FISH метод анализа хромосом клеток

Обновлено: 28.11.2022

Данная статья описывает исследование преимплантационных эмбрионов с помощью FISH-метода (fluorescent in situ hybridization) у супружеских пар, проходящих лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Суть исследования

Проводили определение пола у 360 эмбрионов, полученных у 42 супружеских пар в 60 циклах стимуляции суперовуляции в программе ЭКО. После биопсии и фиксации бластомеров пригодным к проведению диагностики оказалось 281 ядро, из них 217 (77,2%) не несли хромосомной патологии. 104 ядра содержали женский набор хромосом, 113 -мужской. В 64 ядрах (22,8%) были выявлены различные виды анеуплоидии гоносом. Дальнейшее развитие эмбрионов после проведения биопсии бластомера наблюдалось в 79%.

В 10 циклах стимуляции из 60 перенос не производился в связи с отсутствием эмбрионов нужного пола. Беременность наступила в 17 циклах (28% на цикл стимуляции и 34% на перенос эмбрионов). Из 13 клинически подтвержденных беременностей 4 прервались в 1-ом триместре, 1 -во 2-ом. 8 беременностей закончились рождением 10 (2 двойни) здоровых детей желаемого пола.

Из 64 ядер, содержащих хромосомную патологию, 19 (29,7%) имели моносомию X-хромосомы, 8 (12,5%) - моносомию Y-хромосомы. Трисомия была отмечена в 28 случаях (43,8%), полисомия в 8 (12,5%). Таким образом, полученные данные показали, что моносомия и трисомия являются наиболее частой хромосомной патологией гоносом.

Преимплантационная генетическая диагностика (ПД) возникла более 40 лет назад. Впервые R.Edwards и R.Gardner применили ее в 1967 г. для определения пола эмбрионов кролика. Уже тогда возникла идея использования данной технологии у человека для предотвращения передачи наследственных заболеваний от родителей детям. Однако такая возможность появилась только спустя 20 лет, когда в начале 90-х годов была разработана техника полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей выявлять мутации в единичных клетках [2]. Впервые ПЦР для проведения ПД в клинической практике применили A.Handyside и соавторы в 1990 г., выявив специфические последовательности для Y-хромосомы при определении пола эмбрионов у супружеских пар с X-сцепленными заболеваниями. С развитием науки от проведения ПЦР постепенно стали отказываться в пользу другого метода — флюоресцентной (нерадиоактивной) гибридизации in situ (FISH). Преимущество данного метода состояло в возможности одновременного определения как X-, так и Y-хромосомы. Кроме того, стало возможным определять не только пол эмбрионов, но и выявлять анеуплоидии половых хромосом (гоносом).

Молекулярно-цитогенетическое исследование FISH

На современном этапе развития медицины для определения пола преимплантационных эмбрионов используют молекулярно-цитогенетический метод FISH. Данный метод имеет ряд преимуществ перед другими способами молекулярной гибридизации: для генетического исследования методом FISH не требуется получения большого количества биологического материала, выделения ДНК из клеток, а также использования радиоизотопа P32. С помощью этого метода можно анализировать хромосомы на всех стадиях клеточного цикла, в том числе в интерфазе. Его принцип основан на специфической гибридизации определенных участков хромосом с флюоресцентно-меченными зондами. Метод позволяет определить структурные перестройки хромосом и выявить число их копий в интерфазных ядрах по флюоресценции зондов.

ПД молекулярно-цитогенетическим FISH-методом с определением пола, выявлением анеуплоидии и различных транслокаций в эмбрионах занимает большую часть от общего числа проводимой диагностики в рамках программ ВРТ. В большинстве клиник основными показаниями для определения пола эмбрионов являются: наличие рецессивного Х-сцепленного заболевания, наличие делеций в Y хромосоме, а также желание родителей.

Исследуя пол у эмбрионов, все авторы отметили у них высокий уровень анеуплоидии гоносом и мозаицизм. По данным разных авторов, клеточный мозаицизм у преимплантационных эмбрионов может наблюдаться до 50% случаев. Эти исследования подтвердили, что высокая доля хромосомных нарушений, выявленная у эмбрионов, не связана с недостатками методики FISH, а соответствует истинному кариотипу исследуемых клеток. Полученные результаты указывают на то, что при проведении преимплантационной генетической диагностики супружеским парам с целью определения пола эмбрионов необходимо одновременно исследовать их на наиболее распространенные трисомии.

Цель исследования

Определение пола эмбрионов и выявление патологии в комплексе гоносом.

Материалы и методы

В отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия НЦ АГиП им.академика В.И.Кулакова были проанализированы результаты проведения преимплантационной генетической диагностики (ПГД) с определением пола эмбрионов 42 супружеских пар по желанию пациентов. На момент исследования 2 пары были фертильны, остальные проходили лечение по программе ЭКО и ПЭ в связи с первичным или вторичным бесплодием. Средний возраст пациенток составил 32 года (от 23 до 43 лет). Исследование эмбрионов проводили с помощью FISH-метода.

Определение пола эмбриона проводили на ядрах бластомеров. Биопсия бластомера осуществлялась с помощью микроманипулятора. Для получения биологического материала прежде всего проводили пенетрацию наружной оболочки эмбриона (zona pellucida) до размера, достаточного для аспирации бластомера аспирационной микроиглой (20-40 мкм). Вскрытие zona pellucida осуществляли с помощью лазерного луча. Бластомер, содержащий четко видимое ядро, аспирировали в просвет микроиглы, соединенной с микрошприцем (50-100 мкл). Биопсированный бластомер помещали на предметное стекло, фиксировали и выполняли процесс гибридизации ДНК хромосом, содержащихся в ядре, и ДНК-зонда. Использовали зонды к X- и Y- хромосомам (фирма ABBOTT). Готовый препарат анализировали с помощью люминесцентного микроскопа (фирма Zeiss), при использовании которого каждая хромосома имеет свой, отличный от других, цвет свечения.

Результаты

Всего в 60 циклах стимуляции суперовуляции у 42 женщин было получено 520 ооцитов, после оплодотворения которых развился 371 эмбрион (71,3%). Биопсия бластомеров была проведена у 360 эмбрионов (11 эмбрионов были разрушены в ходе биопсии).

При исследовании 281 ядра, принадлежащего одноядерным бластомерам, нормальный набор по изучаемым хромосомам был определен в 217 из 281, что составило 77,2%, а в 64 отмечали различные типы анеуплоидии (22,8%). Женский набор хромосом был определен в 104 наблюдениях, мужской - в 113.

Среди выявленной патологии по изучаемым хромосомам наибольшая доля принадлежала моносомии X-хромосомы -29,7% (в 19 наблюдениях из 64). Моносомия Y-хромосомы была отмечена в 8 случаях (12,5%). Таким образом, общий уровень моносомии составил 42,2% (в 27 случаях из 64). Трисомия гоносом среди случаев выявленной анеуплоидии была отмечена в 28 наблюдениях, что составило 43,8%. Полисомия гоносом составила 12,5% (в 8 наблюдениях из 64).

После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие среди пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 79% случаев. Из 60 случаев проведенной диагностики отмена переноса в связи с отсутствием нужного пола была в 10 случаях. Всего беременность наступила в 17 проведенных циклах, что составило 28% на цикл стимуляции и 34% на перенос эмбрионов. Из 13 клинических беременностей 4 остановились в развитии в 1-ом триместре беременности, 1 прервалась во 2-ом. 8 беременностей завершились родами, родилось 10 здоровых детей нужного пола (в 2-х случаях -двойни).

Выводы

Полученные нами данные показали, что проведение ПГД FISH-методом может успешно использоваться с целью определения пола эмбрионов и дальнейшего переноса в полость матки эмбриона желаемого пола. Кроме того, определение пола FISH-методом позволяет выявить патологию гоносом, что предотвращает перенос эмбриона с хромосомной патологией в полость матки пациентки, раннюю гибель эмбриона или рождение больного ребенка. Однако, учитывая наличие мозаицизма в эмбрионе, даже после проведения ПГД рекомендована пренатальная диагностика для исключения рождения ребенка с хромосомными нарушениями.

FISH метод анализа хромосом клеток

Идентификация маркерной хромосомы методом FISH - молекулярно-генетическое исследование, проводимое для идентификации хромосомного материала неизвестного происхождения, выявленного по результатам стандартного кариотипирования.

Синонимы английские

Marker Chromosome Identification Using FISH.

Метод исследования

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с зондами, специфичными центромерному району хромосомы X (DXZ1).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Весь наследственный материал, содержащийся в организме человека, кодируется с помощью последовательности нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК. Каждая из цепочек ДНК состоит из 3 миллиардов пар нуклеотидов, поэтому, чтобы вместить такой большой объем генетической информации в ядро клетки, молекулы ДНК компактно упаковываются в специальные структуры - хромосомы. Набор всех хромосом клетки называется кариотипом. Нормальный кариотип человека представлен 23 парами хромосом, из которых 22 пары одинаковы у мужчин и женщин (такие хромосомы называются аутосомами), а одна пара - ХХ у женщин и XY у мужчин - определяет пол и называется, соответственно, половыми хромосомами. Под воздействием различных факторов в геноме могут возникать мутации - устойчивые, передаваемые по наследству изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, которые на хромосомном уровне организации генетической информации могут выражаться в изменении числа хромосом, а также в нарушении их структуры.

Стандартным методом исследования хромосом человека является кариотипирование. В процессе данного анализа выделенные из клеток хромосомы сравнивают со специальными хромосомными картами, а диагностическое заключение содержит информацию об их количестве, строении и структуре. В результате структурных внутрихромосомных и межхромосомных перестроек при кариотипировании могут быть обнаружены так называемые маркерные хромосомы. Это любой хромосомный материал неизвестного происхождения. В зависимости от генетической информации, которая содержится в маркерной хромосоме, её наличие может не сопровождаться формированием каких-либо патологических состояний, а может приводить к заболеваниям. В связи с этим при обнаружении маркерной хромосомы чрезвычайно важно произвести её идентификацию. Одним из диагностических методов, которые позволяют идентифицировать маркерные хромосомы, является FISH.

FISH - флюоресцентнаяin-situ гибридизация - метод молекулярно-генетического исследования, который позволяет обнаружить в генетическом материале определенную последовательность ДНК. Для выполнения анализа необходимы так называемые зонды - искусственно синтезированные короткие участки ДНК, меченные флюоресцирующим веществом. Каждый зонд может связываться исключительно с определенной последовательностью нуклеотидов на исследуемой ДНК. Существуют зонды для дифференциальной окраски разных хромосом, которые и применяются для идентификации неизвестных хромосомных фрагментов. В процессе анализа к исследуемому генетическому материалу, полученному из лейкоцитов крови, добавляют зонд. Гибридизация, то есть связывание зондов с исследуемой ДНК происходит при определенной температуре в течение нескольких часов. После этого образец промывают специальным раствором, чтобы удалить несвязавшиеся зонды. Результат гибридизации врач оценивает с помощью флюоресцентного микроскопа, который позволяет увидеть свечение, испускаемое присоединившимися к нативной ДНК зондами. Для идентификации маркерной хромосомы, как правило, требуется постановка реакции с несколькими зондами.

Для чего используется исследование?

  • Идентификация маркерной хромосомы необходима для оценки её потенциального влияния на развитие генетически обусловленных заболеваний, а также течение беременности и развитие плода, так как структурные аномалии таких хромосом могут приводить к нарушениям передачи генетической информации при делении клеток и, следовательно, формированию половых клеток с хромосомным дисбалансом.

Когда назначается исследование?

  • При обнаружении по результатам стандартного кариотипирования маркерной хромосомы.

Что означают результаты?

Результат исследования содержит информацию о соответствии хромосомного фрагмента определенному участку одной или нескольких нормальных хромосом.

Что может влиять на результат?

Нарушения в проведении отдельных этапов исследования, опыт и квалификация врача молекулярно-генетической диагностики .

Важные замечания

  • При обнаружении маркерной хромосомы у плода целесообразно проводить стандартное кариотипирование родителей, а также сиблингов (братьев и сестер) для установления её происхождения (унаследованная или возникшая вновь мутация) и роли в возникновении наследственных заболеваний.
  • Интерпретация полученных результатов должна проводиться исключительно врачом, обладающим достаточной квалификацией в области медицинской генетики или репродуктологии.

Кто назначает исследование?

Литература

Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 23e by Richard A. McPherson MD MSc (Author), Matthew R. Pincus MD PhD (Author). St. Louis, Missouri : Elsevier, 2016. Pages 1337-1343.

Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. - T. I / Под ред. В. В. Долгова, В. В. Меньшикова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. С. 705-715.

Современный метод цитогенетического анализа, позволяющий определять качественные и количественные изменения хромосом (в том числе транслокации и микроделеции) и используемый для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.

Синонимы русские

Флуоресцентная гибридизация in situ

Синонимы английские

Fluorescence in-situ hybridization

Флуоресцентная гибридизация in situ.

Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.

Подготовки не требуется.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH, от англ. fluorescence in-situ hybridization) - это один из самых современных методов диагностики хромосомных аномалий. Он основан на использовании ДНК-проб, меченных флуоресцентной меткой. ДНК-пробы представляют собой специально синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. Таким образом, ДНК-пробы различаются по составу: для определения разных хромосомных аномалий используются разные, специфические ДНК-пробы. ДНК-пробы также различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие - к конкретному локусу.

В ходе процесса гибридизации при наличии в исследуемом образце аберрантных хромосом происходит их связывание с ДНК-пробой, которое при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как флуоресцентный сигнал (положительный результат FISH-теста). При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-пробы в ходе реакции "отмываются", что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест - это не только качественный, но и количественный метод.

FISH-тест обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами цитогенетики. В первую очередь, исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам. Это основное преимущество FISH по сравнению с классическими способами кариотипирования (например, окрашиванием хромосом по Романовскому-Гимзе), которые применяются только к метафазным ядрам. Благодаря этому исследование FISH является более точным методом для определения хромосомных аномалий в тканях с низкой пролиферативной активностью, в том числе в солидных опухолях.

Так как в FISH-тесте используется стабильная ДНК интерфазных ядер, для исследования могут быть использованы самые различные биоматериалы - аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, мазки, аспираты костного мозга, биоптаты и, что немаловажно, сохраненные фрагменты ткани, например гистологические блоки. Так, например, FISH-тест может быть с успехом выполнен на повторных препаратах, полученных из гистологического блока биоптата молочной железы при подтверждении диагноза "аденокарцинома молочной железы" и необходимости определения HER2/neu-статуса опухоли. Следует особо подчеркнуть, что в данный момент исследование FISH рекомендовано в качестве подтверждающего теста при получении неопределенного результата иммуногистохимического исследования опухоли на онкомаркер HER2/neu(ИГХ 2+).

Другим преимуществом FISH является его способность определять микроделеции, которые не выявляются с помощью классического кариотипирования или ПЦР. Это имеет особое значение при подозрении на синдром Ди Джорджи и велокардиофациальный синдром.

FISH-тест широко используется в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний, в первую очередь в онкогематологии. Хромосомные аномалии в сочетании с клинической картиной и данными иммуногистохимического исследования являются основой классификации, определения тактики лечения и прогноза лимфо- и миелопролиферативнх заболеваний. Классическими примерами являются хронический миелолейкоз - t (9;22), острый промиелоцитарный лейкоз - t (15;17), хронический лимфолейкоз - трисомия 12 и другие. Что касается солидных опухолей, наиболее часто FISH-исследование применяется при диагностике рака молочной железы, мочевого пузыря, толстой кишки, нейробластомы, ретинобластомы и других.

Исследование FISH также может быть использовано в пренатальной и преимплантационной диагностике.

FISH-тест часто проводят в сочетании с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Результат этого исследования оценивают в комплексе с результатами дополнительных лабораторных и инструментальных данных.

Хромосомный микроматричный анализ

Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) является сложной молекулярной технологией, позволяющей провести полногеномную амплификацию с последующим анализом множества отдельных фрагментов генома с применением специально подготовленной микроматрицы. Благодаря этому можно изучить всю структуру генома в одном исследовании.

Матрицы, используемые для хромосомного микроматричного анализа, в том числе опухоли, содержат до 2,7 млн. специфических олигонуклеотидов. Благодаря этому получают информацию о наличии генетического материала в аналогичном количестве точек генома. За счет высокой плотности маркеров можно определить минимальные потери/увеличение генетического материала всех регионов генома.


Возможности хромосомного микроматричного анализа

  • анеуплоидий;
  • триплоидий;
  • полиплоидий;
  • микродупликаций;
  • микроделеций;
  • несбалансированных транслокаций;
  • потерю участков гетерозиготности;
  • однородительских дисомий.

ХМА позволяет подтвердить или исключить синдромы: Патау (трисомия 13), Эдвардса (трисомия 18), Дауна (трисомия 21).

Этапы Хромосомного микроматричного анализа

  • Анеуплоидии
  • Триплоидии и полиплоидии
  • Микроделеции/микродупликации
  • Несбалансированные транслокации
  • Потеря участков гетерозиготности, однородительские дисомии
  • Сбалансированные хромосомные перестройки (транслокации, инверсии)
  • Точковые мутации
  • Болезни экспансии тринуклеотидных повторов
  • Низкоуровневый мозаицизм
  • Микроделеции/микродупликации, размер которых меньше разрешающей способности микроматрицы

Хромосомный микроматричный анализ расширенный

Расширенный хромосомный микроматричный анализ выполняется на микроматрице высокой плотности (HD) которая содержит 2,67 млн. отдельных маркеров с высокой плотностью покрывающих весь геном. Разрешающая способность расширенного ХМА от 50 000 п.н. (в отдельных регионах от 10 000 п.н.)

При выполнении этого анализа все участки хромосом исследуются с максимальной точностью. Анализ позволяет установить все мельчайшие структурные нарушения в геноме как среди участков с известной клинической значимостью, так и среди других участков генома, для которых патогенные изменения ранее не были описаны. Это позволяет диагностировать не только все известные микроделеционные синдромы и синдромы связанные с аутосомно-доминантными заболеваниями (в случае делеции генов), но и ранее не описанные или очень редко встречающиеся изменения структуры хромосом.

Анализ позволят установить причину хромосомной патологии в случае недифферинцированных синдромов у детей с аутизмом, задержкой психомоторного развития, малыми аномалиями развития, множественными врожденными пороками развития.

При выполнении исследования могут быть выявлены патогенные делеции (исчезновение участков хромосом), дупликации (появление дополнительных копий генетического материала), участки с потерей гетерозиготности, которые имеют важное значение при болезнях импринтинга, близкородственных браках, аутосомно-рецессивных заболеваниях.

При наличии специфического фенотипа расширенный ХМА может быть информативен и при аутосомно-рецессивных заболеваниях (в случаях делеций генов или экзонов генов, ассоциированных с такими заболеваниями). В некоторых случаях, по результатам расширенного ХМА может быть рекомендовано обследование родителей.

Хромосомный микроматричный анализ стандартный

Стандартный хромосомный микроматричный анализ проводится на микроматрице средней плотности которая содержит 750 тыс. маркеров с высокой плотностью покрывающих все клинически значимые участки генома.

Разрешающая способность стандартного ХМА от 200 000 п.н. (в отдельных регионах от 50 000 п.н.)

При выполнении этого анализа с максимальной точностью исследуются все клинически значимые участки генома. Анализ позволяет установить нарушения в генах с известной клинической значимостью. Это позволяет диагностировать все известные микроделеционные синдромы и синдромы связанные с аутосомно-доминантными заболеваниями (в случае делеции генов).

В некоторых случаях, по результатам стандартного ХМА может быть рекомендовано обследование родителей.

Стандартный хромосомный микроматричный анализ позволяет определить хромосомную патологию в пренатальном периоде. Метод эффективно определяет как анеуплоидии, так и патогенные микроделеции/микродупликации у плода. Для исследования необходимо небольшое количества амниотической жидкости или ворсин хориона, получаемых при инвазивной процедуре. Метод полностью заменяет кариотип и дает возможность определить контаминацию образца материнским материалом, что исключает риск ложноотрицательных результатов.

Хромосомный микроматричный анализ таргетный

Таргетный хромосомный микроматричный анализ выполняется на микроматрицах имеющих 350 тыс маркеров сосредоточенных в основных клинически значимых участках генома. Разрешающая способность таргетного ХМА от 1 000 000 п.н. (в отдельных регионах от 200 000 п.н.)

Этот анализ рекомендуется для диагностики специфических синдромов, когда необходимо их лабораторное подтверждение.

Таргетный хромосомный микроматричный анализ является информативным для выявления причин потери беременности (замершая беременность, спонтанные аборты, прерывание беременности по медицинским показаниям). При этом могут быть выявлены анеуплоидии, структурные перестройки от 1 000 000 п.н., триплоидии. Таргетный ХМА позволяет определить происхождение дополнительного набора хромосом при триплоидиях и дифференцировать доброкачественную дигиническую триплоидию от частичного пузырного заноса. Таргетный ХМА, также, позволяет диагностировать полный пузырный занос.

Хромосомный микроматричный анализ в диагностике опухоли

Исследование опухолевых клеток с помощью ХМА проводится с применением матрицы FFPE OncoScan. Хромосомный микроматричный анализ в сфере исследования опухолей позволяет сделать полногеномное исследование числа копий с детекцией участков с потерей гетерозиготности LOH, с улучшенным разрешением по 900 опухолевым генам, определить статус часто исследуемых соматических мутаций. Все эти данные можно получить на материале одной пробы.

Хромосомный микроматричный анализ в отношении опухоли может использоваться у больных миелодиспластическим синдромом при нормальном кариотипе. ХМА обнаруживает достаточно мелкие изменения, которые, однако, позволяют определять прогноз и тактику лечения пациентов.

Хромосомный микроматричный анализ в диагностике опухоли считается более чувствительным в сравнении с исследованием кариотипа. Он помогает идентифицировать изменения, которые не выявляются при помощи кариотипирования и FISH-анализа.

Хромосомный микроматричный анализ в сфере исследования опухолей позволяет обнаружить свыше 900 онкогенов и 80 соматических мутаций, провести анализ числа копий генов и участков с потерей гетерозиготности. Результаты готовы через 48 ч.

Исследование хромосом методом FISH

FISH - один из удивительнейших «инструментов» молекулярной биологии XXI века. В преимплантационной диагностике исследовательская техника FISH применяется для выявления хромосомных аномалий или нарушений парности хромосом в клетках эмбриона, только что полученного методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Если аномалий или признаков анеуплоидии (нарушения парности, нехватки хромосомных пар) не обнаружено, то «искусственный» эмбрион признается жизнеспособным. Его можно имплантировать в матку будущей матери.

FISH позволяет также проследить половые признаки в наборе хромосом эмбриона. Это дает возможность определить пол будущего ребенка еще до фактического наступления беременности (если считать ее началом имплантацию внетелесно зачатого эмбриона в матку).

Что такое FISH?

Аббревиатура расшифровывается так: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, или флюоресцирующая гибридизация in-situ. Расшифровка, скорей всего, ничего не говорит несведущему читателю. Поэтому разберем сложное понятие по частям, оставив недопереведенное «in-situ» напоследок.

Гибридизация

В молекулярной биологии у этого термина совершенно особое значение, не имеющее ничего общего со скрещиванием видов в «обычной» биологии.

Гибридизация - это молекулярно-генетический прием, применяемый для оценки состояния ДНК и РНК исследуемых клеток. Он основан на соединении отдельных цепочек нуклеиновых кислот в единую молекулу. Таким образом проверяется комплементарность (взаимное соответствие) молекул или их фрагментов друг другу. При полной комплементарности цепочки легко и быстро объединяются в общую молекулу. Медленное объединение говорит о недостаточной комплементарности. Некомплементарность цепочек как раз и обусловлена хромосомными аномалиями (нарушениями порядка расположения хромосом на тех или иных участках), непарностью хромосом или отсутствием некоторых пар.

«Инструментом» для измерения комплементарности является температура, при которой цепочки ДНК гибридизируются в общую молекулу. Для этого требуется сначала нагреть препарат нуклеиновой кислоты, а затем, смешав его с другим нагретым препаратом, охладить. При нагреве водородные связи между цепочками ДНК или РНК исчезают, образуются одноцепочечные фрагменты молекул. Смешанные препараты двух ДНК или РНК (или ДНК - РНК) охлаждаются. При охлаждении водородные связи между комплементарными основаниями быстро восстанавливаются, образуется единая, гибридная молекула ДНК (РНК или ДНК - РНК). При недостатке комплементарности процесс идет дольше, некомплементарные фрагменты остаются неприсоединенными. Следовательно, чем выше температура гибридизации, тем гармоничней и правильней хромосомные строения клеток. Чем ниже температура, тем больше аномалий в хромосомах. На основе анализа некомплементарных остатков можно установить конкретные аномалии или участки анеуплоидии.

Флюоресцентная маркировка

Для анализа комплементарности гибридизирующей молекулы ДНК (или РНК) применяются особые генетические зонды (или ДНК-зонды), которые, конечно же, тоже имеют мало общего со своими «тезками», используемыми, например, в хирургии.

Генетические зонды это синтезированные и специально помеченные одноцепочечные ДНК (реже РНК) с заранее установленными свойствами комплементарности. При гибридизации они сливаются с определенными генетическими фрагментами, подтверждая таким образом их комплементарность. Расположение зондов в гибридизированной молекуле свидетельствует о нормальном или дефектном строении первоначального хромосомного материала, из которого собрано это «искусственное сооружение».

Генетические зонды помечают, в частности, светящимися (флюоресцирующими) веществами, что делает их заметными под объективом специального флюоресцентного микроскопа.

Применение различных красителей для нескольких зондов позволяет производить одновременный анализ различных генетических структур, например, выявлять участки хромосом с двумя наложенными друг на друга генами и прочие аномалии.

В настоящее время при проведении единого анализа генетические зонды метят пятью-шестью различными красителями, иногда даже семью.

In-situ значит «у себя дома»

Первоначальная техника гибридизации была громоздкой. Извлеченные ДНК денатурировались в особых термобуферах, смешивались в центрифуге с другими денатурированными фрагментами. Гибридизация также проводилась лабораторно, «в химической посуде».

Современная техника позволяет проводить анализы in-situ, то есть «на месте», «у себя дома», в первоначальных генетических структурах, а не в лабораторно изготовленных препаратах. Объектами исследования стали сами ядра клеток (извлеченных при биопсии полярных телец, бластомеров, поверхностных клеток бластоцисты).

Наблюдение за генетическим материалом прямо в ядрах клеток ускоряет процесс, делает его более «чистым», свободным от внешних влияний и повреждений, которые не исключены при изготовлении лабораторных препаратов.

Существуют, однако, и проблемы, указывающие на непреодолимые границы данного метода. Единой гибридизацией невозможно «охватить» весь набор хромосом в клетках. Необходимы обычно две-три последовательные гибридизации, позволяющие исследовать 12-15 хромосомных пар (а их у человека 23). Способность к дальнейшей гибридизации у цепочек ДНК после каждой их регибридизации постепенно снижается. Это не позволяет проводить гибридизацию «сколько угодно раз», для исчерпывающего анализа одного и того же генетического материала.

Читайте также: