развитие многих органов во время эмбриогенеза и отвечает за билатеральную симметрию организма. Его функции — все то, что формирует из массы эмбриональных клеток сформированный организм. У взрослых особей нарушения Wnt-пути ведут к повышенному риску раковых заболеваний. Также недавние работы показали важную роль компонентов Wnt в пролиферации и дифференциации стволовых клеток.

Гликопротеины Wnt — это семейство секретируемых клетками сигнальных молекул, которые участвуют в координации поведения клеток в организме. Эти белки, открытые еще в начале 1980-х в качестве маркеров многих видов раковых заболеваний, оказались ключевыми регуляторами эмбрионального развития, процессов регенерации, роста костей, дифференцировки стволовых клеток и массы других процессов, связанных с морфогенезом и определением клеточной судьбы.

Структура Wnt белков

Структура белков семейства Wnt напоминает кисть руки (рис. 1; [1]). Роль большого пальца играет аминоконцевой домен, состоящий из пучка α-спиралей, стабилизированных пятью дисульфидными мостиками. «Указательный палец» — карбоксиконцевой домен, включающий два β-тяжа, поддерживаемых шестью дисульфидными мостиками. «Ладонь» обладает высокой гибкостью, обеспечивая конформационную подвижность белка. Кроме этого, к «большому пальцу» ковалентно присоединяется пальмитолеиновая жирная кислота, необходимая для взаимодействия с транспортными белками. Присоединение остатка жирной кислоты называется ацилированием, и зависит оно от другой модификации участка «ладони» — гликозилирования. Без него становится невозможным взаимодействие с транспортными белками и, следовательно, секреция.

Рисунок 1. Структура Wnt. а — Объемная модель Wnt8. Желтым цветом обозначены гликозилированные участки. б — Вторичная структура Wnt. Оранжевым цветом обозначены и пронумерованы 22 остатка цистеина, которые образуют парные дисульфидные мостики. Розовым цветом обозначена ковалентно присоединенная ацильная группа: жирная кислота.

Секреция Wnt

Предполагается, что присоединение необходимого для секреции Wnt остатка жирной кислоты осуществляет ацилтранферраза эндоплазматического ретикулума Поркупин (PORCN), так как делеция этого гена нарушает секрецию Wnt (рис. 2; [4]). После ацилирования Wnt распознается белками аппарата Гольджи — трансмембранным рецептором GPR177 (широко известным как Wntless (Wls)), «белками-грузчиками» p24, которые переносят Wnt от эндоплазматического ретикулума на поверхность клетки (рис. 3; [5]) и транспортным белком Swim, который поддерживает растворимость и сигнальную активность компллекса Wnt/Wls [6].

Рисунок 2. Биогенез и секреция Wnt. Молекулы Wnt в процессе созревания в эндоплазматическом ретикулуме подвергаются гликозилированию, а затем ацилированию. Затем в сопровождении белка Wntless из аппарата Гольджи они попадают в секреторные везикулы, внутри которых пересекают плазматическую мембрану, после чего секретируются. Wntless извлекается из отработанных секреторных везикул и переносится обратно в аппарат Гольджи с помощью комплекса Retromer.

Рисунок 3. Канонический путь Wnt-сигнализации. «Рабочим телом» канонического пути является β-катенин: в неактивном состоянии его мало, а в активном — много, и он активирует транскрипцию в ядре.

Неактивное состояние: в отсутствии взаимодействия между Wnt и рецептором LRP5/6 количество цитоплазматического β-катенина малó за счет «деградационного комплекса», состоящего из белков APC, казеинкиназы и гликоген-синтезы-киназы GSK3, расположенных на «платформе» белка Аксин. С помощью этого комплекса цитоплазматический β-катенин фосфорилируется, а затем подвергается убиквитилированию белком β-TrCP, что приводит к его деградации с помощью протеасомы.

Активированное состояние: Wnt-сигнал начинается с образования комплекса Wnt с LRP5/6 и рецептором Фрайззлед (Frizzled), что приводит к активации белка Dishevelled. Это ингибирует «деградационный комплекс» и «выключает» убиквитилирование β-катенина. В результате накапливающийся в цитоплазме свободный β-катенин [16] проникает в ядро и активирует транскрипцию с помощью транскрипционных факторов TCF/LEF и ряда других.

Регуляция пути Wnt: с секретируемыми молекулами Wnt непосредственно связываются их антагонисты: Wnt-ингибирующий фактор (WIF) и Фрайззлед-узнающий белок 1 (sFRP). Кроме того, для предотвращения образования комплекса Фрайззлед—Wnt—LRP, c белками LRP5/LRP6 могут связаться DKK и склеростин. Белки Shisa, захватив рецептор Фрайззлед, мешают ему выйти на поверхность клетки. Если Wnt образует комплекс с LRP5/6 и Фрайззлед, сигнализация активируется. Белок R-spondin 2 (RSPO), стабилизируя рецепторы Фрайззлед и LRP5/6, повышает сигнализацию по пути Wnt. В эндоплазматическом ретикулуме для созревания LRP5/6 необходим сопровождающий белок MESD.

Мембранные рецепторы Wnt

Для того чтобы воздействовать на клетку-мишень, Wnt должен связаться с клеточными рецепторами. В качестве таких рецепторов на поверхности клетки выступают трансмембранный белок Фрайзлед Frizzled (Fz) и липопротеиды низкой плотности LRP5/LRP6. Связаться с ними молекуле Wnt активно мешают различные антагонисты, которым противостоят агонисты (рис. 3). Помимо этих рецепторов Wnt может связываться с рецепторными тирозинкиназами Ror и Ryk . Ror, связавшись с Wnt5a, фосфорилирует белок Дишевеллед и таким образом контролирует морфогенез тканей, тогда как Ryk, фосфорилируя мембранный белок Vangl2, контролирует полярность клетки.

Кстати, Frizzled и уже упомянутый рецептор GPR177 относятся к семейству рецепторов GPCR, за исследование которых в 2012 году была вручена Нобелевская премия по химии [7]. Рецепторные тирозинкиназы также представляют важный класс сигнальных рецепторов мембраны клетки (см., например, [8]). — Ред.

Механизмы воздействия Wnt на клетку

По традиции механизмы воздействия Wnt на клетку подразделяют на:

канонический (β-катенин—зависимый) путь, который, в конечном счете, контролирует программы генной экспрессии, связанные с определением судьбы клетки и морфогенезом [9];
неканонические (β-катенин—независимые) пути [10], которые регулируют полярность клетки, стимулируя реорганизацию цитоскелета [11], [12] и метаболизм кальция [13].

В основе канонического пути Wnt-сигнализации лежит стабилизация цитоплазматического белка β-катенина (рис. 3). В отсутствие сигнала β-катенин не активен и быстро деградирует. Когда клетки активируются Wnt, скорость деградации β-катенина снижается. Избежавший деградации β-катенин накапливается в цитоплазме и входит в ядро.

В ядре β-катенин, захватив ядерные белки BCL9 и пигопус (Pygopus), взаимодействует с белками TCF/LEF, превращая их в мощные активаторы транскрипции. TCF/LEF являются многофукциональными белками, которые, обладая способностью избирательно связываться с определенными последовательностями ДНК и с определенными белками-активаторами, «принимают решение», какие из генов будут активированы сигналом Wnt [14]. Обнаружено, что связь между β-катенином и TCF4, необходимая для такой активации, может быть нарушена ресвератролом. Это позволяет предположить, что ресвератрол, являющийся флавоноидом кожицы черного винограда и получаемого из него вина, может быть использован в качестве безвредного лекарства для подавления сигнала Wnt при раковых заболеваниях [15].

Влияние Wnt-сигнализации на клеточный цикл и пролиферацию клеток

Появляется все больше доказательств сложной взаимосвязи канонического пути Wnt-сигнализации и клеточного цикла. Компоненты сигнального каскада Wnt действуют непосредственно на формирование митотического веретена. Так, например, у излюбленного модельного организма молекулярных биологов — червячка C. elegans — сигнализация Wnt вызывает асимметрию митотического веретена, приводящую к асимметричному распределению β-катенина [17]. Более того, сигнализация Wnt сильно активируется в митозе, свидетельствуя о том, что «митотическая Wnt-сигнализация» играет важную роль в организации программы клеточного деления и таким образом способствует клеточной пролиферации [18].

Стволовые клетки в основном характеризуются двумя свойствами: способностью к самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток . Эти процессы регулируются различными факторами роста, в том числе белками Wnt [19]. Накопленные данные показывают, что сигнальный путь Wnt/β-катенина играет ключевую роль в поддержании плюрипотентности, а также в процессах перепрограммирования соматических клеток. В то же время сигнализация Wnt/β-катенин играет важную роль и в процессе дифференцировки.

Дифференцировка и де-дифференцировка стволовых клеток — также предмет Нобелевской премии 2012 года (по физиологии и медицине): «Нобелевская премия по физиологии и медицине (2012): индуцированные стволовые клетки» [20]. См. также [21], [22]. — Ред.

Обнаружено, что добавление белка Wnt или же, наоборот, ингибитора Wnt (малой молекулы IWP2) снижает неоднородность популяции клеток. При этом образуются либо клетки со стабильно высоким уровнем синтеза Wnt, либо клетки с низким уровнем синтеза Wnt. При дифференцировке эмбриональные клетки с высоким уровнем синтеза Wnt преимущественно образуют энтодермальные и сердечные клетки, а с низким — в первую очередь нейроэктодермальные клетки [23]. Знание того, что сигнализация Wnt на ранних стадиях дифференцировки повышает, а на поздних стадиях наоборот угнетает развитие сердца, позволило путем правильной стратегии использования малых молекул и механизмов сигнализации Wnt получить in vitro из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека кардиомиоциты с недостижимой до сих пор эффективностью — до 98% [24]!

Перспективы

Вот уже 30 лет как ежегодно появляется огромное количество статей, так или иначе затрагивающих тему сигнализации Wnt. Такое пристальное внимание к этой теме вполне заслуженно, потому что «вездесущая» молекула Wnt регулярно преподносит сюрпризы. Так, например, выяснилось, что β-катенин, избежавший деградации благодаря активации Wnt-сигнала, активирует синтез ферментативной субъединицы теломеразы (TERT) в стволовых и раковых клетках. В этом ему помогает один из транскрипционных факторов плюрипотенции — Klf4, направляющий его на промотор гена Tert [25]. Как известно, теломераза — фермент, поддерживающий длину теломеров в противовес их укорочению, приводящему к старению клетки [26]. Поэтому открытие роли Wnt в стабилизации теломер может помочь как борьбе с раковыми заболеваниями, так и борьбе со старением.

Молекулярные часы нашего сердца

В каждой клетке сердца есть встроенные молекулярные часы, и чрезвычайно важно, чтобы ритм работы этих часов был синхронизирован с ритмом главных часов в головном мозге

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Врачи уже давно заметили, что возникновение опасных для жизни обострений сердечно-сосудистых заболеваний, таких как инфаркт миокарда, инсульт, серьезные приступы аритмии, часто связано с определенным временем суток — намного чаще такие осложнения проявляются ранним утром. Заинтересовавшись этой особенностью, доктора провели многочисленные исследования и выяснили, что это явление тесно сопряжено с работой внутренних часов организма, и что при изучении сердечно-сосудистых заболеваний нужно обязательно уделять внимание особенностям регуляции суточных ритмов организма.

Конкурс «био/мол/текст»-2014

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2014 в номинации «Лучший обзор».

Главный спонсор конкурса — дальновидная компания «Генотек».
Конкурс поддержан ОАО «РВК».

Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики.
Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.
Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.

Что такое циркадианный ритм

Мы живем в соответствии с ритмами природы: вслед за ночью неизбежно наступает день, тьму обязательно сменяет свет. И, чтобы приспособиться к этому регулярному, заданному внешней средой чередованию условий, наш организм выработал очень сложный и пока еще окончательно не разгаданный механизм внутренних часов — наш «встроенный хронометр», который физиологи называют суточным или циркадианным (циркадным) ритмом. Если дословно переводить с латинского, то «цирка» означает около, а диа — «день». То есть циркадианный ритм — это ритм с периодом около суток. Зачем же понадобилась эта приставка «около»? Дело в том, что время завершения полного цикла нашего «встроенного хронометра» все еще вызывает споры у ученых, так как внутренняя размеренность организма не вписывается точно в те 24 часа, которые составляют наши астрономические сутки.

Но, так или иначе, не остается сомнений, что в нашем организме работают внутренние биологические часы, и работают они, как выявили генетические исследования последних лет, в каждой клеточке нашего тела. Генетическую природу биологических ритмов начали раскрывать с 1971 года, когда впервые в мире у мухи дрозофилы был найден часовой ген Per — его назвали сокращением от слова «период» (period) [3]. Было замечено, что мутация в этом гене вызывала у мушек отклонения в периодичности суточного ритма. Эти исследования положили начало целому ряду открытий, в результате которых сформировалось современное представление о молекулярном устройстве биологических часов.

Иерархия внутренних биологических часов

Итак, как же устроены наши внутренние часы? Последние исследования указывают на то, что внутренние задатчики ритма в нашем организме организованы по законам иерархии: здесь есть самые главные часы и подчиненные часики. Главным центром циркадианных часов является супрахиазматическое ядро в головном мозге — это плотное скопление из примерно 20 тысяч нейронов, и расположено оно как раз рядом с центром, регулирующем продукцию гормонов в организме. Что касается подчиненных часиков, то, как показал анализ экспрессии генов в клетках внутренних органов, гены, отвечающие за суточные ритмы, экспрессируются в каждой клетке организма, включая даже соединительную ткань. Это навело ученых на мысль, что каждый орган имеет свои внутренние часы. Собственную часовую систему внутренних органов назвали периферическими часами, а управляющее ими супрахиазматическое ядро — центральными часами (рис. 1). Свой собственный хронометр есть у печени, у кровеносных сосудов, у сердца, у почек. Но для эффективной работы организма чрезвычайно важно, чтобы все часовые механизмы были настроены на слаженную работу в одном ритме — синхронизированы.

Рисунок 1. Иерархия внутренних биологических часов: главным центром циркадианных часов является супрахиазматическое ядро в головном мозге, задающее ритм работы всем клеткам организма посредством вегетативной нервной системы, специализированных гормонов и различных факторов. Подчиненные часы в клетках внутренних органов называются периферическими.

Фазы внутренних хронометров могут сдвигаться под воздействием определенных стимулов, которые способны навязывать свой ритм. Такие стимулы называются цайтгеберами (от нем. Zeit — «время» и geben — «давать») или задатчиками ритма. Каждые часы способны реагировать на свои специфические задатчики ритма. Например, свет задает ритм центральным часам в супрахиазматическом ядре, тогда как непосредственно на периферические часы он не влияет. Цайтгеберами могут быть не только внешние воздействия, но и особенности поведения: режим физической активности, цикл смены сна и бодрствования и даже режим питания. Например, четко было показано, что внутренние часы печени больше настроены на ритмичность приема пищи, чем на ритмы смены светлого и темного периодов суток [4].

Главный физиологический синхронизатор всех периферических часов — супрахиазматическое ядро. Благодаря своим связям со светочувствительными клетками сетчатки глаза, нейроны супрахиазматического ядра способны получать информацию о световом периоде снаружи и подстроить к внешним условиям внутренние ритмы организма. Синхронизация периферических часовых систем осуществляется посредством вегетативной нервной системы специальными гормонами и, возможно, другими, пока еще мало изученными путями. Ученые с каждым годом открывают и подробно описывают все больше новых факторов, влияющих на регуляцию внутренних ритмов [5].

Потеря синхронизации и прогрессирование болезни

Как показывают эксперименты, синхронизация всех внутренних ритмов — крайне важное условие для сохранения здоровья и продолжительности жизни. Когда ученые изучают взаимосвязь между сбоем биологических часов и сердечными заболеваниями, то у них возникает очевидный вопрос, что же первично: поломки во внутренних часах вызывают болезни сердца, или сама сердечная патология является причиной нарушения работы наших встроенных хронометров? В попытке ответить на этот вопрос выдвинуто как минимум две противоположные гипотезы.

В пользу гипотезы о том, что потеря синхронизации внутренних ритмов в возникновении болезни первична, был проведен целый ряд интереснейших экспериментов. Исследователь Тами Мартино анализировал продолжительность жизни золотистых хомячков с особой мутацией в гене tau, которая уменьшает период суточного ритма в периферических часах до 22 часов (рис. 2). Иными словами, внутренние часы у этой линии щекастых грызунов очень спешат. Оказалось, что и общая продолжительность жизни хомячков с мутацией уменьшается на 20%, а умирают они в раннем возрасте от серьезных заболеваний миокарда — фиброза и кардиомиопатий [6].

Рисунок 2. Золотистый хомячок с мутацией в гене tau: внутренние часы хомячка спешат на два часа в сутки. Отсутствие синхронизации внутреннего и внешнего ритмов привело к тому, что у грызуна возникли серьезные проблемы со здоровьем — гипертрофия миокарда.

Однако, когда таким хомячкам создали искусственные условия так, чтобы период чередования света и темноты составлял 22 часа, то сердечная патология сменилась на нормальное функционирование сердца. Более того, удаление супрахиазматического ядра — главных часов организма — также имело профилактический эффект: гипертрофия миокарда у золотистых хомячков после операции не развивалась. В чем же причина такого чудесного исцеления?

Полученные результаты свидетельствуют о том, что не столько повреждение периферических часов, сколько утрата синхронизации между центральными и периферическими задатчиками ритма приводит к возникновению сердечно-сосудистой патологии. У мутантных хомячков произошла нестыковка 22-часового периода периферических часов и 24-часового периода центральных часов. Когда центральному хронометру через изменения внешних условий (свет/темнота) навязали ритм в 22 часа, то он синхронизировался с периферическими часиками, и сердечная патология не развилась. А когда супрахиазмальное ядро удалили, то периферическим часам снова ничто не мешало свободно реализовывать свой собственный ритм, и сердечко хомяка опять же было спасено.

С другой стороны, и сама болезнь способна нарушить слаженность внутренних биоритмов. Например, во время острого инфаркта миокарда в поврежденных клетках происходит сдвиг фаз циркадианных часов по отношению к здоровым тканям. Эта потеря синхронизации очень опасна и может вызвать угрожающие жизни приступы аритмии.

Восстановление слаженности ритмов клеток сердца с естественными циклами остальных органов и тканей и с циклическими сменами условий окружающей среды может стать многообещающей стратегией в борьбе с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Но для реализации этого направления необходимы очень глубокие знания о закономерностях функционирования биоритмов. Интересно, что даже у здоровых людей циркадианный ритм клеток внутренней оболочки вен варьирует в зависимости от их анатомического положения. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы как можно точнее идентифицировать все цайтгеберы в организме, и использовать полученные знания для починки наших встроенных хронометров в случае сбоя.

Суточная вариабельность сердечно-сосудистых показателей

Еще один очень важный момент заключается в том, что в течение суток чувствительность сердца к стрессу, эмоциональным и физическим нагрузкам различна. Также меняются во времени и сами показатели сердечно-сосудистой функции: артериальное давление, скорость кровотока, частота сердечных сокращений и другие. Непрерывная запись электрокардиограммы в течение 24 часов у людей в состоянии покоя показывает, что частота сердечных сокращений у человека постоянно варьирует: она достигает минимума на пятом-шестом часу сна и в это время составляет 48-50 ударов в минуту. Максимума она достигает вечером, примерно в 18 часов, а затем снова постепенно начинает снижаться.

Все эти явления возможны благодаря сложным молекулярным механизмам собственных периферических часов в сердечно-сосудистой системе. Около 10% генов, экспрессирующихся в клетках сердца, имеют суточный ритм экспрессии. В настоящее время проводится активный поиск факторов, влияющих на работу сердца и обладающих суточной ритмичностью. Молекулярные часы уже обнаружены в мышечных клетках сердца, в клетках внутренней выстилки сосудов (в эндотелии) и в мышечных клетках сосудов.

Молекулярные часы в мышечных клетках сердца

При более глубоком изучении оказалось, что Klf 15 — это только первая ступень в сложном молекулярном каскаде, потому что он контролирует другой белок — KСhIP 2 (Kv channel-interacting protein) — фактор, взаимодействующий с калиевыми каналами в мышечных клетках сердца. Изменения концентрации KChIP 2 приводят к электрической нестабильности тканей сердца и, как следствие, к нарушениям сердечного ритма; при этом ген этого фактора имеет суточный ритм экспрессии.

Суточный ритм экспрессии имеют и сами гены калиевых каналов мышечных клеток сердца K_v1.5 и K_v4.2. Интересно, что экспрессия K_v1.5 увеличивается в темное время суток, тогда как матричную РНК белка K_v4.2 в большей концентрации обнаруживают в светлый период. Нарушения ритма в любом звене этой сложной системы могут быть связаны с суточным временем возникновения приступов аритмии.

Синхронизация молекулярных часов мышечных клеток сердца с обменом липидов

Мы уже говорили о том, как важна синхронизация ритмов сердца с циклами других физиологических систем организма. Не менее важно отметить, что некоторые внутренние циклы способны навязывать свой ритм сердечным часам. Одним из таких циклов-задатчиков является суточный ритм циркуляции жирных кислот и уровня липидов, жестко связанный с циркадианным. Жирные кислоты — преимущественное «сердечное топливо»: они на 70% утилизируются сердцем. При избытке жирных кислот сократительная функция сердца подавляется, и сердце отвечает на эти изменения внутренней среды активацией как оксидативного (митохондриального), так и неоксидативного метаболизма. Таким образом сердце уменьшает клеточную токсичность, вызванную нагрузкой жирными кислотами. И этот процесс также связан с суточными ритмами экспрессии генов.

Американская исследовательница Молли Брэй исследовала гены циркадианных часов с помощью метода микрочипов ДНК. Ей удалось выявить 548 генов, регулирующих часы в кардиомиоцитах предсердия, и 176 генов, связанных с циркадианным ритмом мышечных клеток желудочка сердца. Среди них были гены, вовлеченные в липогенез, и белки, связывающие липиды; все они демонстрировали суточную экспрессию [8].

Периферические часы в клетках эндотелия

Несколько групп ученых продемонстрировали роль часовых генов в функции эндотелия — ткани, выстилающей внутреннюю поверхность кровеносных сосудов и сердца. Они выяснили, что у мышей с мутацией в часовом гене Per 2 не расслабляются сосуды в ответ на воздействие главного релаксирующего нейромедитора — ацетилхолина. Кроме этого очень неприятного нарушения функции, в крови мышек выявляется очень высокая концентрация веществ, стимулирующих сжатие сосудов, что чревато возникновением артериальной гипертонии [9].

Но на этом проблемы со здоровьем у несчастных мышек не заканчивались. Исследователь Чао Ванг показал, что если в клетках эндотелия есть мутация гена Per 2, то кровеносные сосуды быстро стареют, плохо восстанавливаются после повреждений, а у самих грызунов сильно уменьшается продолжительность жизни [10].

Периферические часы в мышечных клетках сосудов

Клетки гладкой мускулатуры кровеносных сосудов — миоциты — также имеют собственные периферические часы. Такишиге Куньеда исследовал циркадианную систему в миоцитах стареющих сосудов. Он обнаружил, что в этих клетках потеря циркадной ритмичности связана с укорочением теломер. Введение теломераз предотвращало проблемы с экспрессией часовых генов. Эти исследования показывают, что регуляция теломеразами может стать одним из способов терапии нарушений циркадных ритмов, связанных с возрастом [11].

Заключение

Таким образом, изучение биоритмов, особенно с позиции их синхронизации с циклами внутренней и внешней среды, поможет пролить свет не только на причины сердечно-сосудистой патологии, но и на причины старения и низкой продолжительности жизни.

Жизнь современного человека наполнена событиями, которые не подчиняются естественным циклам природы: мы можем работать в ночную смену или регулярно не спать по ночам, засиживаясь за телевизором, компьютером или чтением книг, у нас есть возможность за один день пересечь сразу несколько часовых поясов. Только все ли из нас задумывались, какие серьезные физиологические перестройки происходят в это время в нашем организме? В статье мы рассмотрели несколько примеров работы внутренних молекулярных часов, связанных с функционированием сердца, и увидели, что внутренние и внешние ритмы взаимосвязаны очень тесно, и нарушение временнóй слаженности в одной системе может повлечь за собой сбои в другой. Исследования в этой области продолжаются и, возможно, когда-нибудь ученые откроют волшебное средство, приняв которое, мы мгновенно синхронизируем работу всех внутренних органов, замедлим старение и будем чувствовать себя бодрыми и веселыми независимо от времени суток. Но пока это средство остается в мечтах, мы должны понимать, что сами можем организовать свою жизнь так, чтобы в наших молекулярных часах было как можно меньше сбоев. Соблюдение регулярности в режимах приема пищи, сна и бодрствования, физической активности, полноценный ночной сон, осторожное отношение к перелетам с пересечением часовых поясов — все это может стать той самой волшебной пилюлей, которая починит молекулярные часы в нашем сердце.

Клетки под давлением

Редактор

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Вы не задумывались, что привычные нам животные, да и мы сами, могли бы выглядеть иначе? Жизнь началась с того, что образовалась клетка — единица всего живого, развитие которой происходило под действием внешних физических полей: гравитационного и электромагнитного. Изменение внешнего воздействия приводит к изменению механического напряжения внутри клетки, которое должно сопровождаться адекватной реакцией клетки без потери способности к самовоспроизведению и полноценной жизнедеятельности. Выраженность и последствия деформаций будут зависеть от собственных механических характеристик клетки и чувствительности ее механосенсоров, на роль которых претендуют различные структуры. Рассмотрим, что же известно о четырех из них: внеклеточном матриксе, механочувствительных ионных каналах, подмембранном и внутреннем цитоскелете.

Обратите внимание!

Эта работа опубликована в номинации «лучшая обзорная статья» конкурса «био/мол/текст»-2015.

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Клетка — структурная единица всего живого — развивается под постоянным действием внешних стимулов — тепла, пищи, регуляторных гормонов. Однако есть еще один тип стимуляции, который должна воспринимать живая клетка — механическое напряжение. Изменение внешнего воздействия (его вектора, амплитуды) закономерно должно приводить к изменению механического напряжения внутри клетки. Степень выраженности и последствия этих деформаций для жизнедеятельности клетки будут зависеть от собственных механических характеристик клетки и чувствительности ее механосенсоров [1], в роли которых могут выступать различные структуры, способные чувствовать механическую стимуляцию и реагировать на нее. Можно выделить четыре основных типа механосенсоров: внеклеточный матрикс, механочувствительные ионные каналы, подмембранный цитоскелет и комплексы компонентов внутреннего цитоскелета. Рассмотрим, что же известно на сегодня о каждом из них.

Внеклеточный матрикс и мембранные белки

Первый претендент на роль механосенсора — внеклеточный матрикс и связанные с ним мембранные белки (рис. 1). Одной из причин такого предположения послужила реакция этих структур на внешнее механическое воздействие. Было показано, что приложение растягивающей силы к культуре нейронов или гладкомышечных клеток через внеклеточный матрикс приводит к увеличению полимеризации микротрубочек [2, 3].

Каким же образом это могло произойти? Попробуем рассмотреть этот процесс на молекулярном уровне. Интегрины — трансмембранные гетеродимерные клеточные рецепторы, формирующие связи с различными белками внеклеточного матрикса (фибронектином, витронектином, коллагеном, ламинином) и передающие межклеточные сигналы, образуют первичный участок трансдукции и поэтому могут рассматриваться как механосенсор. Что совсем не удивительно, ведь интегрины — неотъемлемые участники процессов клеточной адгезии, пролиферации и перемещения.

Интегриновые рецепторы — это гетеродимеры, состоящие из одной α- и одной β-субъединицы (рис. 2). У человека синтезируется как минимум 18 α- и 8 β-субъединиц, из которых в разных комбинациях строится 24 типа интегрина [4], различающихся по специфичности взаимодействия с лигандами. Субъединицы α определяют специфичность интегрина к лиганду, а β связаны со структурами цитоскелета и обеспечивают передачу сигнала внутри клетки. Интегрины присутствуют в мембране постоянно, но для связывания лиганда они должны активироваться, а это происходит, например, при взаимодействии других клеточных рецепторов с цитокинами [5].

У внутренней поверхности клеточной мембраны в зонах образования интегриновых контактов с адгезивными белками внеклеточного матрикса целый ряд белков собирается в фокально-адгезивный комплекс. Это существенно затрудняет анализ вклада каждого из них в механотрансдукцию и пока не позволяет выявить ведущую роль какого-либо из них. Однако представляется очевидным, что внешняя механическая сила может приводить к конформационным изменениям одного или нескольких белков фокально-адгезивного комплекса, запуская далее каскад нижележащих сигнальных путей [6].

Механочувствительные ионные каналы

Второй претендент — механочувствительные ионные каналы. В настоящее время они являются самым малоизученным классом ионных каналов и представляют особый интерес для понимания механизмов клеточной сигнализации.

Впервые такие каналы были обнаружены в электрофизиологических экспериментах с использованием метода патч-кламп (patch-clamp). Было выявлено, что при растягивании мембраны меняется катион-транспортная активность механочувствительного канала — в результате конформационных изменений липидного бислоя [6, 7] или воротных доменов самогό канала.

Наглядно это было представлено на наиболее просто устроенных живых организмах — бактериях. А именно — на механочувствительном канале MscL, представляющем собой пору большого диаметра с низкой ионной селективностью. Эксперименты показали, что увеличение натяжения мембраны, контролируемое путем варьирования глубины всасывания в пипетку, вызывает увеличение проводимости канала в случае, когда силы, действующие на канал, превышают определенную величину [8]. Авторы отметили, что напряжение в этом случае оказывалось чуть ниже (10 -2 Па·м), чем напряжение, приводящее к разрыву (6 × 10 -2 Па·м), что может иметь большое физиологическое значение, например, при разбухании бактериальной клетки вследствие осмотического шока.

В эукариотических клетках в качестве механочувствительных каналов можно рассматривать эпителиальные натриевые каналы ENaCs (рис. 3) — семейство ионных каналов из суперсемейства дегенрин/ENaC (DEG/ENaC), — обнаруженные в клетках различных натрий-абсорбирующих типов эпителия [9].

Рисунок 3. Схема строения эпителиальных Na + -каналов. Предполагается, что каждая субъединица состоит из двух трансмембранных участков, выпетливания на поверхности клетки и N- и C-концевых доменов, находящихся внутри клетки. Рисунок из [9].

Накапливается всё больше доказательств того, что ENaC могут активироваться механическими силами; как минимум напряжение сдвига при ламинарном течении жидкости может быть адекватным стимулом, имеющим физиологическое значение [10, 11]. Также косвенным аргументом в пользу механочувствительности может служить тот факт, что гены этих высокоселективных Na + -каналов экспрессируются в тканях, которые наиболее подвержены механическим воздействиям, а именно — на которые действует напряжение сдвига: дистальный отдел нефрона [10, 12], эпителий легкого [13], сосудистая ткань 15, чувствительные нервные окончания, включая те, что участвуют в механосенсорных процессах [17]. Активность этих каналов служит лимитирующим фактором поглощения натрия и скорости трансэпителиального движения воды (осмоса) [18]. Таким образом, ENaC является регулятором транспорта ионов в почке, и именно с ним могут быть связаны механозависимые адаптивные ответы, существенные для обеспечения ионного гомеостаза.

Подмембранный цитоскелет

Третий претендент — подмембранный цитоскелет (рис. 4), роль которого в регуляции ионных каналов доказана в ряде исследований. Рассмотрим некоторые из них.

В эксперименте при обработке культуры клеток (например, К562) цитохалазином D* происходит активация натриевых каналов, а полимеризация актина на цитоплазматической стороне клеточной мембраны вызывает их инактивацию [19]. При этом в клетках линии К562 фрагментация актиновых филаментов, ассоциированных с плазматической мембраной, может быть основным фактором, влияющим на активность натриевых каналов в ответ на повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция [20].

* — Цитохалазины — группа структурно родственных метаболитов плесневых грибов. Они связываются с быстро растущим концом актинового филамента и блокируют (иногда не полностью) как присоединение, так и отсоединение субъединиц на этом конце.

С помощью метода патч-кламп было показано, что актиновые микрофиламенты принимают участие в регуляции хлорных каналов [21, 22], Na + -K + -АТФазы [23], электровозбудимых натриевых каналов в клетках мозга [24], натриевых каналов в клетках реабсорбирующего эпителия [25].

Авторы работ, посвященных изучению богатых холестерином липидных микродоменов плазматической мембраны (рафтов) как фактора, определяющего активность интегральных мембранных белков и ионных каналов 26, считают, что нарушения структуры рафтов, обусловленные снижением уровня мембранного холестерина, препятствуют реализации клеточных функций, включающих перестройки актиновой сети [29, 32].

В клетках с пониженным содержанием холестерина наблюдалось повышение порога активации и снижение вероятности открытого состояния каналов. При этом измерения механозависимых токов в разных условиях и комплементарные данные флуоресцентной микроскопии свидетельствовали о том, что подавление активности механочувствительных каналов опосредовано реорганизацией актина, инициированной, по мнению ученых, нарушением целостности рафтов из-за снижения уровня мембранного холестерина [33, 34].

Внутриклеточные структуры

И последний по счету, но не по значимости претендент — внутриклеточные структуры. Хорошо известно, что внешнее силовое воздействие может привести к изменениям уровня экспрессии генов. При приложении силы через мембраносвязанные рецепторы в некоторых случаях деформируется ядро [35], то есть можно предположить прямое влияние внешних сил на хроматин, а значит, и на уровень экспрессии генов [36]. Силы в этом случае могут трансдуцироваться через цитоскелетную сеть к ядерной оболочке, а затем через ламининовую сеть (рис. 5) к хроматину. Кроме того, внешнее силовое воздействие может передаваться на микротрубочки, приводить к их разрыву, деполимеризации и запуску сигнальных путей [37].

Рисунок 5. Схема полимеризации ламинина в базальной мембране. Ламинин связан по меньшей мере с тремя другими белками внеклеточного матрикса, образуя сеть в базальной ламине. Ламинины также связываются с интегриновыми рецепторами, которые вытягиваются от поверхности клеток, прикрепленных к базальной ламине. Рисунок из [9].

Следует отметить, что конформационные изменения различных белков могут претендовать на роль механосенсора, но прямых доказательств этого практически нет. Хотя существует как минимум один пример того, что биохимическая реакция обусловлена конформационными изменениями белков. Свернутые домены фибронектина могут быть выявлены при действии силы, растягивающей молекулу и провоцирующей формирование фибрилл. Этот процесс исследовался экспериментально, а также методами динамического молекулярного моделирования [38, 39], и в результате было показано, что сила 3-5 пН достаточна для разворачивания доменов, а дальнейшее увеличение силы до 5 пН может привести к удлинению исходной молекулы в пять раз [39, 40]. Эти уровни силы сравнимы с теми, которые, согласно оценкам, могут инициировать механотрансдукцию.

По сути, любой белок, участвующий в механотрансдукции от внеклеточных контактов внутрь клетки, может быть механосенсором и стимулировать разворачивание интегринов [41] и ассоциированных с ними белков [42].

Согласно теории Дональда Ингбера [43], цитоскелет в целом реагирует на изменения механического напряжения, передающиеся посредством внеклеточного матрикса и ассоциированных с ним интегринов, реорганизуя микрофиламенты и микротрубочки. В то же время кортикальный цитоскелет, как жесткий 3D-каркас, поддерживающий плазматическую мембрану, находится в напряженном состоянии во внешнем механическом поле [44]. Поэтому можно полагать, что практически все вероятные механизмы первичной механотрансдукции зависят от состояния подмембранного кортикального цитоскелета, целостность которого обусловливает механические свойства (жесткость) того или иного типа клеток.

Участие клеточной механочувствительности во множестве физиологических процессов и довольно скудное количество безусловно установленных фактов делают рассматриваемую область исследований очень привлекательной для молекулярных биологов, цитологов и физиологов. Механозависимая регуляция процессов жизнедеятельности клетки может по праву считаться новым механизмом негуморальной регуляции. Выяснение вклада каждого возможного механосенсора будет способствовать расшифровке основ морфогенеза живого организма на ранних стадиях развития и при различных внешних параметрах.

Молекулярная биология сердечно-сосудистых заболеваний. Клетка млекопитающих и трансдукция сигнала

Измерение биологических маркеров произвело революцию в диагностике и контроле за эффективностью лечения пациентов с заболеваниями сердца. Наиболее широко используемыми современными биомаркерами являются натрийуретические пептиды и сердечные тропонины. Было выявлено и множество других маркеров, но лишь немногие из них нашли применение в реальной клинической практике. Представленный нами обзор посвящен внеклеточной ДНК (cell-free DNA, cfDNA) и ее роли при кардиоваскулярной патологии. Внеклеточная ДНК представляет собой фрагментированную двухцепочечную ДНК, которая свободно циркулирует во внеклеточных жидкостях организма (плазме, сыворотке, моче, спинномозговой жидкости и слюне). В нормальных физиологических условиях уровень cfDNA увеличивается при физических нагрузках и у лиц пожилого возраста. Установлено, что cfDNA находится во внеклеточных жидкостях в виде микропузырьков, микрочастиц, апоптотических телец, экзосом, гистоновых комплексов и виртосом. Были определены показатели cfDNA у здоровых доноров — 10-100 нг/мл (10 3 -10 4 геномных эквивалентов в 1 мл). Высокие уровни cfDNA по сравнению с контрольными показателями однозначно говорят о наличии в организме патологического процесса. Проведенные клинические исследования показали увеличение уровней cfDNA при различных сердечно-сосудистых заболеваниях. Необходимо дальнейшее изучение роли cfDNA, в том числе клинические исследования, для определения диагностической и прогностической значимости данного маркера.

Ключевые слова: cfDNA, внеклеточная ДНК, биомаркеры, сердечно-сосудистые заболевания, артериальная гипертензия, инфаркт миокарда.

Cell-free DNA and cardiovascular diseases

A.M. Aliyeva 1 , N.V. Teplova1, V.A. Kislyakov 1 , R.K. Valiev 2 , A.M. Rakhaev 3 , M.N. Saryev 2 , E.T. Gasanova 1 , I.G. Nikitin 1

1 Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow

2 A.S. Loginov Moscow Clinical Research Center, Moscow

3 Main Bureau of Medical and Social Expertise in the Kabardino-Balkarian Republic of the Ministry of Labor and Social Protection of Russian Federation, Nalchik

The measurement of biological markers has revolutionized the diagnosis and monitoring of the treatment efficacy of patients with heart disease. Currently, the most widely used biomarkers are natriuretic peptides and cardiac troponins. Many other markers have been identified, however, only a few of them were applied in real clinical practice. This review is devoted to cell-free DNA (cfDNA) and its role in cardiovascular pathology. Cell-free DNA is a fragmented double-stranded DNA that circulates freely in extracellular body fluids (plasma, serum, urine, cerebrospinal fluid and saliva). Under normal physiological conditions, cfDNA level increases during physical exertion and in the elderly patients. cfDNA has been found in extracellular fluids in the form of microbubbles, microparticles, apoptoti c bodies, exosomes, histone complexes and virtosomes. The following cfDNA indices were determined in healthy donors: 10 - 100 ng/mL (10 3 -10 4 genome equivalents in 1 ml). High levels of cfDNA versus the control group indices clearly indicate the pathological process in the body. Clinical studies have shown an increase in cfDNA levels in various cardiovascular diseases. Of particular interest, there is a need to conduct further study concerning cfDNA role, as well as future clinical trials to determine the diagnostic and prognostic significance of this marker.

Keywords: cfDNA, cell-free DNA, biomarkers, cardiovascular diseases, hypertension, myocardial infarction.

For citation: Aliyeva A.M., Teplova N.V., Kislyakov V.A. et al. Cell-free DNA and cardiovascular diseases. RMJ. 2022;5:26-29.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются ведущей причиной смерти во всем мире [1]. Выявление традиционных факторов риска, таких как возраст, гиперхолестеринемия, артериальная гипертензия (АГ), сахарный диабет (СД) и курение, улучшило первичную профилактику ССЗ [2]. Однако общая смертность от ССЗ продолжает расти [1]. Измерение биологических маркеров произвело революцию в диагностике и контроле за эффективностью лечения пациентов с заболеваниями сердца. Наиболее широко используемыми современными биомаркерами являются натрийуретические пептиды и сердечные тропонины. Было выявлено и множество других маркеров, но лишь немногие из них нашли применение в реальной клинической практике [3, 4].

Представленный нами обзор посвящен внеклеточной ДНК (cell-free DNA, cfDNA) и ее роли при кардиоваскулярной патологии. Анализ источников литературы проводился в базах данных PubMed, РИНЦ, MedLine, Google Scholar, Science Direct. Рассматривались статьи зарубежных и отечественных авторов. Поиск проводился по следующим ключевым словам: внеклеточная дезоксирибонуклеиновая кислота, биологические маркеры, сердечно-сосудистые заболевания, extracellular deoxyribonucleic acid, biological markers, cardiovascular disease. Обзор включает исследования, опубликованные преимущественно за последние 10 лет, а также отдельные ранее изданные основополагающие работы. Биологические аспекты cfDNA

Впервые cfDNA была признана многообещающим биологическим маркером при формировании концепции «жидкой биопсии» в области онкологии [10]. С тех пор многочисленные исследования были посвящены роли cfDNA при различных патологических состояниях. Однако многие аспекты процессов, связанных с cfDNA, например ее происхождение, еще предстоит определить [5, 6].

К семейству cfDNA, вероятно, относятся клеточная и митохондриальная DNA (из соматических и раковых клеток, подвергшихся апоптозу и некрозу), DNA из эритро-бластов, ядра которых энуклеируются на этапе дифференцировки в красные кровяные тельца, DNA из лимфоцитов в процессе их апоптотической гибели после стимуляции, эмбриональная DNA, вирусная и бактериальная DNA [11]. Митохондриальная DNA играет решающую роль в повреждении сердечных клеток — она является молекулярным фрагментом, ассоциированным с повреждениями (damage-associated molecular patterns, DAMPs) [12].

Существует несколько мнений по поводу происхождения cfDNA. Основные из них — это образование пула cfDNA в результате гибели клеток (теория «клеточной гибели путем апоптоза и/или некроза»), активная секреция клетками (теория «метаболической DNA») и нетоз (NETosis, neutrophil extracellular traps) (протрузия крупных фрагментов DNA через мембрану нейтрофилов с образованием так называемого «облака» DNA вокруг лейкоцита, последующим отщеплением фрагментов DNA и их высвобождением в циркулирующий кровоток в результате воздействия нуклеаз) [5, 6]. Была ли cfDNA образована в результате апоптоза или некроза, можно определить по размеру фрагментов DNA. DNA, высвобождаемая при апоптозе, при участии эндонуклеаз первоначально расщепляется на большие фрагменты размером 50-300 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.) с последующей деградацией на более мелкие фрагменты (180-200 пар нуклеотидов (п.н.)) [5, 6]. В отличие от запрограммированной гибели клеток, для некроза характерна высокомолекулярная cfDNA (~ 10000 п.н.) [13]. Апоптотические и некротические тела с фрагментированными клеточными органеллами и DNA удаляются посредством фагоцитоза [14]. Однако нарушение клиренса может вызвать накопление cfDNA и впоследствии привести к аутовоспалительному ответу [15, 16].

Исследования показали увеличение уровней cfDNA при различных ССЗ (см. рисунок) 7.

При АГ, инфаркте миокарда (ИМ) и сердечной недостаточности (СН) из поврежденной ткани высвобождается cfDNA в результате распада клеток и последующего выброса содержимого мертвых клеток в кровоток. В зависимости от особенностей гибели клеток (апоптоза или некроза) обнаруживаются более мелкие или более крупные фрагменты cfDNA. Активное высвобождение из живых клеток приводит к активации иммунных клеток и повышению уровня цитокинов, хемокинов и матриксных металлопротеиназ (MMPs).

Повышение уровней cfDNA у пациентов с АГ

Было показано, что неконтролируемая АГ является независимым детерминантом повышенного уровня cfDNA [17, 18]. Предполагается тесная связь между воспалением и АГ, однако вопрос о том, является воспаление причиной или следствием повышения АД, все еще остается открытым 20. Выявлено, что повышенные уровни cfDNA связаны со множеством факторов, включая усиление системного воспаления, повышенный уровень холестерина и триглицеридов, а также более высокое систолическое АД и пульсовое давление [18]. При АГ ткани и органы подвергаются длительному воздействию повреждающих факторов, таких как окислительный стресс, воспаление и повышенный уровень ангиотензина II (Ang II) [22]. Важным результатом воспаления, вызванного Ang II, является усиленное образование активных форм кислорода в сосудах [23, 24]. Как следствие окислительного стресса, происходит повреждение геномной DNA, что вносит вклад в общий пул cfDNA и приводит к активации сигнального пути толл-подобных рецепторов (TLR) с последующей дисфункцией сосудов и повышением АД [25, 26].

Было продемонстрировано, что у пациентов с АГ и СД повышенный уровень cfDNA указывает на возможную связь со снижением эластичности артерий [18, 27]. Описано, что у женщин в постменопаузе, не применяющих заместительную гормональную терапию, увеличение уровней cfDNA указывает на жесткость артерий (более высокий индекс жесткости, модуль упругости Юнга и более низкая податливость сонной артерии), системное воспаление (повышенный уровень С-реактивного белка, интерлейкина 6 и фактора некроза опухоли α (TNF-α), нарушение метаболизма глюкозы и повышенное АД [18].

Повышение уровней cfDNA при ИМ и СН

В плазме крови пациентов с ИМ cfDNA коррелирует с хорошо известными маркерами некроза, такими как тропонин, креатинфосфокиназа (КФК), а также с фракцией выброса левого желудочка [28, 32-34]. Сильная корреляция между уровнями cfDNA и маркерами некроза может указывать на то, что количество высвобождаемой cfDNA зависит от тяжести повреждения миокарда. Интересно, что уровни сердечной cfDNA были повышены у пациентов с ИМ с нормальными (

A. Shimony et al. [32] измеряли концентрации cfDNA, тропонина T и CK одновременно у 16 пациентов с острым ИМ без подъема сегмента ST при поступлении в стационар и еще в 3 временных точках. Контрольную группу составили 47 здоровых добровольцев. Пиковые уровни cfDNA оказались значительно выше у больных по сравнению с контрольной группой (p=0,001) и коррелировали с пиковыми уровнями КФК и тропонина T (r=0,79, p

В исследовании L. Wang et al. [35] оценивали уровни ядерной и митохондриальной DNA у 25 пациентов с острым ИМ, 25 лиц без ИМ из группы контроля (с риском развития ИМ) и 20 здоровых добровольцев. Концентрации ядерной и митохондриальной DNA были значительно выше в группе острого ИМ в 1-й день госпитализации по сравнению с контрольной группой без ИМ (ядерная: 0,4948±0,0830 нг/мкл против 0,2047±0,0222 нг/мкл, p

J. Xie et al. [29] оценивали показатели cfDNA у 130 пациентов с ССЗ, а также у 30 здоровых добровольцев. Из 130 пациентов у 100 был диагностирован острый ИМ. Средняя концентрация cfDNA у больных с острым ИМ была в 5 раз выше в начале заболевания по сравнению со здоровыми людьми. Содержание cfDNA у больных острым ИМ также было выше, чем у других пациентов с заболеваниями сердца.

T. Yokokawa et al. [36] провели исследование, посвященное изучению cfDNA при СН (32 пациента с СН и 28 пациентов контрольной группы). Общие уровни cfDNA не различались между группами (p=0,343). Бисульфитно-цифровая полимеразная цепная реакция с использованием неметилированного локуса FAM101A продемонстрировала, что специфическая для кардиомиоцитов cfDNA была значительно повышена у пациентов с СН по сравнению с группой контроля (медиана 0,99 (межквартильный интервал 0,77-1,98) против 0 (0-0,91); p=0,003). Уровни cfDNA значительно различались у пациентов с СН и лиц из контрольной группы (AUC 0,716; p=0,003); положительно коррелировали с концентрацией тропонина I (r=0,438; p=0,003), но не с уровнем мозгового натрийуретического пептида (r=0,275; p=0,058).

S. Zangwill et al. [37] обследовали пациентов, подвергшихся трансплантации сердца. Образцы крови брали в 3 временных точках в течение 10 дней после трансплантации. Пациенты, которые умерли в 1-й год, имели повышенные уровни cfDNA в течение 7 дней после операции.

J. Fujihara et al. [38] продемонстрировали, что концентрации cfDNA у пациентов с ИМ и стенокардией напряжения были значительно выше, чем у здоровых лиц. Электрофорез на микрочипах cfDNA плазмы выявил 1 фрагмент (150-200 п.н.) у нескольких здоровых добровольцев из контрольной группы и 3 фрагмента (150-200, 300-400 и 500-600 п.н.) во всех образцах у кардиологических пациентов. Более того, соотношение cfDNA 150-200 / 500-600 п.н. было значительно более распространено у лиц с ИМ, чем у лиц с другими заболеваниями сердца. Кроме того, наблюдалась положительная корреляция между активностью фермента дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I), участвующей в процессинге двухцепочечной ДНК, и концентрацией cfDNA. Эти результаты предполагают, что cfDNA плазмы у пациентов с заболеваниями сердца связана с апоптозом; соотношение 150-200 / 500-600 п.н. для cfDNA может быть новым диагностическим лабораторным индикатором ИМ.

J. Scott et al. [39] провели проспективное слепое обсервационное исследование, включившее 87 пациентов, перенесших трансплантацию сердца. Авторы показали, что уровни cfDNA более 50 нг/мл были связаны с повышенной смертностью (p=0,01, AUC 0,93, чувствительность 0,44, специфичность 0,97) и инфекционными осложнениями (p

Новые биомаркеры ССЗ

Поиск новых биологических маркеров, изучение их патофизиологической роли и изменения их уровня под действием различных вариантов лечения позволяют глубже понять патогенетические аспекты развития и течения ССЗ [3]. Все больше находят свое применение в реальной клинической практике новые биомаркеры 41, такие как:

фактор роста фибробластов-23;

фактор роста фибробластов-15;

маркер фиброза галектин-3;

стимулирующий фактор роста ST2;

хемокин CX3CL1 (фракталкин);

суррогатный маркер вазопрессина.

Заключение

По современным данным, уровень описанного в нашем обзоре биологического маркера cfDNA повышается при различных ССЗ. Для идентификации новых биологических маркеров ССЗ используются современные технологии. Следующим закономерным шагом, вероятнее всего, станет создание мультимаркерной модели. Конечно, для этого потребуется совершенствование биоинформационных технологий, необходимых для анализа большой базы данных. Благодаря их использованию возможно не только обнаружение новых биологических маркеров, но и прогресс в лечении ССЗ. Необходимо дальнейшее изучение роли cfDNA, в том числе клинические исследования, для определения диагностической и прогностической значимости данного маркера.

Список литературы Свернуть Развернуть

Контент доступен под лицензией Creative Commons «Attribution» («Атрибуция») 4.0 Всемирная.

Читайте также: