Достоверность метода разведения красителя. Недостатки метода разведения индикатора

Обновлено: 21.09.2024

Существуют две модификации метода серийных разведений - определения чувствительности на жидком и густом питательных средах. Метод дает возможность определить МПК препарата для выделенного штамма возбудителя.

Среду предварительно разливают в пробирки по 2 мл. В первую добавляют 2 мл раствора антибиотика определенной концентрации, перемешивают и переносят к следующей пробирке, продолжая разведение к предпоследней, из которой удаляют 2 мл смеси. Последняя пробирка служит контролем роста культуры. В том же бульйони, который используют для разведения антибиотиков, готовят суспензию суточной агаровой или бульйоннои культуры бактерий из расчета 105-106 микробных тел в 1 мл в зависимости от вида возбудителя. Потом к каждой пробирке с разведениями, а также к контрольной добавляют по 0,2 мл изготовленной суспензии. При определении чувствительности к пеницилинив пеницилиназоутворюючих стафилококков рекомендуют использовать одновременно большую и малую микробную нагрузку (100, 100000 и выше микробных тел в 1 мл). В зависимости от величины посевной дозы значения МПК препарата может колебаться: при увеличении дозы чувствительность снижается за счет роста количества пеницилинази, что образуется в среде.

Последняя пробирка, в которой наблюдают задержку роста культуры (прозрачный бульйон), отвечает МПК (минимальной подавляющей концентрации) или МБсК (минимальной бактериостатическойконцентрации) препарата относительно данного микроба и указывает на степень его чувствительности.

Если признаки роста появляются во всех пробирках, исследуемый штамм резистентный к максимальной концентрации препарата, которая была взята в опыт. Отсутствие роста бактерий во всех пробирках, кроме контрольной, свидетельствует, что МПК препарата ниже, чем и, что используется в опыте.

Для определения бактерицидного эффекта антибиотика из нескольких последних пробирок, в которых нет признаков роста, делают висел на секторы агара в чашках Петри.

Через 24-48 год инкубации при оптимальной температуре отмечают ту наименьшую концентрацию препарата в пробирке, занял из которой

За МПК (минимальную подавляющую концентрацию) антибиотика для данного штамма принимают ту, при которой отсутствуют признаки роста колоний на поверхности агара (или вместо бляшки есть рост одиночных колоний).

Из двух способов определения антибиотикочутливости микробов до антибиотиков (разведений в густой и жидкой средах) точнее является метод серийных разведений в жидкой среде. Результаты, которые получают с помощью разведений в агаре, менее постоянны. Метод не следует применять при оценке чувствительности тех микробов, которые дают тонкий, разрежен рост на поверхности чашки (стрептококки, пневмококки) или, напротив, имеют тенденцию к ползучему росту (протей).

Недостатком методов серийных разведений является их высокая трудоємнисть, что ограничивает использование в обычных бактериологических лабораториях. С целью упрощение было предложено модификацию метода с заменой ряда из 10 пробирок, которые содержат разные количества препарата, тремя концентрациями антибиотика. Первая из них отвечает максимальной, что находится в крови при введении терапевтических доз, вторая - уровню, который наблюдается через Т1/2 (время снижения концентрации антибиотика на 50 %). Третья является минимальной, то есть той, которая равняется МПК для высокочувствительных штаммов. В соответствии с использованными концентрациями антибиотиков исследуемые штаммы можно отнести за уровнем чувствительности до трех основных групп: резистентные (МПК для которых превышает значение максимальной концентрации антибиотика в крови), умеренно чувствительные (значения МПК приближаются к максимальной или средней концентрации) и высокочувствительные (чувствительность которых к антибиотику находится на уровне минимальной концентрации, которая используется в опыте). Такими концентрациями при определении чувствительности к бензилпеницилину является соответственно 0,05-0,2, 0,5 и 2,0 ОД/МЛ, к макролидам - 0,1, 0,5-1,0 и 4,0 мкг/мл, к аминогликозидив - 0,5-1,0, 6,0-8,0 и 15,0-20,0 мкг/мл.

• определение изменений ферментативнои активности микроорганизмов под воздействием антибиотиков;

• определение цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно восстановительного потенциала во время роста бактерий в питательной среде;

• цитологичну оценку изменений морфологии бактериальных клеток под воздействием антибиотиков.

К первой группе принадлежит метод Роджерса, ориентированный на способность антибиотиков подавлять ферментативну активность чувствительных микроорганизмов, которая сопровождается изменением цвета соответствующего индикатора. Суть его заключается в дифференцированном изменении красного цвета фенолового красного на желтый или фиолетовый в зависимости от чувствительности исследуемого штамма. В случае чувствительности к действию антибиотика не происходит разложение глюкозы при культивировании в среде, которое содержит ее и определены концентрации препарата. При этом среда окрашивается в фиолетовый цвет в результате сдвига рН в щелочную сторону. Изменение красного цвета на желтый свидетельствует о расщеплении глюкозы с образованием кислоты в результате роста штамма, резистентного к действию антибиотика. Если к среде прибавить 0,25 % дрожжевого экстракта, результаты могут быть учтенными уже через 2-2,5 год от начала исследования.

Следующая группа методов регистрирует изменения окислительно восстановительного потенциала среды в процессе роста микроорганизмов, о чем свидетельствует изменение цвета резазурина,1,3,5-трифенилтетразолия хлорида, 2,6-дихлорфенолиндофенола и других, которые добавляются к среде. Этот метод технически простой, а результаты получают через 2-6 год. Принцип его сводится к тому, который растоплен и охлажден до 50 °С агар засевают исследуемой культурой бактерий из расчета 200 млн. микробных тел, а на поверхность налагают диски с антибиотиками. Чашки инкубируют при оптимальной температуре в течение 3-5 год, потом обрабатывают индикатором и повторно инкубируют при 37 °С в течение 20-30 хв. Результаты учитывают за изменением цвета вокруг дисков с антибиотиками. Если используют 1 % раствор 1,3,5-трифенилтетразолия хлорида, участка агара с бактериальным ростом в результате образования формазану приобретают красный цвет, а зоны притеснения роста вокруг дисков остаются бесцветными.

Судить о степени чувствительности микробов к антибиотикам можно с такой же точностью, как и с помощью стандартного метода дисков, однако время исследования уменьшается до 3-5 год.

Образование инволюционных форм бактерий под воздействием антибиотиков исследуют под фазово-контрастным или антоптральним микроскопом в специальных микрокапсулах. Они образуются в результате действия бактериостатичних концентраций препарата. Под воздействием суббактериостатичних концентраций, а также при резистентности исследуемого штамма на поверхности агара вырастают нормальные микроколонии.

Метод может быть применен для определения чувствительности штаммов кишечной палочки, стафилококков, холерных вибрионов. Полученные даны в большинстве случаев совпадают с теми, которые дают классические методы.

За последние годы разработаны многочисленные модификации метода серийных разведений в питательных бульйонах. В частности, экспресс-методы с титрованием антибиотика в объеме 0,25 мл.

Выпускаются коммерческие наборы длительного хранения, которые состоят из планшетов из лиофильно высушенными разведениями антибиотика, куда вносится по 0,1 мл суспензии чистой культуры микроорганизмов. Результаты определения антибиотикочутливости можно оценивать визуально (при наличии в среде индикатора) или с помощью спектрофотометров, когда регистрируется изменение оптической плотности среды.

Однако при пользовании такими автоматизированными системами частота выявления резистентных штаммов может быть снижена в результате медленного роста устойчивых вариантов. В большинстве подобных систем результаты учитывают путем сравнения роста (или гибели) бактериальных клеток в присутствии антибиотиков с контролем, где есть только микробы. При этих условиях достаточно трудно дифференцировать клетки, которые погибают, от тех, что медленно размножаются.

К другим факторам, которые влияют на результаты, принадлежит действие субингибиторних концентраций препаратов на ультраструктуру бактериальных клеток. Они приводят к изменению формы, набухания клеток, которое может сопровождаться изменением оптической плотности суспензии и искажением результатов. В свою очередь, это дает неправильную информацию о чувствительности возбудителей.

Таким образом, применение любого метода позволяет определить антибиотикограму возбудителя - спектр его чувствительности и антибиотикостийкости.

Все методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам имеют свои преимущества и свои недостатки. Потому постоянный контроль за объективностью результатов и соблюдением правил проведения исследований способствуют получению достоверных данных.

В большинстве случаев результаты определения антибиотикоустойчивости in vitro совпадают с клиническими последствиями антибиотикотерапии. Случаи разногласия объясняются рядом причин, среди которых чаще всего встречается ошибочная трактовка полученных лабораторных данных.

Причиной таких ситуаций может быть использование при посеве не чистой культуры бактерий, а патологического материала. Потому определяется не чувствительность инфекционного агента, а микробной ассоциации, в том числе и сапрофитной флоры. Ошибки встречаются при исследовании содержания двенадцатиперстной кишки, фекалиий, харкотиння, выделений из ран, мочи и тому подобное.

Плазмиды делают бактерии нечувствительными к подавляющему большинству антибиотиков, которые используются в клиниках, поскольку кодируют синтез ферментов, которые разрушают препараты. Одним из наиболее исследованных ферментов является бета-лактамаза, которая разрушает антибиотики, которые принадлежат к группе бета-лактамив. Разработано несколько методических приемов, которые позволяют быстро определить ее активность. Один из них заключается в том, что на фильтровальную бумагу размером 2х2 см, который находится в чашке Петри, капают одну каплю 2 % водного раствора крахмала. Потом на эту бумагу наносят петлей агаровую культуру микробов и растирают ее, формируя бляшку диаметром до 5 мм. На ее поверхность наносят рабочий йодный раствор пенициллина.

Учет результатов проводят через 10 минут инкубации системы при комнатной температуре. При наличии бета-лактамазы на темно-синем фоне наблюдается ярко выраженная четкая зона просветления вокруг бляшки, которая содержит агаровую культуру микробов. При негативном результате зона просветления отсутствует, а края бляшки нечетки.

Достоверность метода разведения красителя. Недостатки метода разведения индикатора

Кардиология:

Индикаторы для оценки гемодинамики. Свойства индикаторов для метода разведения

В качестве индикаторов используются вещества, физические свойства которых позволяют определить и измерять их концентрацию в крови. К ним относятся вещества, меняющие оптическую плотность крови, радиоактивные изотопы, растворы электролитов, увеличивающие электропроводность крови. Некоторые вещества (водород и аскорбат) влияют на потенциал полярографического электрода. В качестве индикаторов используются также охлажденные или нагретые растворы, которые могут быть определены в крови по изменениям ее температуры.
Таким образом, индикатором может служить любое вещество, которое изменяет физические или химические свойства потока крови.

Существуют две группы индикаторов: жидкие и газовые. Жидкие вводятся прямо в сосудистую систему, газовые попадают в кровь, диффундируя в легких или после растворения в жидкостях. Используя опыт многих лабораторий и клиник, изучавших аспекты применения индикаторов и собственные наблюдения, Fox и Wood сформировали основные требования, предъявляемые к веществу-индикатору (Fox, 1962; Wood, 1959, 1962). Внутрисосудистые индикаторы должны быть нетоксичными, позволять стерилизацию, быть пригодными для инъекций в небольшом количестве, не обладать фармакологическим действием (угнетать дыхание, вызывать сосудистые реакции, тахикардию, брадикардию и т. д.), не влиять на обмен веществ, не приводить к потере крови за счет образования комплексных соединений типа: белок крови + молекула индикатора.

В большинстве случаев лучше всего использовать индикатор, покидающий после первой циркуляции кровяное русло. При этом не возникает накапливания его в крови, препятствующего повторным измерениям.

Таким свойством обладают газовые индикаторы. Они во многом схожи с жидкими, отличаясь лишь способом и путями введения в организм и выхода из него. Так как основной путь проникновения их в кровь — легкие, к ним предъявляется дополнительное требование: газ должен легко диффундировать через альвеолярные мембраны.

Одним из первых индикаторов, применявшихся в клиниках, была голубая Эванса. Еще в 1943 г. Ramson исследовал влияние инъекций этого красителя на человека. Было установлено, что краска не токсична в дозах, требующихся для изучения, стабильна в водных растворах и крови. Эти свойства позволили использовать ее при изучении параметров кровообращения как в эксперименте, так и в клинических условиях. Однако голубая Эванса обладает существенными недостатками.

Она очень медленно покидает кровь. Connolly и Wood находили ее в плазме даже спустя 100 дней после инъекции (Connolly und Wood, 1954). Такое явление может симулировать цианоз. Медленное выделение краски сочетается с плохим поглощением ею света, что заставляет применять большие дозы. Поэтому повторные исследования на протяжении одного эксперимента нежелательны. После введения в кровь молекула краски сразу соединяется с альбуминами плазмы.

Несколько позже стали применять индикаторы с поглощением в инфракрасной части спектра. Первым и наиболее распространенным индикатором до настоящего времени является краска — зеленый индоцианид. Она отвечает почти всем требованиям, однако быстро разрушается в водных растворах.

Денситометры для метода разведения. Оборудование для оценки гемодинамики индикаторами

Miller с соавт. показали на большом клиническом материале возможность использования этого красителя для количественных определений нарушений гемодинамики (Miller et all., 1957).
Метод индикаторных растворов по своей сути включает в себя, с одной стороны, индикаторное вещество, с другой — прибор, определяющий и регистрирующий его концентрацию в крови. Основные требования к идеальному регистрирующему устройству определены в работах Fox, который считает, что, помимо высокой чувствительности и стабильности, большое значение имеет хорошая динамическая характеристика системы.

На качество кривой разведения в значительной степени влияют гидравлические и колориметрические характеристики записывающей системы, длина зонда, внутренний диаметр его, скорость кровотока через систему, динамическая чувствительность преобразователя и записывающего устройства, а также скорость введения и забора проб крови.

В настоящее время используются в основном два типа регистраторов, двухцветные и одноцветные (фотометры и денситометры). К первым относятся оксиметры самых различных конструкций: кюветные, проточные, ушные. Благодаря простоте в употреблении и стабильности в работе оксиметры нашли широкое применение в клинических условиях.

Применив оксиметр с голубой Эванса, Nicholson показал возможность использования метода разведения индикатора для диагностики внутрисердечных шунтов (Nicholson et all., 1951).
В лабораторных условиях больше работают с денситометрами. Особенностью их является чрезвычайно высокая чувствительность, в том числе и к неспецифическим изменениям в оптической плотности крови. Благодаря отличным динамическим характеристикам эти приборы предпочитают любым другим.

Всего несколько лет назад появились фотометры, работающие в отраженном свете, в которых использовано свойство фибергласо-вого волокна. На их базе Моок создал чувствительный элемент фотометра для катетерных оксиметров (Моок с соавт., 1961). Принцип работы прибора — свет определенного участка спектра попадает по волокну в кровь, а по другим волокнам отраженный луч, несущий информацию о содержании кислорода или индикатора, поступает к фотоэлементу. Система оксиметр — катетер практически безинерционна.

К жидким индикаторам относится гипертонический раствор поваренной соли, применение которого основано на изменении электропроводности крови. Однако в настоящее время этот метод не применяется и представляет чисто исторический интерес.

В связи с разработкой микродатчиков температуры, обладающих большой разрешающей способностью и хорошей динамической характеристикой, стал широко применяться метод, предложенный в 1954 г., мечения крови растворами пониженной или повышенной температуры. Описан ряд способов определения, локализации и вычисления величины внутрисердечных шунтов при помощи метода термодиллюции.

Метод разведения индикатора. Метод разведения красителей

Метод разведения индикатора. В основе определения минутного объема кровообращения методом разведения индикатора лежит стандартное уравнение концентрации для движущейся жидкости. Согласно уравнению V—1/Ct объем движущейся жидкости (V) определяется отношением количества введенного вещества (I) к средней его концентрации (С) за время прохождения через систему (I).

В качестве индикаторов использовались разнообразные красители: Эванса голубой, индигокармин, бенгальский розовый, кардиогрин и др., а также гипертонический раствор поваренной соли, дехолин, радиоактивный альбумин и эритроциты, радиоактивный криптон, плазма крови (исследовалось разведение гематокрита), «холод» и «тепло» и др.

Метод разведения красителей. Применяемые красители должны удовлетворять ряду требований: быть нетоксичными, пригодными для внутривенного введения, не покидать быстро кровяное русло, концентрация их должна легко определяться в плазме и цельной крови. Таким требованиям удовлетворяет краситель Эванса голубой, T-I824.

Максимальная длина волны поглощения краски равна 620 ммкм, что приближается к длине волны поглощения оксигемоглобипа и цельной крови. Поэтому изменение насыщения крови кислородом может влиять на форму кривой разведения, приводя к ошибкам определения. Предупреждению этого способствует создание постоянного высокого насыщения крови путем дыхания чистым 02 во время записи кривой разведения. Указанным недостатком не обладают зеленые красители — кардиогрин и другие, имеющие точку максимального поглощения около 800 ммкм.

В этом участке спектра светопоглощение Hb и НbO2 одинаково более низкое. Это позволяет использовать для исследования меньшее количество краски, избежать погрешностей, связанных с изменением насыщения крови О2.

Кривая разведения красителя регистрируется в виде крутого подъема и несколько более пологого понижения. Па понижающейся части кривой обычно наблюдается повторное повышение концентрации— так называемая волна рециркуляции. Волна рециркуляции обусловлена повторным попаданием в кровоток частиц краски, прошедших по системам с быстрым кругооборотом, прежде всего по коронарным сосудам. Этот нежелательный эффект корригируется при обработке кривой разведения методом экстраполяции.

При регистрации кривой с помощью ушного оксиметра ее калибровка производится путем забора пробы крови через 3—5 мин, когда концентрация краски станет постоянной. Количественное содержание красителя в плазме анализируется на спектрофотометре. Для расчета минутного объема кровообращения по кривой разведения производится перенесение ее на полулогарифмический масштаб.

Формула определения минутного объема кровообращения: Q=I*60/Ct, где Q — минутный объем кровообращения (л/мин), I — количество введенной краски (мг), 60— количество секунд в минуту, t — время первого пассажа краски (с), С — средняя концентрация краски во время первого пассажа (мг/л).

Время первого пассажа краски рассчитывается от начала регистрации кривой разведения до точки пересечения экстраполированной нисходящей части кривой с нулевой линией. Средняя концентрация краски равна сумме концентраций за каждую секунду, деленной на число секунд, в пределах построенной на полулогарифмической бумаге кривой разведения. Для расчета может быть использован планиметрический способ.

Если калибровка кривой производилась на основании концентрации краски в плазме, то установленный минутный объем будет представлять минутный объем плазмы. Минутный объем крови тогда определяется по формуле: МОК = минутный объем плазмы * 100 / (100-гематокрит).

Метод разведения красителя

Метод разведения красителя [81едтаП С.; 1897, НатгпНоп XV. и соавт., 1923,1932,1948] основан на внутривенном введении красителя и регистрации в артериальной крови изменения его концентрации во времени.

Для определения сердечного выброса чаще применяют такие красители, как Т-1824 (Эванс синий), метиленовый синий или кардиогрин.

В силу ряда причин в настоящее время красители не находят широкого применения в практике отделений реанимации и интенсивной терапии. Прежде всего они непригодны для частых и многократных измерений. Кроме того, общепринятая методика регистрации кривой первого прохождения индикатора с помощью ушного датчика неприменима в условиях спазма периферических сосудов, который очень часто имеет место у пациентов, находящихся в критических состояниях. Повторные исследования с использованием Т-1824 влияют на показатель насыщения гемоглобина крови кислородом. В редких случаях встречаются публикации с использованием кардиогрина с оценкой его количества в магистральной артерии или с помощью пульсового фотометрического метода [Аоуа§1 Т., 1998].

В заключение следует отметить, что выбор метода определения сердечного выброса зависит от возможностей отделения реанимации и интенсивной терапии, особенностей патологического процесса и тяжести гемодинамических нарушений, наблюдаемых у пациента. В большинстве случаев при возникновении синдрома шока, требующего прецизионной оценки центральной гемодинамики и кислородтранспортной функции, при сложном выборе лечебных воздействий и оценке их эффективности предпочтение отдают методу термодилюции с использованием катетера Свана—Ганса.

Читайте также: