Фотохимия зрения. Родопсин и его распад под действием света
Обновлено: 18.05.2024
Процесс фоторецепции — восприятия света — происходит в высокоспециализированных зрительных клетках. Хотя строение этих клеток в глазах позвоночных и беспозвоночных животных отличается, молекулярная организация их основного светочувствительного элемента — фоторецепторной мембраны практически одинакова. Эта мембрана, как и любая другая биологическая мембрана, состоит из белка и липидов. Белок в фоторецепторной мембране окрашен и чувствителен к свету. Он был открыт в сетчатке глаза лягушки более ста лет назад и за свой цвет получил название «зрительный пурпур»; современное название «родопсин». Он замечателен во многих отношениях: родопсин — водонерастворимый мембранный, точнее трансмембранный, белок, классический хромопротеид, и что, пожалуй, важнее всего он светочувствителен. При поглощении света в нем совершается фотохимическая реакция.
Молекула родопсина состоит из большей белковой, бесцветной (для видимого света!) части и меньшей небелковой, окрашивающей, хромофорной. Химическая природа хромофора выяснена давно — это ретиналь, или альдегид витамина А. Первичная структура, полная аминокислотная последовательность белковой части установлена совсем недавно в лаборатории академика Ю. А. Овчинникова. Это крупное достижение советских ученых. Хромофорная (ретиналь) часть поглощает в молекуле родопсина квант видимого света. Можно сказать и по-другому: именно потому, что хромофорная группа родопсина поглощает свет, прошедший через оптические среды глаза, глаз видит свет. Не исключены ситуации, когда свет может быть не только «видимым», несущим зрительную информацию, но и опасным для глаза, повреждающим. В первую очередь страдают тогдародопсинсодержащие зрительные клетки сетчатки — палочки, подвержены фотоповреждению и колбочки.
В обоих случаях (зрительной информации и повреждения рецепторных клеток) ключевыми, определяющие ми являются фотохимические реакции, происходящие в хромофорной части молекулы — ретинале. Поэтому исследования механизма и кинетики фотопревращений ретиналя в молекуле зрительного пигмента — задача наиважнейшая как для понимания первичных фотохимических процессов зрения, так и для выяснения причин повреждающего действия света, для разработки на этой основе эффективных оптических и химических средств профилактики и защиты глаз от фотоповреждений. Для офтальмологии и гигиены зрения это сейчас крайне актуальная проблема. Глаз действительно «всевидящее око», и беречь его надо, как и полагается беречь «зеницу ока».
Новый, послевавиловский этап в понимании и исследовании проблемы «Глаз и Солнце» находится на стыке физикохимии и биологии. Современная химическая физика помогает еще глубже осознать неразрывную связь солнечного света и глаза. Замечательно, что сама химическая физика родилась в результате изучения фотохимической реакции. В ходе взаимодействия хлора с водородом наблюдалось образование не одной, а сотен тысяч или даже миллиона молекул хлористого водорода. В настоящее время эта первая цепная реакция, открытая немецким физикохимиком М. Боденштейном в 1913 г., записывается так:
Сl2 + свет —» Сl • + Сl •
Cl • +H2 —» HCl + Н • , и т. д.
Ее химический механизм был расшифрован в последующие годы. Обозначения хлора и водорода с точкой означают, что Cl • и Н • — это активные частицы, или свободные атомы. Сейчас твердо установлено, что большинство даже казавшихся весьма простыми химических, и естественно, фотохимических реакций, состоит из многих стадий с участием таких активных промежуточных частиц, как свободные атомы, свободные радикалы и возбужденные молекулы. Во многих биохимических и фотохимических реакциях также принимают участие свободные радикалы. В исследованиях, проводимых в Секторе кинетики химических и биологических процессов Института химической физики АН СССР в течение последнего десятилетия, показано, что свободнорадикальные процессы окисления играют ключевую роль в механизмах повреждающего действия света на структуры глаза. Поэтому необходимо коротко остановиться на современных представлениях химической физики о природе и свойствах свободных радикалов.
В процессе химического превращения происходит перестройка химических связей, замена одних связей другими. В фотохимической реакции хлора с водородом свет разрывает в молекуле хлора электронную пару, и получается два свободных атома, каждый, как говорят, с неспареннымэлектроном: Cl : Cl —»(свет) Cl • + Cl • . Частицы, обладающие неспаренными электронами, получили название свободных атомов, или свободных радикалов. Как правило, они не могут существовать долго, время их жизни — доли секунды. Они на языке химической кинетики обладают высокой реакционной способностью. Для их образования требуется затрата заметной энергии в несколько десятков килокалорий на один моль (Моль — единица количества вещества СИ. В 1 моле содержится 6,022•10 22 молекул или атомов (число Авогадро)).
При поглощении света молекула переходит в электронно-возбужденное состояние. При этом ее физические и химические свойства меняются, реакционная способность возрастает, становятся возможными такие реакции, которые в темноте вообще не идут.
С уменьшением длины волны энергия, заключенная в кванте, повышается. Квант ультрафиолетового излучения с большей вероятностью разорвет химическую связь, нежели квант видимого света. Поэтому ультрафиолет опасен для организма. Еще опаснее радиация, которая несет огромную энергию. В результате поглощения всего одного кванта ионизирующего излучения в клетке образуется лавина свободных радикалов.
Основная химическая характеристика фотохимической реакции — квантовый выход, т. е. число прореагировавших молекул, приходящихся на один поглощенный квант света. В случае фотохимического инициирования реакции хлора с водородом квантовый выход достигает огромной величины — 10 6 , что объясняется возникновением цепной реакции. В ходе такой реакции свободная валентность атома Сl • не исчезает, и процесс продолжается до тех пор, пока свободные атомы Сl • или Н • не иссякнут.
В ходе цепной реакции происходит регулярное чередование (повторение) нескольких одинаковых реакций. Поэтому столь высок квантовый выход цепного фотохимического процесса. На первый взгляд, в этой реакции нарушается один из основных законов фотохимии — принцип фотохимической эквивалентности А. Эйнштейна, согласно которому каждый поглощенный квант света в первичном акте способен активизировать только одну молекулу.
Однако столь высокий квантовый выход цепной фотохимической реакции на самом деле фундаментального закона природы не нарушает. Образование первичных активных центров (атомов хлора) при поглощении светового кванта происходит в полном соответствии с законом Эйнштейна. Поглощение одного кванта света в системе действительно сопровождается одной элементарной реакцией, но в результате этой фотохимической реакции (Сl : Сl + квант света = Сl • + Сl • ) образуются свободные атомы Сl • , которые порождают много последующих звеньев цепи, уже не требующих для своего осуществления затраты порций световой энергии. Таким образом, только кажущимся является исключение из одного из основных законов фотохимии, на которое обратил внимание Боденштейн, освещая обыкновенным солнечным светом смесь газообразного водорода Н2 и хлора Сl2. Он получал на выходе реакции на один поглощенный квант света сто тысяч молекул. Однако это кажущееся исключение из закона Эйнштейна дало начало новой теории в химии — теории цепных реакций.
Фотохимические реакции, идущие с участием свободных радикалов, не обязательно цепные. Большинство фотохимических и фотобиологических процессов идет с квантовым выходом, меньшим единицы. Это означает, что поглощение света не обязательно приводит к химическому превращению. Квантовый выход некоторых малоэффективных процессов в макромолекулярных биологических системах может составлять всего 10 -6 .
Разрыв одних и образование новых химических связей происходит не в любой химической реакции. Например, внутримолекулярная изомеризация не сопровождается разрывом связей. В ходе этой реакции в молекуле меняется только пространственное расположение атомов. Фотохимическая изомеризация известна для всех ненасыщенных, содержащих двойные связи соединений. Молекулы таких соединений могут находиться в нескольких геометрических конфигурациях.
Две изомерные формы молекулы ретиналя…
Ретиналь — хромофор в молекуле родопсина — как раз такая молекула; он с легкостью изомеризуется, Известно довольно много изомеров ретиналя, т. е. его различных геометрических конфигураций. И только одна из них, так называемый 11-цисизомер, способна соединяться с белковой частью родопсина. Поглотив квант света, изогнутая 11-цисформа ретиналя полностью выпрямляется — изомеризуется (Цис-трансизомерия (геометрическая изомерия) — один из видов пространственной изомерии химических соединений. Свойственна соединениям с двойными связями (С = С, C = N) или ароматическими циклами, исключающими свободное вращение находящихся при них заменителей), переходит в так называемую полностью трансизомерную форму.
Об особенностях этой первой и единственной фотохимической реакции в зрительном акте мы еще расскажем. Квантовый выход этой реакции высок, но меньше единицы. В ходе этой внутримолекулярной реакции изомеризации разрыва химической связи не происходит, свободных радикалов не образуется. Однако тот же самый ретиналь способен стать фотосенсибилизатором (Сенсибилизация — повышение чувствительности). В таком случае фотовозбужденный ретиналь передает свою энергию, например, белку и как бы запускает свободнорадикальную реакцию его окисления.
Эта реакция лежит в основе деструкции фоторецепторной мембраны. Поскольку фотохимическая реакция сенсибилизированного ретиналем окисления молекулярных компонентов фоторецепторной мембраны включает свободнорадикальные стадии, то возможен поиск фотопротекторов — эффективных средств для предотвращения или замедления этих патогенных для зрительной клетки процессов. Иными словами, химическая физика открывает перспективы борьбы с повреждающим действием света на зрение,
Следует отметить, что теоретические и экспериментальные исследования свободнорадикальных процессов окисления органических веществ в конденсированной фазе (жидкой, твердой) самым обстоятельным образом проводят также на сетчатке. Разработаны многочисленные способы управления такими процессами, их ускорения или торможения, вплоть до значительного или полного подавления окислительных превращений в тех случаях, когда они нежелательны, вредны или опасны.
Фотохимические реакции в сетчатке
При действии света на сетчатку происходят химические изменения пигментов, находящихся в наружных члениках палочек и колбочек. В результате фотохимической реакции возникает возбуждение фоторецепторов сетчатки .
В сетчатке глаз животных еще в конце 70-х годов прошлого столетия были открыты светочувствительные пигменты и было показано, что эти вещества выцветают на свету. В палочках сетчатки человека и многих животных содержится пигмент родопсин, или зрительный пурпур, состав, свойства и химические превращения которого подробно изучены в последние десятилетия (Уолд и др.). В колбочках птиц найден пигмент йодопсин. По-видимому, в колбочках имеются еще и другие светочувствительные пигменты. Раштон указывает на наличие в колбочках пигментов — хлоролаба и эритролаба; первый из них поглощает лучи, соответствующие зеленой, а второй — красной части спектра.
Родопсин представляет собой высокомолекулярное соединение, состоящее из ретинена — альдегида витамина А— и белка опсина. При действии света происходит цикл химических превращений этого вещества. Поглощая свет, ретинен переходит в свой геометрический изомер, характеризующийся тем, что его боковая цепь выпрямляется, что приводит к нарушению связи ретинена с белком. При этом вначале образуются некоторые промежуточные вещества — люмпродопсин и метародопсин, после чего ретинен отщепляется от опсина. Под влиянием фермента, названного редуктазой ретинена, последний переходит в витамин А, который поступает из наружных члеников палочек в клетки пигментного слоя.
При затемнении глаз происходит регенерация зрительного пурпура, т. е. ресинтез родопсина. Для этого процесса необходимо, чтобы сетчатка получала цис-изомер витамина А, из которого образуется ретинен. При отсутствии в организме витамина А образование родопсина резко нарушается, что и приводит к развитию упомянутой выше куриной слепоты. Образование ретинена из витамина А представляет собой окислительный процесс, происходящий при участии ферментной системы. В изолированной сетчатке млекопитающих животных, в которой нарушены окислительные процессы, не происходит восстановления родопсина.
Фотохимические процессы в сетчатке происходят весьма экономно, т. е. при действии даже очень яркого света расщепляется только небольшая часть имеющегося в палочках родопсина. Так, по данным Уолда, при действии света интенсивностью 100 люкс через 5 секунд расщепляется в каждой палочке всего 1200 молекул зрительного пурпура из имеющихся в ней 18 млн. молекул этого вещества, т. е. распадается около 0,005% родопсина.
Поглощение света родопсином и его расщепление различны в зависимости от длины волны световых лучей, действующих на него. Родопсин, экстрагированный из сетчатки глаза человека, обнаруживает максимальное поглощение под влиянием световых лучей с длиной волны около 500 мм к, которые лежат в зеленой части спектра. Именно эти лучи кажутся наиболее яркими в темноте. Сравнение кривой поглощения и обесцвечивания родопсина при действии света разной длины волны с кривой субъективной оценки яркости света в темноте обнаруживает полное их совпадение ( рис. 215 ).
Если обработать сетчатку раствором квасцов, т. е. фиксировать её, то это предохраняет родопсин от дальнейшего распада и на сетчатке можно увидеть изображение предмета, на который перед этим смотре,л глаз (так называемую оптограмму).
Структура йодопсина близка к родопсину. Йодопсин представлш собой также соединение ретинена с белком опсином, который образует в колбочках и отличается от опсина палочек. Поглощение света родопсином и йодопсином различно. Йодопсин в наибольшей степени поглащает лучи света с длиной волны около 560 ммк, лежащие в желтой час спектра.
Рис. 215. Сравнение чувствительности глаза человека, находящегося в темноте, со спектром поглощения зрительного пурпура. Точками отмечена чувствительность.
Фотохимические процессы в сетчатке глаза
В рецепторных клетках сетчатки - светочувствительные пигменты (сложные белковые вещества) - хромопротеиды, которые обесцвечиваются на свету.
В палочках на мембране наружных сегментов содержится родопсин, в колбочках - йодопсин.
Различаются тем, что максимум поглощения находится в различных областях спектра:
- палочки - в области 500 нм;
- колбочки (3 вида, т.к. 3 типа зрительных пигментов) - в синей части спектра (430-470 нм); в зеленой (500-530 мн); в красной (620-750 мн).
Фотохимические процессы в сетчатке протекают весьма экономно.
Даже при действии яркого света расщепляется только небольшая часть имеющегося в палочках родопсина (около 0,006%).
В темноте - ресинтез пигментов (с поглащением энергии). Восстановление йодопсина в 530 раз быстрее, чем родопсина.
При постоянном и равномерном освещении - равновесие между скоростью распада и ресинтеза пигментов.
Когда кол-во света ¯ - динамическое равновесие нарушается и сдвигается в сторону более высоких концентраций пигмента à феномен темновой адаптации.
Куриная слепота - нарушение сумеречного зрения (в организме мало витамина А à процесс ресинтеза родопсина ослабевает).
Особое значение в фотохимических процессах имеет пигментный слой сетчатки, который образован эпителием, содержащим фусцин.
Этот пигмент поглощает свет, препятствуя отражению и рассеиванию его à четкость зрительного восприятия.
Отростки пигментных клеток окружают светочувствительные членики палочек и колбочек, принимая участие в обмене веществ фоторецепторов и в синтезе зрительных пигментов.
Фотохимические процессы в фоторецепторах глаза + действие света à рецепторный потенциал (гиперполяризация мембраны рецептора).
РП à активация др. рецепторов à деполяризация их мембран.
Амплитуда зрительного рецепторного потенциала увеличивается при увеличении интенсивности светового стимула (т.е. амплитуда зависит от воспринимаемого цвета, т.к. RGB - отличаются по длине волны = интенсивности (пр: R - в центре сетчатки; B - на периферии)).
Синаптические окончания фоторецепторов конвергируют (сходятся) на биполярные нейроны сетчатки. При этом фоторецепторы центральной ямки связаны только с одним биполяром.
45. Механизм аккомодации. Возрастные изменения аккомодации.
Аккомодация глаза — способность ясно видеть предметы, находящиеся на различных расстояниях от глаза. Физиологический механизм аккомодации глаза состоит в том, что при сокращении волокон цилиарной мышцы глаза происходит расслабление цинновой связки, при помощи которой хрусталик прикреплен к цилиарному телу (см. Глаз). При этом уменьшается натяжение сумки хрусталика, и он благодаря эластическим свойствам становится более выпуклым. Расслабление цилиарной мышцы ведет к уплощению хрусталика. На рис. 1 показана схема аккомодации глаза (сплошная линия — положение хрусталика в состоянии покоя, пунктирная — при аккомодации). Иннервация цилиарной мышцы осуществляется глазодвигательным и симпатическим нервами.
Аккомодация глаза возможна в пределах, ограниченных ближайшей и дальнейшей точками ясного зрения. Первая определяется наименьшим расстоянием, на котором возможно читать мелкий шрифт; вторая — наибольшим расстоянием, на котором ясно различим предмет при отсутствии аккомодации глаза. Положение дальнейшей точки ясного зрения зависит от рефракции глаза (см.). Увеличение преломляющей силы оптической системы глаза, достигаемое при максимальном напряжении аккомодации глаза, называют объемом, или силой, аккомодацией глаза.Объем аккомодации глаза изменяется с возрастом вследствие уменьшения эластичности хрусталика.
К патологическим изменениям относят спазм, паралич и парез аккомодации глаза. Спазм возникает обычно у молодых людей при длительном напряжении аккомодации глаза, травме, действии на глаз очень яркого света. Спазм аккомодации глаза проявляется близорукостью. Параличи и парезы аккомодации глаза могут быть центрального происхождения и обусловливаться инфекциями и интоксикациями. Периферические параличи аккомодации глаза наблюдают при ушибах глаза, приеме внутрь препаратов атропина, при закапывании в конъюнктивальный мешок средств, расширяющих зрачок. Паралич аккомодации глаза характеризуется невозможностью различать мелкий шрифт на близком расстоянии. Для лечения спазма и паралича аккомодации глаза больные подлежат направлению к врачу -окулисту.
46. Механизм рефракции. Аномалии рефракции.
Рефракция глаза (позднелат. refractio преломление) — преломляющая сила оптической системы глаза, выраженная в диоптриях.
Рефракция глаза как физическое явление определяется радиусом кривизны каждой преломляющей среды глаза, показателями преломления сред и расстоянием между их поверхностями, т.е. обусловлена анатомическими особенностями глаза. Однако в клинике имеет значение не абсолютная сила оптического (светопреломляющего) аппарата глаза, а ее соотношение с длиной переднезадней оси глаза, т.е. положение заднего главного фокуса (точка пересечения лучей, проходящих через оптическую систему глаза, параллельно его оптической оси) по отношению к сетчатке — клиническая рефракция.
При соответствии преломляющей силы глаза и длины его оси параллельные лучи света после преломления в глазу соединяются в фокусе на сетчатке. Такая клиническая рефракция называется эмметропия или соразмерная рефракция.
При миопии главный фокус оптической системы глаза располагается впереди сетчатки. Миопия имеет три степени: слабую - до-3 дпр, среднюю до -6, высокую - более -6дптр. Прогрессирующая миопия, достигающая высоких степеней -30 - злокачественная. Коррекция миопии осуществляется рассеивающими линзами.
Родопсин
Родопси́н (от др.-греч. ρόδον — др.-греч. όπσις — зрение; иногда в качестве синонима используют устаревшее название — зри́тельный пу́рпур) — группа зрительных пигментов, несколько различных по строению у разных видов животных (см. опсины). Содержится в палочках сетчатки глаза морских беспозвоночных, рыб, почти всех наземных позвоночных и человека. Относится к сложным белкам -
Содержание
История открытия и исследований родопсина
В 1876 году Франц Болл (Franz Boll, 1876) из Римского университета выделил фоточувствительный пигмент из палочки сетчатки лягушки. Он обнаружил, что сетчатка лягушки чувствительна к свету, и после освещения меняет свою окраску на жёлтую, с последующим обесцвечиванием. Болл также продемонстрировал, что после некоторого времени пребывания в темноте сетчатка животных приобретает изначальную яркую окраску.
Вилли Кюхне (Willy Kühne), физиолог из Германии, продолживший работы Франца Болла, определил, что пигмент, отвечающий за окраску сетчатки — это белок наружных сегментов палочек (НСП), и назвал его «зрительным пурпуром» (родопсином). Кюхне выделил родопсин из клеток пигментного эпителия сетчатки, сравнил спектроскопические свойства этого белка и препарата сетчатки. Он постулировал, что жёлтый и бесцветный продукты, образующиеся под действием света, химически различны, и заключил, что генерация сетчаткой электрических импульсов является следствием реакции на свет.
Функции родопсина
Под действием света светочувствительный зрительный пигмент изменяется и один из промежуточных продуктов его превращения непосредственно ответствен за возникновение зрительного возбуждения. Зрительные пигменты, содержащиеся в наружном сегменте фоторецепторной клетки, представляют собой сложные окрашенные белки (хромопротеиды). Та их часть, которая поглощает видимый свет, и называется хромофором. Это химическое соединение — альдегид витамина А, или ретиналь. Белок зрительных пигментов, с которыми связан ретиналь, называется опсином.
При поглощении кванта света (фотона) хромофорная группа белка ( зрительного нерва происходит при фоторецепторе. Впоследствии родопсин восстанавливается (регенерирует) в результате синтеза 11-цис-ретиналя и сетчатки.
Родопсин относится к суперсемейству трансмембранных рецепторов глутамата, и в биполярной нервной клетке, которая «растормаживается», возникают нервные импульсы.
Спектр поглощения родопсина
Рис. 1. Спектры поглощения Родопсина
Специфический спектр поглощения зрительного пигмента определяется как свойствами [1] ). Этот спектр имеет два максимума — один в ультрафиолетовой области (278 нм.), обусловленный опсином, и другой — в видимой области (около 500 нм.), - поглощение хромофора рис. 1. Превращение при действии света зрительного пигмента до конечного стабильного продукта состоит из ряда очень быстрых промежуточных стадий. Исследуя спектры поглощения промежуточных продуктов в экстрактах родопсина при низких температурах, при которых эти продукты стабильны, удалось подробно описать весь процесс обесцвечивания зрительного пигмента [2] .
На Рис.1, кривая 1, паказан спектр поглощения родопсина, содержащий три основные полосы:
Полосы α — (500 нм) и β — (350 нм) относятся к области поглощения хромоформной группы. Полоса γ — (280 нм) — относится к группе поглощения ароматических аминокислот белка — триптофана, тирозина и фенилаланина. Так α-полоса в спектре поглощения родопсина расположена на графике кривой палочкового сумеречного видения (зрения) с предельной величиной в зоне лучей сине-зелёной области спектра (т.е. 500нм). Это благодаря высокой фоточувствительности родопсина (ответная реакции выхода сигнала происходит при воздействии квантового фотосигнала величиной в 0,67). [3]
На Рис. 1 показаны спектры поглощения родопсина лягушки Rana temporaria в дигитониновом экстракте. Видны два максимума поглощения в видимой (500 нм.) и ультрафиолетовой (280 нм.) области. График 1 — родопсин (восстановленный пигмент); 2 — индикатор жёлтый (обесцвеченный пигмент). По оси абсцисс — длина волны (λ); по оси ординат — оптическая плотность (D).
В хрусталике глаза и тканях сетчатки существует пигмент типа меланина, анологичный тому, что содержится в коже. Он имеет желтоватый или коричневый оттенок и служит для того, чтобы предотвратить попадание определённой части световой энергии, в особенности коротковолновой энергии, на сетчатку. При этом он является светофильтром отсекающим губительную для тканей и рецепторов УФ область спектра [4] . [5] . Поэтому, при достаточном для различения цветов уровне освещения, максимум чувствительности палочки (в которой содержится родопсин) находится не в ультрафиолетовой, а в синей части спектра.
В живом глазу наряду с разложением зрительного пигмента, естественно, постоянно идёт процесс его регенерации (ресинтеза). При темновой адаптации этот процесс заканчивается только тогда, когда весь свободный опсин соединился с ретиналем. [6]
Дневное и ночное зрение
Из спектров поглощения родопсина видно, что восстановленный родопсин (при слабом «сумеречном» освещении) отвечает за ночное зрение, а при дневном «цветовом зрении» (ярком освещении) разлагается и максимум его чувствительности смещается в синюю область. Это наглядно показывает известный Эффект Пуркинье. [7] . При достаточном освещении палочка работает совместно с колбочкой, являясь приёмником синей области спектра. [8] . Полное восстановление родопсина у человека (в темноте или при слабом освещении) занимает около 30 минут; в течении всего этого периода чувствительность нашего «сумеречного зрения» постепенно увеличивается, достигая максимума.
Фотохимия зрения. Родопсин и его распад под действием света
В основе механизмов зрения лежит первичная фотохимическая реакция цис-транс-изомеризации ретиналя— «распрямление» сопряженной углеводородной цепи хромофора. Дис-гранс-изомеризация ретиналя протекает по одноквантовому (одноударному) механизму. Фотофизические процессы в ретинале, предшествующие фотохимической реакции, изучались многими авторами. Поглощение света ретиналем обусловлено скорее всего а не -переходом. Так, было показано, что константы скорости образования водородной связи альдегидной группы ретиналя с кислородом не различаются в основном и возбужденном состоянии (данные флеш-фотолиза). Иными словами, распределение электронной плотности у атома кислорода в основном и возбужденном состоянии одинаково, чего не было бы при передаче несвязывающего -электрона кислорода на делокализованную -орбиту. Об этом свидетельствуют также высокие значения коэффициента экстинкции 1 цис-ретиналя (около 104), что характерно для -поглощения.
В противоположность фотосинтезу фотофизическая стадия зрительной рецепции не включает процессов межпигментной миграции энергии, т. е. поглощенная ретиналем энергия не делокализуется в пределах палочки. Это следует из проявления дихроизма родопсина палочек в режиме интенсивного фотовыцветания при облучении поляризованным светом и высоких значений степени поляризации флуоресценции замороженных спиртовых растворов родственного ретиналю витамина Однако в пределах одной макромолекулы липохромопротеида имеет место миграция энергии от опсина к ретиналю с изомеризацией последнего. Квантовый выход изомеризации для составляет всего 0,26 (для видимой области спектра 0,66). Это указывает на низкую эффективность миграции энергии между ароматическими аминокислотами опсина и ретиналем, которая, по данным Эбрей, не превышает 12%.
Таким образом, все фотофизические и фотохимические события, лежащие в основе механизмов зрения, строго локализованы в месте поглощения кванта света.
Высказывается предположение, что первичная
С помощью флеш-фотолиза показано также, что вероятность синглет-триплетной интеркомбинационной конверсии ретиналя составляет 60% от общей вероятности дезактивации синглетного возбужденного состояния. Это удовлетворительно согласуется с величиной квантового выхода фотоизомеризации ретиналя как в свободном состоянии, так и в составе родопсина. Однако предположению о триплетной природе реакции фото-изомеризацни ретиналя противоречат данные, полученные в лаборатории Ламолы: с помощью пикосекундной спектроскопии удалось оценить время цис-транс-превращения ретиналя (около 6 нс), которое оказалось слишком коротким по сравнению со временем жизни триплетных состояний.
Остановимся более подробно на квантовых выходах фотоизомеризации ретиналя. Квантовый выход превращения 11-цис—полностью транс-форма свободного ретиналя в гексановых растворах, по данным Уолда, сильно зависит от температуры. При температуре 25° С квантовый выход (при равен 0,2, в то время как при Последняя величина совпадает с усредненным для трех длин волн видимого света (450, 500, 550 нм) значением квантового выхода изомеризации хромофора родопсина в дигитониновом растворе при 20° С. Это совпадение скорее всего означает, что свойства
микроокружения хромофора, входящего в состав родопсина, и замороженной гексановой матрицы сходны. Еще более высокое значение квантового выхода обесцвечивания различных зрительных пигментов получены Дартнеллем и Кропфом — 0,67. Наконец, по данным Рипса и Уила, квантовый выход фотолиза родопсина в живом глазу человека близок к единице. Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что реальные значения квантового выхода цис-транс-фотоизомеризации ретиналя в родопсине чрезвычайно высоки и приближаются к единице.
Рис. 26. Спектральные изменения, сопутствующие фотолизу родопсина (Wald G., Brown P., 1958) Освещение проводилось при затем образец постепенно нагревался в темноте
Интересные данные о фотолизе родопсина в дигитониновых экстрактах получены М. А.
Островским с сотр. Оказалось, что квантовый выход реакции имел высокие значения (близкие к единице) и практически не зависел от температуры в интервале 20-5 °С.
Уменьшение температуры ниже —10°С сопровождалось резким (приблизительно в 100 раз) падением квантового выхода. Для интервала — квантовый выход также не зависел от температуры. Такая аномальная температурная зависимость указывает на важную роль структурного состояния околохромофорного окружения в определении эффективности фотохимической реакции. Скачкообразный харяктер падения квантового выхода может быть обусловлен кооперативной структурной перестройкой, например, в липидной фазе мембраны.
Итак, фотохимическая дезактивация возбужденной молекулы ретиналя, заключающаяся в ее цис-транс-изо-меризации, переходе 11-цисполностью транс-изомеры, осуществляется, по-видимому, через триплетное состояние. Между первичной фотохимической реакцией и гидролизом родопсина с образованием свободного ретиналя протекает ряд промежуточных темновых реакций. Эти реакции детально изучены в экспериментах с использованием импульсной спектрофотометрии и стабилизации промежуточных продуктов в определенных температурных интервалах (рис. 26). Тем не менее вопрос о количестве и последовательности образования промежуточных продуктов еще далек от окончательного разрешения. Ниже приводится одна из наиболее общепринятых схем превращения родопсина — модифицированная схема Уолда:
Первый продукт, возникающий из родопсина, — прелюмиродопсин. По сравнению с родопсином прелюмиродопсин обладает более длинноволновой полосой поглощения и более высокими значениями молярной экстинкции (максимум спектра поглощения при Прелюмиродопсин стабилен при температуре —195° С. Реакция родопсин — прелюмиродопсин очень быстрая и фотообратимая.
Обнаружен также альтернативный продукт гипсородопсин, возникающий из родопсина при температуре жидкого гелия в ходе облучения светом с длиной волны больше чем Этот продукт превращается в прелюмиродопсин или термально (выше -250°С), или фотохимически при облучении светом с
До последнего времени считалось, что именно на стадии родопсин—прелюмиродопсин и происходит изомеризация ретиналя из 11-цис- в полностью транс-форму. Однако результаты прямых измерений продолжительности этой реакции и кинетики процесса поставили под сомнение это уже установившееся положение, поскольку столь высокие скорости несвойственны реакции цыс-транс-изомеризации. Предполагается, что на данной стадии за счет вступления метального Н-атома при в водородную связь с азотом близлежащего имидазольного кольца и перевода азота Шиффовой связи в состав энеаминной -группы происходит нарушение планарности структуры ретиналя с образованием термодинамически неустойчивой структуры. Согласно другой точке зрения, причиной образования структуры, предрасположенной к трансформации, является разделение зарядов — перенос электрона от белка к ретиналю с образованием анион-радикала. Образование же транс-формы ретиналя происходит на последующих стадиях процесса, которые протекают в темноте и контролируются температурой. В ходе последовательных превращений спектры поглощения и люминесценции продуктов постепенно сдвигаются в коротковолновую сторону. Эти сдвиги обусловлены не химической модификацией ретиналя, а структурными перестройками в липохромопротеиде.
При увеличении температуры свыше —140° С прелюмиродопсин спонтанно превращается в люмнродопсин, имеющий максимум поглощения при 497, а флуоресценции — при Время полупревращения
этой реакции составляет Реакция характеризуется следующими активационными параметрами: ккал/моль и кал/моль град. Дальнейшее нагревание до —40° С сопровождается образованием метародопсина I (максимум спектра поглощения при 480, флуоресценции При комнатной температуре метародопсин образуется примерно за
Кинетика превращения люмиродопсин метародопсин I описывается на начальных стадиях уравнением реакции второго, а на конечных первого порядка. Это позволило Абрахамсону рассмотреть данную реакцию как энзиматический процесс, протекающий через образование опсин-субстратного комплекса: где образование бимолекулярная, а его распад — мономолекулярная реакция. При этом Абрахамсон предполагает, что люмнродопсин гетерогенен и состоит из трех форм: Каждая из форм люмиродопсина превращается в свою форму метародопсина I с различными константами скоростей перехода:
Процесс характеризуется высокими значениями энтропии кал/моль-град) и энтальпии моль) активации.
Следующий продукт — метародопсин II — возникает из метародопсина I при температуре, превышающей —15° С (максимум спектра поглощения при 380, флуоресценции — На этой стадии происходят наиболее существенные изменения конформации зрительного пигмента, о чем свидетельствуют следующие факты:
1) значительный батохромный сдвиг (почти
2) возникновение чувствительности к борогидриду натрия, атакующему альдиминную связ, что указывает на переход альдиминной группировки из гидрофобной в гидрофильную область; 3) экспонирование двух-трех сульфгидрильных групп в молекуле опсина; 4) высокие значения энтальпии ккал/моль) и энтропии кал/моль-град) активации, приближающиеся к термодинамическим параметрам денатурации белков.
Показано также, что эффективность превращения метародопсин зависит от белок-липидных взаимодействий. Так, в озвученной суспензии мембран дисков быка процесс протекает при 39° С по кинетике реакции первого порядка с а в дигитониновых экстрактах — по сложной кинетике, которую можно представить как наложение нескольких процессов, описываемых кинетикой реакций первого порядка. Наиболее быстрый компонент имеет
Все стадии от образования прелюмиродопсина до иозникновения метародопсина II легко обратимы в темноте: обратные реакции инициируются понижением температуры.
Кроме метародопсина II в результате темнового превращения зрительного пигмента образуются метародопсин III, или парародопсин/ (максимум спектра поглощения при 465 нм), две формы УУ-ретинилиденопсина с максимумами спектров поглощения при соответственно, опсин и свободный полностью транс-ретиналь. Эти финальные стадии превращения родопсина еще недостаточно изучены. Показано только, что в молекуле хромопротеида на стадии превращения метародопсина I в метародопсин II экспонируется еще одна сульфгид-рильная группа, а на стадии метародопсин -рети-нилиденопсин происходит экспонирование Шиффовой связи. До сих пор дискутируется вопрос о том, можно ли включать метародопсин III и в общую цепь превращений или они являются лишь ее ответвлениями. Не вызывает, однако, сомнения тот факт, что конечные продукты фотолиза зрительного пигмента, ответственные за все дальнейшие события, — это свободный транс-ретиналь и опсин.
Известно, что в наружных сегментах палочек содержится специальный фермент — ретинолдегидрогеназа, который превращает ретиналь в ретинол (витамин
Характеризуя процесс в целом, следует подчеркнуть, что в интервале физиологических температур все промежуточные реакции протекают чрезвычайно быстро Например, по данным флеш-фотолиза, время образования и жизни прелюмиродопсина с соответственно, а время полупревращения метародопсин -метародопсин II составляет около
Таким образом, природа вторичных темновых реакций в комплексе опсин — липид—ретиналь, вызываемых первичной цис-транс-фотоизомеризацией ретиналя, сводится к цепи последовательных конформационных перестроек, приводящих к изменению микроокружения хромофора, и заканчивается его отрывом от белка. Чрезвычайно существенно, что рассмотренная последовательность превращений зрительного пигмента характерна не только для дигитониновых экстрактов, но и для суспензии
наружных сегментов, изолированной сетчатки и даже глазного бокала.
Перейдем теперь к рассмотрению механизмов регенерации зрительного пигмента из продуктов фотолиза. Различают фотохимическую и биохимическую регенерации. Фотохимическая регенерация, заключающаяся в образовании родопсина при поглощении света продуктами фотолиза, описана для прелюмиродопсина, люмиродопсина, метародопсина I и метародопсина II. На стадиях прелюмиродопсина и люмиродопсина, которые не сопровождаются существенными конформационными перестройками опсина, фоторегенерация происходит сравнительно легко. Однако конверсия метародопсина I в родопсин заметно контролируется температурой: процесс идет при —20° С, но резко замедляется при —65 и —195° С. Более того, в результате регенерации образуется не исходный продукт родопсин, а две его изохромные формы. При близких спектральных свойствах эти формы родопсина обладают различной температурной стабильностью.
Биохимическая регенерация родопсина изучена слабо. Совершенно очевидно, что для такой регенерации необходимо, по крайней мере, восстановление исходной конформации опсина, окисление ретинола до ретиналя и реизомеризация транс-ретиналя в -цмс-форму. После полного выцветания зрительного пигмента в сетчатке глаза животных накапливается свободный ретинол в виде эфира жирной кислоты. В опытах с гомогенатами обесцвеченной сетчатки глаза лягушки, крысы и быка было обнаружено, что весь транс-ретинол постепенно превращается в -цмс-форму. Это превращение осуществляется с помощью специального фермента опсин-ретинальизомеразы. Обнаруженная в сетчатке глаза лягушки и быка опсинретинальизомераза не способна катализировать изомеризацию транс-ретинола. Поэтому допускается, что стадии изомеризации предшествует окисление ретинола до ретиналя, которое осуществляется с помощью ретинолдегидрогеназы. Предполагается также, что реизомеризация ретиналя может активироваться светом. Заключительный этап ресинтеза — присоединение -мс-ретиналя к опсину — представляет собой спонтанную реакцию, протекающую при
Читайте также: