Гемофильные бактерии. Гемофилы. Бактерии рода Haemophilus. Свойства гемофил. Дифференциальные признаки гемофил.

Обновлено: 18.05.2024

Медицинская микробиология:

Бактерии Haemophilus influenzae: морфологические, культуральные, биохимические свойства

Бактерии рода Haemophilus, с одной стороны, входят в состав нормальной микрофлоры слизистой оболочки ротоглотки человека и животных, а с другой, — многие из них патогенны и являются облигатными паразитами. Типовой представитель рода — Haemophilus influenzae. В 1883 г. Р. Кох в гное больных конъюнктивитом обнаружил мелкие грамотрицательные палочки, а в 1891 г. М.И. Афанасьев и в 1892 г. Р. Пфейффер (R. Pfeiffer) впервые из мокроты больных гриппом выделили их в чистой культуре. Впоследствии эти бактерии были названы палочкой Афанасьева-Пфейффера.

Бактерии рода Haemophilus включают 21 вид и относятся к семейству Pasteurellaceae, в которое входят также роды Pasteurella и Actinobacillus.

Бактерии рода Haemophilus представляют собой полиморфные клетки (сферические, овальные или палочковидные), обычно мелкие, менее 1 мкм в ширину и различные по длине, иногда образуют нити. Они являются неподвижными грамотрицательными неспорообразующими факультативными анаэробами. Бактерии этого рода неустойчивы во внешнй среде, быстро погибают вне организма, поэтому распространяются в основном воздушно-капельным путем при личном контакте.

Почти все виды нуждаются в готовых факторах роста, присутствующих в крови, особенно в факторе X и/или V (поэтому их называют гемоглобинофильными бактериями или гемофилами). Фактор X термостабилен, представляет собой группу тетрапирольных соединений, входящих в состав железосодержащих пигментов, например, гемина. Виды гемофилов, нуждающиеся в факторе X, не способны синтезировать протопорфирин, что используется в качестве одного из идентификационных тестов. Большинство видов гемофилов нуждаются в термолабильном факторе V — никотинамидадениндинуклеотиде (НАД) или никотинамидадениндинуклеотидфосфате (НАДО), который участвует в окислительно-восстановительных реакциях.

Потребность бактерий в факторах X и V является критерием внутриродовой дифференциации бактерий рода Haemophilus, которые можно рассматривать как условно патогенные микроорганизмы. С человеком ассоциировано 9 видов.

Бактерия Н. influenzae связана с человеком; других резервуаров в природе не существует.

а) Морфологические, культуральные, биохимические и другие физиологические свойства. В состав клеточной стенки Н. influenzae серотипа b входит наружная мембрана, которая, как и у других грамотрицательных бактерий, состоит из фосфолипида, липополисахарида (ЛПС) и более 30 белков наружной мембраны, 6 из которых являются основными, выполняют различные функции и составляют 80% общего белка. ЛПС наружной мембраны состоит из липида А, ядра — кора и О-специфической цепи полисахарида, имеющего более короткие цепи липоолигосахаридов (ЛОС), чем классические ЛПС энтеробактерий.

Штаммы H. influenzae типа b обладают капсулой, которая представляет собой полимер рибозы и рибитола, скрепленных фосфорной кислотой (полирибозилрибитолфосфат, ПРФ).

Н. influenzae неподвижны, не имеют жгутиков; от поверхности клетки отходят пили, состоящие из белка пилина и отвечающие за адгезию к поражаемой клетке.

Бактерии, относящиеся к роду Haemophilus, — хемоорганотрофы и даже при наличии факторов роста X и V лучше растут на средах сложного состава; в питательную основу, изготавливаемую за рубежом, входят сердечно-мозговой настой, препараты «Протеозопептон», «Биополитон», к которым в качестве комплексного витаминного препарата добавляют IsoVitalex; в России используют «шоколадно-кровяной» или кровяной агар. Как отмечено выше, бактерии данного рода относятся к факультативным анаэробам.

При изучении энергетического метаболизма Н. influenzae было показано, что существует компенсаторный механизм, благодаря которому потребление ими углеводов и состояние их электрон-транспортной системы взаимосвязаны. Гемофильные бактерии обладают ферментными системами углеводного метаболизма, которые имеются у большинства грамотрицательных бактерий. Следует подчеркнуть, что существуют видовые особенности гемофильных бактерий, связанные как со строением электрон-транспортной системы (состав хинонов и цитохромов), так и с наличием альтернативных путей углеводного метаболизма.

Н. influenzae при культивировании весьма прихотливы к искусственным питательным средам. Обязательным условием их роста является наличие в среде X и V факторов. На кровяном агаре, приготовленном на основе лошадиной или кроличьей крови, Н. influenzae могут расти в виде мельчайших колоний. Кровяной агар с нативными человеческими или бараньими эритроцитами не подходит, так как указанные эритроциты содержат ферменты, инактивирующие фактор V. Общепринятой питательной средой для гемофилов является «шоколадно-кровяной» агар.

Бактерии рода Haemophilus отличаются биологическими особенностями, в частности, как отмечено выше, высокими питатательными потребностями: они растут на полноценных питательных средах, богатых аминокислотами, витаминами и требуют добавления факторов роста X и V, что является почти универсальным признаком принадлежности к этому роду бактерий. Другим характерным для ряда видов этого рода признаком является проявление каталазной активности. Исключение иногда составляют Н. parainfluenzae и Н. segnis, у которых этот признак вариабелен, и Н. aphrophilus, Н. paraphrophilus и Н. ducreyi, у которых он отсутствует.

Все виды гемофильных бактерий способны редуцировать нитраты до нитритов. Виды различаются по активности в отношении ферментов цитохромоксидазы, β-галактозидазы. Способностью вызывать β-гемолиз характеризуются только два вида — Н. haemolyticus и Н. parahaemolyticus, в то время как Н. influenzae и биовар aegyptius отличаются от других видов отсутствием β-галактозидазной активности. По способности гидролизовать мочевину виды рода Haemophilus и штаммы внутри видов Н. influenzae и Н. parainfluenzae различаются, и этот признак используется для биохимического типирования штаммов этих видов.

Н. influenzae обладают цитохромоксидазой и каталазой, нуждаются в V и X факторах роста и не обладают β-галактозидазной активностью. Это основные дифференциально-диагностические признаки данного вида микроорганизмов.

Бескапсульные штаммы обозначаются как нетипируемые и для их характеристики используют только биотипирование на основе биохимических тестов, предложенное М. Kilian, разделившей весь вид на 8 биотипов. Наиболее распространенными являются первые 3 биотипа, охватывающие от 70 до 85% всех изолятов. Наибольшей вирулентностью характеризуются штаммы биотипа I. Подавляющее большинство капсульных штаммов Н. influenzae серотипа b (Hib) относится к биотипу I и нередко к биотипу II. Биотип I преобладет среди изолятов, выделенных из крови, спинномозговой жидкости, мокроты, полученной от больных с бронхоэктазами, муковисцидозом.

Выявлена также большая частота изоляции этого биотипа от детей младше 1 года. Биотип II является наиболее распространенным среди штаммов, выделенных при различных инфекциях. К нему относятся как капсульные, так и нетипируемые штаммы, и зависимости частоты распространения этого биотипа среди изолятов из различных источников не выявлено. К биотипу III относятся изоляты, полученные из отделяемого глаз при конъюнктивитах. Биотип IV чаще вызывает инфекции женской половой сферы, перинатальные и неонатальные инфекционные заболевания.

б) Устойчивость к факторам внешней среды, к антибиотикам. Во внешней среде Н. influenzae нестабильны. Они погибают в течение 30 мин при температуре 55°С, под действием солнечных лучей и при высыхании. Дезинфицирующие растворы в обычно применяемых концентрациях убивают гемофильную палочку моментально.

Наиболее значимой, с клинической точки зрения, является проблема резистентности гемофильной палочки к аминопенициллинам за счет продукции β-лактамаз (ТЕМ-1 и ROB-1). Штаммы, продуцирующие β-лактамазы, обычно чувствительны к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам II—IV поколений. В последние годы описаны β-лактамазонегативные амнициллинорезистентные штаммы (БЛНАР). Устойчивость к ампициллину у штаммов, не продуцирующих Р-лактамазы, обусловлена модификацией мишени действия этих антибиотиков — пенициллиносвязывающих белков в сочетании (или без) с активным выведением антибиотиков.

в) Антигенное строение. Антигенная структура бактерий рода Haemophilus, в частности Н. influenzae, наиболее опасного для человека и часто встречающегося вида, состоит из капсульных и соматических антигенов. М. Pittman более 70 лет тому назад определила наличие двух принципиально различных форм Н. influenzae — капсульной (инкапсулированной) и бескапсульной (или некапсульной, нетипируемой). Штаммы Н. influenzae, имеющие капсулу, в зависимости от ее полисахаридного состава подразделяются на 6 серотипов: a, b, с, d, е, f. Капсула является основным фактором вирулентности. Большинство инвазивных инфекций вызывается бактериями типа b (Hib). Серотипирование выделенных капсульных штаммов проводится при помощи сывороток к определенным типам.

Свойства соматических антигенов определяются структурой ЛПС. Анализ ЛПС 6 штаммов Н. influenzae, представляющих 6 известных капсульных серотипов, показал их сходство по качественному составу и различия в количественном соотношении компонентов, по их антигенной специфичности.

г) Факторы патогенности. Основным фактором патогенности Н. influenzae является капсула. Она препятствует фагоцитозу бактерий и обеспечивает их выживаемость в кровяном русле. Наиболее инвазивными капсульными штаммами являются Н. influenzae типа b (Hib), капсула которых состоит из ПРФ. Следует отметить, что капсула других типов содержит гексозу, что, вероятно, и определяет их меньшую вирулентность.

Пили — перитрихиальные образования длиной около 450 нм и с мол. массой около 27 кД, обусловливают прикрепление бактерий не только к муцину, но и к клеткам эпителия, фибронектину и эритроцитам.

Пили затрудняют фагоцитоз и способствуют адгезии бактерий к слизистой оболочке верхних дыхательных путей (ВДП) с последующим проникновением в подслизистое пространство, что приводит к местной воспалительной реакции, а более вирулентные штаммы проникают в лимфо- и кровоток верхних дыхательных путей. Белки наружной мембраны и пили играют ведущую роль в формировании на поверхности клетки биологической пленки, являющейся эффективным способом преодоления факторов иммунитета.

К другим факторам, усиливающим колонизацию гемофильных бактерий, относятся липополисахаридный (доминирует в развитии септического шока) и термостабильный гликопротеиновый (повреждающий реснички и поверхность эпителия), а также IgA1-протеаза, инактивирующая секреторные антитела. Известно, что ДОС гемофильных бактерий активируют продукцию воспалительных цитокинов моноцитами. Исследователями была показана тесная корреляция между капсульным серотипом и типом IgAl-протеазы. Так, Н. influenzae серотипов a, b, d, f продуцировали IgAl-протеазу I типа, которую никогда не обнаруживали у бескапсульных штаммов. Для серотипов с и е характерен II тип IgAl-протеазы. Эти данные важны для таксономии Н. influenzae и при эпидемиологических исследованиях.

д) Биологические модели. Модели, адекватной заболеванию человека, не существует. Отдельные этапы инфекционного процесса можно изучать при заражении новорожденных крыс, отит моделируют у шиншилл. Известно, что мыши линии BALB/c довольно восприимчивы к нетипируемым штаммам гемофильной палочки.

16.2.3. Гемофильные бактерии (род Haemophilus)

В названии рода Haemophilus (от греч. haima - кровь, philos - любить) отражена зависимость этих бактерий от крови или ее производных при росте на искусственных питательных средах. Среди представителей рода описано около 20 видов бактерий. Гемофильные бактерии - это мелкие грамотрицательные палочки,

которые культивируют на обогащенных питательных средах, содержащих кровь или ее компоненты в качестве факторов роста (см. ниже). Многие микроорганизмы этого рода в норме обитают на слизистых оболочках дыхательных путей человека. Наиболее важная роль в патологии человека принадлежит бактериям вида Haemophilus influenzae, преимущественно типа b. Они вызывают инфекции с респираторным механизмом заражения (менингиты, синуситы, бронхиты и др.), преимущественно у детей. Кроме того, патогенным для человека является возбудитель мягкого шанкра H. ducreyi.

Haemophilus influenzae

Гемофильные палочки были впервые выделены русским бактериологом М.И. Афанасьевым в 1891 г. и позднее, в 1892 г., немецким бактериологом Р. Пфейффером от больных, умерших от гриппа. Бактерии H. influenzae долгое время считали возбудителем гриппа и называли палочкой инфлюэнцы (от англ. influenzae - грипп). Традиционно также и другое название - «палочка Пфейффера».

Морфология и тинкториальные свойства. Гемофильные бактерии - мелкие грамотрицательные сферические, овоидные или палочковидные бактерии, которые располагаются парами в виде коротких цепочек или нитей. Они неподвижны, спор не образуют, имеют пили. Наличие капсулы является непостоянным признаком, и ее обнаружение может служить маркером вирулентности штамма (см. далее).

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы, но лучше растут в аэробных условиях. Гемофилы не способны синтезировать гем, входящий в состав ферментов дыхательной цепи, и/или НАД (НАДФ), являющийся кофактором окислительно- восстановительных ферментов, поэтому они нуждаются в факторах роста, присутствующих в крови: Х-факторе (протопорфирин IX в составе гематина или гемина), а также V-факторе (НАД или

Для культивирования гемофильной палочки применяют шоколадный агар - питательную среду коричневого цвета, которую получают путем прогревания кровяного агара при 80 ?С в течение 15 мин. Оптимальная температура роста бактерий 35-37 ?С. Колонии появляются через 36-48 ч. Для H. influenzae характерна R-, S-диссоциация, т.е. способность к образованию R- и S-форм

колоний. Слизистые, более крупные (диаметр 3-4 мм) радужные S-формы колоний характерны для капсульных вирулентных штам- мов. Слабовирулентные бескапсульные варианты гемофильной палочки образуют R-колонии - более мелкие (около 1 мм), мелкозернистые, с неровными краями.

Характерной особенностью гемофильных бактерий является «феномен кормушки» или «феномен сателлита»: они могут расти на кровяном агаре вокруг колоний стафилококков или других бактерий, вызывающих гемолиз или продуцирующих НАД. Гемофильные бактерии гемолитической активностью не обладают.

Биохимическая активность. Идентификация гемофильных палочек основана на их потребности в факторах роста и некоторых биохимических тестах.

Гемофильные бактерии ферментируют глюкозу до кислоты, восстанавливают нитрат до нитрита. H. influenzae подразделяют на 8 биоваров (I-VIII) в зависимости от их способности продуцировать индол, уреазу, орнитиндекарбоксилазу. Кроме того, вид H. influenzae включает биовар aegyptius (см. табл. 16.4 и 16.5). Каталазная и оксидазная активность различны у разных видов гемофильных бактерий.

Антигенные свойства. H. influenzae обладают соматическим О-антигеном и капсульным полисахаридным К-антигеном, в за- висимости от особенностей строения которого H. influenzae делят на 6 серотипов (а, b, c, d, e, f). Капсульный антиген наиболее важного в патологии человека серотипа b гемофильной палочки представляет собой полимер рибозы и рибитола - полирибозорибитолфосфат (PRP).

Капсульные варианты гемофильных бактерий могут быть идентифицированы с помощью теста набухания капсулы или РИФ со специфическими сыворотками. Большинство вариантов H. influenzae, представителей нормальной микрофлоры верхних отделов респираторного тракта, являются бескапсульными формами, которые принято называть нетипируемыми.

Факторы вирулентности. Ведущим фактором вирулентности H. influenzae является капсула, которая защищает бактерии от фагоцитоза. Штаммы, имеющие капсулу (преимущественно серотипа b), вызывают наиболее тяжело протекающие инфекции.

Гемофильные палочки могут также продуцировать IgA-протеазу, инактивирующую секреторные антитела. IgA-протеаза и пили (фим- брии) возбудителя играют ведущую роль в прикреплении микроорганизмов к эпителию респираторного тракта и его колонизации.

ЛПС наружной мембраны H. influenzae играет роль эндотоксина, участвуя также в процессах адгезии и инвазии гемофильной палочки. Эндотоксин может также вызывать паралич ресничек мер- цательного эпителия респираторного тракта человека, способствуя тем самым микробной колонизации верхних дыхательных путей.

Резистентность. Бактерии малоустойчивы в окружающей среде. Гемофильные бактерии довольно чувствительны к нагреванию и обычным дезинфицирующим средствам. H. influenzae может продуцировать β-лактамазу, придающую ей устойчивость к некоторым β-лактамным антибиотикам.

Эпидемиология. H. influenzae патогенны только для человека.

Источник инфекции - больной человек или бактерионоситель. Ведущий механизм заражения гемофильной инфекцией - респи- раторный, путь передачи воздушно-капельный (при распылении капель секрета верхних дыхательных путей при кашле, разговоре, чиханье).

Гемофильные палочки вызывают пневмонии, средние отиты (поражение среднего уха), синуситы (воспаление придаточных пазух носа), ларинготрахеиты, бронхиты и другие инфекции дыхательных путей. Наиболее опасны менингиты и септицемии гемофильной этиологии, которым чаще подвержены дети в возрасте от 2 мес до 6 лет. Встречается гемофильная инфекция и у пациентов старшего возраста, в особенности у больных с хрони- ческой легочной патологией, сниженным иммунитетом, а также у курильщиков.

Патогенез и клиническая картина. Проникая через верхние дыхательные пути, H. influenzae прикрепляется к мерцательному эпителию и колонизирует его. Затем бактерии проникают в подслизистый слой и с помощью эндотоксина вызывают местные гнойно-воспалительные процессы.

H. influenzae, преимущественно типа b, может распространяться в организме гематогенно, вызывая септицемию, септический артрит, эндокардит. После проникновения через гематоэнцефалический барьер капсульные варианты гемофильной палочки вызывают тяжелые гнойные менингиты. Воспалительный экссудат накапливается в спинно-мозговом канале и желудочках мозга и служит хорошей питательной средой для гемофильной палочки, способствуя ее размножению. Нарушение оттока жидкости из субарахноидального пространства приводит к повышению внутричерепного давления, субдуральному отеку, а васкулит и тромбофлебит мягкой мозговой оболочки - к некротическим изменениям мозговой ткани. Гнойный менингит, вызванный H. influenzae типа b, заканчивается летально в 5% случаев даже при проведении адекватной терапии. Гнойные поражения твердой и мягкой мозговых оболочек могут приводить к тяжелым осложнениям: потере зрения, глухоте, гидроцефалии, слабоумию. H. influenzae типа b является также возбудителем острого бактериального эпиглоттита (воспаление надгортанника) у детей 2-5 лет, который приводит к нарушению проходимости дыхательных путей и асфиксии.

Иммунитет. В течение первых 3-6 мес жизни дети защищены от инфекции материнскими антителами класса IgG, полученными через плаценту. Поэтому в этом возрасте заболевания редки. PRP капсульного антигена типа b является Т-независимым антигеном, антитела к которому образуются без участия Т-хелперов. У младенцев способность синтезировать антитела к таким антигенам снижена, поэтому они не способны синтезировать необходимое количество антител к этому антигену и пик заболеваемости гемофильной инфекцией (в особенности типа b) приходится на возраст от 6 мес до 2 лет, когда концентрация материнских антител заметно снижается.

Иммунитет после перенесенной гемофильной инфекции мало изучен. Однако известно, что к 5-6 годам в сыворотке крови мно- гих детей (даже невакцинированных и непереболевших) имеются естественно приобретенные протективные антитела к капсульному антигену H. influenzae типа b (анти-PRP-антитела). Тем не менее пневмония и артрит, вызванные H. influenzae, могут развиваться у взрослых даже при наличии таких антител.

Диагностика. Симптомы гемофильных инфекций обычно определяются локализацией воспалительного процесса, а не этиологическим агентом, поэтому их диагностика базируется главным образом на выделении и идентификации возбудителя.

Материалом для исследования служат мазок из носоглотки, кровь, мокрота или ликвор, гнойное отделяемое (при отитах и синуситах), суставная жидкость (при септических артритах). Бактериоскопиче- ский метод применяют при гнойном менингите (изучение мазков из цереброспинальной жидкости, окрашенных по Граму). Для ускоренной диагностики и дифференциации гемофильной палочки от других возбудителей менингита используют тесты для обнаружения b-капсульного антигена H. influenzae: встречный иммуноэлектрофорез, прямую РИФ или реакцию латекс-агглютинации с анти-b- антителами. При высокой концентрации возбудителя в исследуемом материале возможна также постановка теста набухания капсулы.

Бактериологический метод исследования применяют для выделения и идентификации возбудителя из исследуемого материа- ла. Для дифференциации H. influenzae от других родственных им грамотрицательных палочек определяют их потребность в Х- и V-факторах роста, отсутствие гемолиза на кровяном агаре и пр. (см. табл. 16.4 и 16.5).

Лечение проводят с помощью антибиотиков. При отсутствии адекватного лечения летальность от гемофильного менингита и септицемии составляет около 90%, причем смерть может наступить в первые 24 ч от начала заболевания. Поэтому лечение назначают эмпирически до получения результатов антибиотикограммы. Препаратами выбора являются цефалоспорины III поколения (например, цефтриаксон, цефотаксим).

При синуситах, отитах и других инфекциях дыхательных путей гемофильной этиологии назначают β-лактамные антибиотики с ингибиторами β-лактамазы (например, амоксициллин с клавулановой кислотой) или бисептол.

Профилактика. Для профилактики гемофильной инфекции типа b разработана субкорпускулярная вакцина, содержащая очищенный капсульный антиген (RPR). Вакцинацию проводят по эпидемиологическим показаниям детям старше 1,5 лет из-за ее низкой иммуногенности. В России плановая вакцинация против гемофильной инфекции не проводится.

Для повышения эффективности вакцинации против H. influenza типа b предложено использовать конъюгированные вакцины, содержащие RPR-антиген на белке-носителе, например в составе комбинированной вакцины для профилактики менингококкового и гемофильного менингитов. Применение вакцины не защищает от носительства гемофильных палочек.

1.3.2. Гемофильные бактерии

Впервые гемофильные бактерии были выделены Р. Кохом в начале 80-х годов XIX века из конъюнктивального экссудата. Позднее М.И. Афанасьев (1891 г.) и Р. Пфейффер (1892 г.) похожего возбудителя выделили из трупа больного, погибшего от гриппа; отсюда его длительное время считали причиной гриппа, что получило отражение в видовом названии.

Классификация

Гемофильные бактерии относятся к семейству Pasteurellaceae, роду Haemophilus. Кроме него в семейство входят роды Pasteurella и Aggregatibacter. Род Haemophilus включает около 20 видов, среди них есть сапрофиты и патогенные микроорганизмы.

Наибольшую роль в патологии играет H. influenzae, вызывающий воспалительные процессы в респираторном тракте, а также менингиты, бактериемию и другие инвазивные инфекции.

По свойствам с ним сходны H. parainfluenzae, H. haemolyticus and H. parahaemolyticus (последние 2 вида проявляют гемолитическую активность).

H. ducreyi является возбудителем мягкого шанкра - заболевания, передаваемого половым путем.

Родственные микроорганизмы вида Аggregatibacter aprophilus могут вызывать подострый эндокардит.

Являются мелкими коккобактериями с выраженным полиморфизмом. Образуют капсулу, не имеют спор и жгутиков, по Граму окрашиваются отрицательно.

Культуральные свойства

Весьма прихотливы к питательным средам. Нуждаются в наличии факторов роста в среде.

Этими факторами являются факторы Х или V, которые содержатся в эритроцитах: Фактор V - термолабильный кофермент (НАД или НАДФ), содержится в дрожжах, в тканях растений и животных, участвует в энергетическом метаболизме; фактор Х - гемин, термостабилен, входит в состав железосодержащих пигментов. Гемофильные бактерии не способны к его синтезу.

Отсюда лучшими средами для культивирования являются кроличий или лошадиный кровяной агар и шоколадный агар. На этих средах чаще вырастают S- или М- (слизистые) формы колоний. Непатогенные, бескапсульные штаммы образуют R-формы колоний.

Оптимальная температура роста 37 0 С. Длительность роста - 36-48 часов. На кровяном агаре с добавлением сердечно-мозгового экстракта через 24 часа появляется рост мелких колоний с радужными переливами, гемолиз отсутствует. У беcкапсульных вариантов радужная расцветка не выявляется. На жидких средах с кровью рост чаще диффузный, реже - придонный.

Биохимические свойства

Факультативные анаэробы. Метаболизм смешанный.

H. influenzae разлагает глюкозу, обладает каталазой, оксидазой, нуждается в X-, V-факторах.

Часть штаммов образует индол и разлагает мочевину, по этим признакам проводится биотипирование H. influenzae.

H.ducreyi не обладает сахаролитической активностью, нуждается в X-факторе, имеет каталазу и оксидазу.

Дифференциация гемофильных бактерий по биохимическим свойствам представлена в таблице.

Антигенная структура

О - соматический (ЛПС) и К - капсульный полисахаридный антиген; по К-антигену выделяют в реакции агглютинации или преципитации с монорецепторными сыворотками 6 серовариантов (a, b, c, d, e, f). Бескапсульные штаммы обозначаются как нетипируемые.

Белковый антиген М имеется у непатогенных штаммов.

Факторы патогенности

Основным фактором вирулентности является капсула.

Большинство инвазивных инфекций вызывается капсульными штаммами Н. influenzae типа b (Hib).

Капсула Hib состоит из полирибозилрибитолфосфата (ПРРФ), то есть содержит в качестве мономера пентозу (рибозу) в отличие от других типов, содержащих гексозу, что и определяет более высокую вирулентность. ПРРФ является Т-независимым АГ.

Бактерии имеют многочисленные адгезины в составе пилей.

Обладают IgА-протеазами, разрушающими секреторный IgА, что подавляет местный иммунитет слизистых.

ЛПС клеточной стенки является эндотоксином.

Возбудитель может продуцировать β-лактамазы, что обусловливает устойчивость к антибиотикам данной группы.

Резистентность

Патогенез и характеристика заболевания

Наибольшую роль в патологии человека играет H. influenzae, а также H. ducreyi - возбудитель мягкого шанкра. A. aphrophilus иногда способен вызывать подострый эндокардит.

Н. influenzae является патогеном исключительно человека (антропонозная инфекция). Гемофильные палочки, преимущественно нетипируемые их штаммы, часто входят в состав нормальной микрофлоры слизистых оболочек верхних дыхательных путей у здоровых взрослых и детей.

Однако на фоне сопутствующих заболеваний и при снижении местного иммунитета H. influenzae размножается на слизистых оболочках внутри- и внеклеточно, попадает в кровь. При этом через гематоэнцефалический барьер возбудитель может проникать в мозговые оболочки, что приводит к менингиту.

H. influenzae вызывают большое количество различных инфекций. В целом все инфекции, обусловленные гемофильной палочкой, можно подразделить на 2 типа: неинвазивные и инвазивные.

Неинвазивные инфекции связаны с распространением и колонизацией бактериями слизистой оболочки верхних дыхательных путей. При этом страдает мукоцилиарный клиренс.

Гемофилы могут вызывать острый синусит, острый средний отит и обострение хронического бронхита. Обычно эти заболевания являются осложнениями вирусных и других респираторных инфекций.

Инвазивные инфекции вызываются главным образом штаммами варианта Hib и связаны с гематогенным распространением возбудителей.

К ним относятся тяжелые заболевания - менингит, эпиглоттит (острое воспаление надгортанника), пневмония, бактериемия и сепсис.

Основные виды инфекций H. influenzae представлены в таблице

Источники инфекции - больной человек и носители, в носоглотке которых локализуется возбудитель.

Пути передачи - воздушно-капельный, в меньшей степени контактный.

В первую очередь инфекции, вызванные H. influenzae, поражают детей младшего возраста до 4-5 лет. Для них эти возбудители представляют наибольшую опасность.

Низкая частота развития инвазивных инфекций у детей первых двух месяцев жизни обусловлена наличием материнских антител. После этого срока уровень антигемофильных АТ падает, и ребенок становится восприимчивым к инфекции.

Защитный уровень АТ постепенно приобретается к 5-6 годам, что обусловливает снижение частоты и тяжести заболеваний.

Основным факторов вирулентности является полисахаридная капсула типа b, состоящая из полирибозилрибитолфосфата. Она защищает микроорганизм от фагоцитоза, опсонизации и комплемент-опосредованного лизиса. С ростом популяции людей, обладающих антителами к полирибозилрибитолфосфату, уменьшается и частота инвазивных инфекций.

Наиболее тяжелым заболеванием, вызванным H. influenzae, является гнойный менингит. Возбудитель проникает в клетки эпителия носоглотки, далее инвазирует субэпителиальные слои и попадает в кровь. При низком уровне АТ капсула обеспечивает выживание бактерий в крови, и они проникают в сосудистые сплетения головного мозга. Возбудитель активирует острое пиогенное воспаление в ЦНС. Эндотоксин стимулирует воспалительный процесс и поражает сосуды микроциркуляции с развитием тромбофлебитов. Это приводит к некрозу мозговой ткани.

Заболевание стремительно прогрессирует, и без лечения летальность может превысить 90%. После болезни у 10% детей остаются неврологические осложнения (глухота, гидроцефалия, ментальные расстройства).

Вариантом местной пиогенной инвазии является гемофильный эпиглоттит. Он представляет собой острое гнойное воспаление надгортанника с некрозом, что в тяжелых случаях приводит к смерти от асфиксии.

У рожениц и новорожденных может развиваться гемофильный сепсис. Наиболее частой причиной его являются нетипируемые штаммы возбудителя.

У взрослых гемофильная инфекция чаще всего возникает вторично как осложнение после вирусных или бактериальных респираторных инфекций. В составе микробных ассоциаций возбудитель вызывает пневмонию или обострение бронхита

Иммунитет после заболевания стойкий, в основном гуморальный; естественный пассивный иммунитет от матери сохраняется до 2-3 месяцев.

Лабораторная диагностика

В связи с тем, что гемофильная палочка вызывает широкий спектр инфекций, для микробиологической диагностики может направляться различный клинический материал.

Наибольшую диагностическую значимость представляет исследование в норме стерильных биологических жидкостей: крови, плевральной, перикардиальной, синовиальной и спинномозговой жидкости (СМЖ).

Бактериоскопический метод носит ориентировочный характер, при окраске по Грамму выявляют грамотрицательные полиморфные бактерии, чаще с капсулой.

В качестве экспресс-методов выявляют антигены возбудителя в исследуемом материале.

Для быстрой диагностики инфекций, вызванных Н. influenzae типа b, используются серологические методы обнаружения капсульного антигена в СМЖ, крови, плевральной жидкости и моче: латекс-агглютинация, реакция коагглютинации со стафилококковым протеином А и иммуноферментный анализ.

Более простыми методами являются реакции латекс- и коагглютинации с образцами СМЖ. В настоящее время наиболее широко применяется иммуноферментный анализ.

При исследовании образца спинномозговой жидкости необходимо немедленно начать исследование или хранить материал в термостате при температуре 35-37°С (при невозможности - при комнатной температуре не более 30 мин). Образцы СМЖ не должны помещаться в холодильник. Длительной хранение образцов может привести к гибели бактерий и ложноотрицательным результатам (за исключением теста на определение антигенов).

Для обогащения материала проводят центрифугирование СМЖ. Проводят окрашивание осадка по Граму. Далее определяют антиген Hib в надосадочной жидкости.

Затем проводят бактериологическое исследование осадка. Выполняют посев нескольких капель осадка СМЖ на поверхность чашек с шоколадным и кровяным агаром. Чашки инкубируют при температуре 35-37°С в атмосфере с 5-10% СО₂.

Другие биологические жидкости (синовиальная, перикардиальная, плевральная) также должны окрашиваться по Граму и исследоваться культурально.

Делают посев на среды с кровью, шоколадный агар. Идентификацию проводят по культуральным, биохимическим и антигенным свойствам с использованием специфических монорецепторных сывороток.

Параллельно проверяют потребность в X и V-факторах. Исследуемую культуру сеют сплошным газоном на плотную питательную среду. На посев накладывают два бумажных диска, смоченных, соответственно X и V-факторами. Если рост выявляется вокруг дисков, то подтверждают зависимость культуры от этих факторов.

Можно использовать тест сателлитных культур. На чашку с посевом культуры на кровяном агаре наносят в нескольких местах культуру S. aureus. При этом за счет выделяемого ими гемолизина вокруг колоний стафилококка наблюдается обильный рост исследуемой культуры. Аналогичные результаты можно получить при использовании диска с сапонином, который также лизирует эритроциты кровяного агара, высвобождая факторы X и V.

Гемофильный менингит требует немедленного назначения антибиотикотерапии. С учетом вероятной устойчивости возбудителя к ампициллину препаратами выбора являются цефалоспорины III поколения. Также назначают хлорамфеникол, фторхинолоны.

При лечении эпиглоттита применяют цефалоспорины III поколения, возможно назначение ингибитор-защищенных β-лактамов (амоксициллин-клавулановая кислота). Данные антибиотики используют также при отитах и синуситах.

Специфическая профилактика

Для предотвращения тяжелых, угрожающих жизни инфекций, вызываемых штаммами варианта Hib, разработаны химические комбинированные вакцины, отличающиеся высокой эффективностью и безопасностью, в том числе у детей младше 18 мес.

Они представляют собой очищенный капсульный полисахарид Hib, конъюгированный с другими АГ (например, столбнячным анатоксином или вакциной АКДС), что обеспечивает необходимую иммуногенность.

В настоящее время конъюгированная Hib вакцина внесена в расширенный календарь прививок в Республике Беларусь. Детей прививают четырехкратно в 3, 4, 5 и 18 месяцев.

Неспецифическая профилактика - изоляция и лечение больных, дезинфекция в очагах.

Гемофильные бактерии. Гемофилы. Бактерии рода Haemophilus. Свойства гемофил. Дифференциальные признаки гемофил.

Бактериологическая диагностика гемофильной инфекции (H. influenzae, Hib)

Для подтверждения этиологии заболевания и определения чувствительности выделенного возбудителя к антимикробным препаратам обязательно микробиологическое исследование. Оно состоит из следующих основных этапов:
1) получение и транспортировка клинического материала;
2) предварительное исследование: микроскопия клинического материала;
3) выделение чистой культуры при исследовании спинномозговой жидкости, крови и другого клинического материала;
4) идентификация выделенной культуры.

а) Получение и транспортировка клинического материала. В связи с тем, что гемофильная палочка вызывает широкий спектр инфекций, для микробиологического исследования может направляться различный клинический материал. Наибольшую диагностическую ценность представляют исследования стерильных в норме биологических жидкостей: крови, плевральной, перикардиальной, синовиальной, спинно-мозговой жидкостей (СМЖ). Для доказательства этиологической роли Н. influenzae в инфекции НДП необходимо предупреждение контаминации клинического материала микрофлорой ВДП.

Для этого применяют бронхоальвеолярный лаваж, бронхоскопию с «защищенными» щетками. В рутинной практике при инфекциях нижних дыхательных путей в качестве биоматериала для лабораторной диагностики используют мокроту, посев и учет которой проводят количественным методом. Взятие мазка с надгортанника при эпиглоттите имеет ограниченную диагностическую значимость и может представлять угрозу для жизни пациента (риск развития ларингоспазма). Не всегда целесообразно также микробиологическое исследование назофарингеальных мазков в связи с высокой частотой носительства Н. influenzae здоровыми детьми и взрослыми. В связи с низкой жизнеспособностью микроба во внешней среде рекомендуется использовать транспортные среды, например, полужидкий агар Эймиса с углем, и в течение 2 ч (не позднее) доставлять материал в лабораторию. СМЖ необходимо исследовать немедленно или хранить при 35-37°С не более 30 мин (не ставить в холодильник!).

б) Предварительное исследование: микроскопия клинического материала. Предварительным этапом, предшествующим непосредственному выделению бактерий, является исследование мазков клинического материала, окрашенных по Граму и/или метиленовым синим. 11ри окраске по Граму бактерии рода Haemophilus представляют собой мелкие, бледно окрашенные сафранином или фуксином грамотрицательные палочки, обладающие полиморфизмом, иногда образующие длинные нити. При окраске метиленовым синим гемофилыгые палочки имеют синий цвет на серо-голубом фоне. Отрицательный результат микроскопии не исключает возможности гемофильной инфекции, гак как в клиническом материале может присутствовать недостаточное количество микробов. Поэтому обязательно культуральное бактериологическое исследование, которое остается золотым стандартом микробиологической диагностики.

При исследовании материалов, содержащих микробные ассоциации (мокрота, материал из среднего уха, пазух носа), следует провести микроскопическое исследование мазка. Критерием пригодности мокроты для посева является наличие более 25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре 20 полей зрения мазка, окрашенного по Граму (при увеличении х100).

в) Бактериологическое исследование (при исследовании СМЖ, крови и другого клинического материала). Как отмечено выше, поступившую для анализа СМЖ необходимо исследовать немедленно. Для увеличения концентрации микроорганизмов рекомендуется центрифугировать не менее 1 мл образца СМЖ 5-15 мин при 1,5-3 тыс. об/мин. Надосадок асептически переносят в стерильную пробирку, а осадок перемешивают многократным пипетированием и проводят посев нескольких капель осадка СМЖ на поверхность чашек с кровяным «шоколадным», сывороточным агаром и на двухфазную среду (ДФС) (см. 32.2.2.18). Существуют коммерческие готовые чашки Петри с «шоколадным» агаром (bioMerieux, BBL) и добавки ростовых факторов: PolyVitex (bioMerieux), IsoVitalex (BBL), Supplement В (Difco Laboratories).

Недостатком «шоколадного» агара является невозможность изучить гемолитические свойства, которые позволили бы отдифференцировать Н. haemolyticus и Н. parahaemolyticus от Н. influenzae и Н. parainfluenzae.

Через 24 ч инкубации, независимо от мутности бульона, следует приготовить мазок. При наличии мутности бульона или положительной находке в мазке необходимо сразу сделать высев на сывороточный и «шоколадный» агар.

Для посева контаминированных образцов желательно использовать селективный агар или «шоколадный» агар с бацитрациновым диском. В качестве селективного используют «шоколадный» агар с добавлением бацитрацина, так как высокая концентрация этого антибиотика (300 мкг/мл) подавляет рост большинства других микроорганизмов (стафилококков, микрококков, стрептококков), что позволяет получить рост гемофильной палочки при сильно контаминированном клиническом материале. Можно использовать также диски с бацитрацином (10 ЕД), которые помещают после посева на «шоколадный» агар, поскольку устойчивые к бацитрацину гемофилы будут расти вокруг диска. Кроме плотных питательных сред, используют жидкие среды, в частности «шоколадный» бульон.

- капсульные штаммы образуют слизистые круглые сочные колонии сероватого цвета в диаметре до 2 мм, дающие радужную окраску в проходящем свете (иридиирующие);

- штаммы со слабовыраженной капсулой дают полупрозрачные круглые гладкие неиридиирующие колонии;

- бескапсульные штаммы образуют мелкие непрозрачные неиридиирующие колонии с неровными краями.

Для чистой культуры гемофильных бактерий характерно наличие специфического «мышиного» запаха.

1. Идентификация выделенной культуры. Для накопления биомассы, необходимой при идентификации культуры, подозрительные колонии отсевают «сектором» на чашки с «шоколадным» агаром или пробирки со скошенным «шоколадным» агаром. Из оставшейся части колонии делают мазки и окрашивают их по Граму. При просмотре мазков определяются мелкие грамотрицательные палочки; для бескапсульных штаммов характерен полиморфизм, проявляющийся в образовании нитевидных форм.

Дальнейший анализ проводится в соответствии со схемой, приведенной ниже, в которой этап накопления биомассы и приготовления мазка соответствует второму дню микробиологического исследования.

2. Схема микробиологического исследования. Первый день. Прямая микроскопия окрашенного мазка клинического материала. Первичный посев клинического материала (на «шоколадный», сывороточный агар, ДФС). При необходимости (в СМЖ) определение Hib-антигена в реакции латекс-агглютинации.

Второй день. Отбор подозрительных колоний, их изучение и пересев на чашку Петри с «шоколадным» агаром «сектором» или скошенный «шоколадный» агар. Микроскопия окрашенного мазка из колонии.

Третий день. Определение каталазной активности. Определение цитохромоксидазной активности. Посев на чашку для определения потребности в факторах X и V (или с тест-стрипами). Определение β-галактозидазной активности (предварительный учет). Определение чувствительности к ампициллину и другим антибактериальным препаратам на среде НТМ. Выявление β-лактамазы (тест с нитроцефином).

Четвертый день. Учет потребности в факторах X и V. Учет р-галактозидазной активности.

Учет результатов определения чувствительности на среде НТМ. Определение серотипа выделенной культуры Н. influenzae в реакции агглютинации (в соответствии с «Наставлением» по применению типовых антисывороток).

Ответ о наличии Н. influenzae или другого вида Haemophilus выдается при идентификации капсульного типа Н. influenzae с учетом результатов чувствительности к ампициллину и другим антибактериальным препаратам.

При необходимости биотипирования выделенного штамма производятся постановка пробы на индолообразование, определение наличия уреазы, определение наличия орнитиндекарбоксилазы..

Пятый день. Учет результатов биотипирования Н. influenzae.

3. Определение чувствительности к антибиотикам. Потенциальной активностью в отношении Н. influenzae обладают следующие антибиотики: аминопенициллины, ингибиторозащищенные пенициллины, цефалоспорины II—IV поколений, тетрациклины, фторхинолоны и др. В соответствии с международными и национальными рекомендациями, для выявления ампициллинорезистентности у гемофильной палочки в лабораторной практике достаточно определить чувствительность к ампициллину дискодиффузионным методом и провести тест на продукцию β-лактамаз с нитроцефином. Эти два теста позволяют подразделить штаммы Н. influenzae на ампициллиночувствительные, β-лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (чувствительные к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам II—IV поколений) и БЛНАР-штаммы, которые следует расценивать как резистентные к ингибиторозащищенным пенициллинам и некоторым цефалоспоринам.

По причине особой прихотливости патогенных гемофилов определение чувствительности к антибиотикам в нестандартных условиях может приводить к получению неточных результатов. В нашей стране определение чувствительности гемофилов к антибиотикам рекомендуется проводить дискодиффузионным методом с использованием стандартов Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США (NCCLS). Следует пользоваться только средой НТМ (Haemophilus Test Medium, англ.) — средой для тестирования гемофилов. Среда АГВ, применяемая в России для определения чувствительности к антибиотикам, с добавками и «шоколадно»-кровяной агар на основе АГВ для гемофилов непригодны. Для испытания используют суспензию суточной культуры, соответствующую стандарту мутности 0,5 но Мак-Фарланду (1,5x10,8 КОЕ/мл).

Чашки с посевами и нанесенными на них дисками с антибиотиками инкубируют в течение 16-18 ч при 35°С в атмосфере с 5-7% CO₂. Определяют чувствительность к ампициллину, амоксициллин/клавулонату, хлорамфениколу, тетрациклину, ципрофлоксацину или левофлоксацину, цефогаксиму или цефтриаксону, меропенему, ко-тримоксазолу, азитромицину.

Читайте также: