Броуновский храповый механизм транслокации белка за счет энергии АТФ
Обновлено: 18.05.2024
Механизм создания АТФ оставался загадкой долгие годы, пока не обнаружилось, что данный процесс по сути своей является электрическим. В обоих случаях: и для дыхательной цепи (набора белков, которые осуществляют окисление субстратов кислородом) и для аналогичного фотосинтетического каскада, — генерируется ток протонов через мембрану, в которую погружены белки. Токи обеспечивают энергией синтез АТФ, а также служат источником энергии для некоторых видов работы. В современной биоэнергетике принято считать АТФ и протонный ток (точнее, протонный потенциал) альтернативными и взаимно конвертируемыми энергетическими валютами. Некоторые функции оплачиваются одной валютой, другие - второй.
К середине XX в. биохимики точно знали, что в бактериях и митохондриях электроны переходят от восстанавливаемых субстратов к кислороду через каскад электронных переносчиков, называемых дыхательной цепочкой. Загадка была в том, каким способом сопряжены перенос электрона и синтез АТФ. На протяжении 10 с лишним лет надежда открыть секрет вспыхивала и вновь угасала. Решающую роль сыграло не преодоление технических трудностей, а концептуальная разработка. Сопряжение оказалось в принципе не химическим, а электрическим. В 1961 г. английский ученый П. Митчелл опубликовал в журнале «Nature» радикальную идею для разрешения биохимической загадки века: хемиосмотическую гипотезу. Идея Митчелла была поистине революционной сменой парадигм, трансформацией концептуальной основы и поначалу вызывала бурные споры.
В 1966 г. Митчелл пишет свою первую книгу «Хемиосмотическое сопряжение в окислительном и фотосинтетическом фосфорилировании». В том же году российские ученые, биофизик Е. Либерман и биохимик В. Скулачев, придумали, как экспериментально подтвердить правоту Митчелла. С помощью синтетических ионов, проникающих через биологическую мембрану, они показали, что дыхание и фосфорилирование, действительно, связаны через протонный потенциал. Еще один серьезный шаг в поддержку Митчелла сделали биофизики биофака МГУ А. Булычев, В. Андрианов, Г. Курелла и Ф. Литвин. Используя микроэлектроды, они зарегистрировали образование трансмембранной разности электрических потенциалов при освещении крупных хлоропластов.
Еще несколько лет споров и дотошных проверок в разных лабораториях по всему свету — и идеи Митчелла, наконец, были признаны. Он был принят в Королевское общество Великобритании (и соответственно, стал сэром), получил множество престижных международных наград, а в 1978 г. был удостоен Нобелевской премии, которая, вопреки традициям, на сей раз была вручена не за открытие нового явления, а за догадку о его существовании.
Цепь переноса электрона оказалась не просто связана с мембраной, но вплетена в нее таким образом, что при движении электрона от субстрата к кислороду протоны перемещаются с внутренней поверхности наружу. Мембрана образует замкнутый пузырек, который плохо пропускает протоны, поэтому в результате «выкачивания» протонов генерируется разность потенциалов через мембрану: электрическая отрицательность внутри. Одновременно увеличивается рН: защелачивается среда внутри пузырька. Протоны снаружи оказываются под гораздо более высоким электрохимическим потенциалом, чем внутри, как бы под «давлением» со стороны и электрического потенциала и градиента рН, которые толкают протоны обратно через мембрану внутрь пузырька. Живая клетка использует энергию таких протонов для совершения разных видов работы.
Поразительные успехи рентгеноструктурного анализа белков позволили увидеть полные пространственные структуры отдельных белковых комплексов, входящих в состав дыхательной цепи. Белки цепи переноса электронов, локализованные в мембранах митохондрий, способны менять свой спектр поглощения, получая и отдавая электроны. Микроспектральные методы позволяют проследить последовательность передачи электронов по цепочке белков и выяснить, в каких именно местах часть свободной энергии электронов используется для синтеза АТФ.
Согласно идее Митчелла, для синтеза АТФ из АДФ и фосфата в мембранах митохондрий используется электрическая энергия. Следовательно, если снять разность потенциалов через мембрану, можно предположить, что синтез прекратится. Именно такой эффект был продемонстрирован в ходе экспериментов на искусственных мембранах с использованием специально синтезированных ионов, резко повышающих проводимость мембран для протонов.
Одни из первых экспериментальных доказательств верности гипотезы Митчелла были получены в нашей стране под руководством Е.А. Либермана и В.П. Скулачева. В качестве индикаторов изменений электрического поля на мембране были использованы синтетические ионы, отличающиеся по своей природе и знаку заряда, но сходные в одном: все они легко проникали через фосфолипидную пленку. После многих попыток сложилась следующая изящная экспериментальная модель.
Еще более убедительная экспериментальная модель, позволяющая проводить прямые измерения электрического тока, генерируемого клеточными органеллами и отдельными белками, была разработана и успешно использована Л.А. Драчевым, А.А. Кауленом и В.П. Скулачевым. Частицы, генерирующие электрический ток (митохондрии, хроматофоры бактерий или липидные пузырьки с встроенными в них индивидуальными белками), заставляли слипаться с плоской искусственной мембраной. После этого протонный ток, созданный молекулами-генераторами в ответ на вспышку света или добавление соответствующих химических субстратов, обнаруживался напрямую измерительными электродами по обе стороны искусственной мембраны.
В 1973 г. У. Стокениус и Д. Остерхельт из США открыли необычный светочувствительный белок в мембранах фиолетовых бактерий, обитающих в соленых озерах Калифорнийских пустынь. Этот белок, подобно зрительному пигменту глаза животных - родопсину, — содержал производное витамина А - ретиналь, за что и был назван бактериородопсином. Американские ученые Рэкер и Стокениус изящно продемонтрировали участие бактериородопсина в энергетическом сопряжении. Объединив в модельной фосфолипидной мембране только что открытый светочувствительный белок фиолетовых бактерий с АТФ-синтазой, они получили молекулярный ансамбль, способный синтезировать АТФ при включении света.
В конце 1973 г. академик Ю.А. Овчинников организовал проект «Родопсин» для сравнительного исследования животного и бактериального светочувствительных пигментов. В рамках проекта в лаборатории В.П. Скулачева в МГУ в модельных экспериментах на искусственных мембранах было доказано, что бактериородопсин - белковый генератор электрического тока. Встроенный в искусственную фосфолипидную пленку бактериородопсин направленно транспортировал протоны в ответ на вспышку света. Величина фотопотенциала на мембране превышала 0,3 В, что заведомо достаточно для энергетического обеспечения синтеза АТФ.
Бактериородопсин оказался на редкость стабильным электрическим генератором: он продолжал работать при нагревании до 100 о С и даже в 0,1 N кислоте. В ходе опытов с бактериородопсином электрическая часть хемиосмотической гипотезы получила свое окончательное подтверждение.
После множества придирчивых проверок теория П. Митчелла была признана абсолютно корректной, и ее рамки были расширены далеко за пределы сопряжения в цепях переноса электрона с синтезом АТФ. Ученому с самого начала было ясно, что циркуляция протонов может поддерживать множество видов работы при посредстве мембранных белков.
Представим себе, например, белок, транспортирующий субстрат S. Если у белка есть два функциональных места, одно для S, другое для протона, так что поток S сопряжен с потоком протона, до движущая сила для протона оказывается приложенной и к S. Тогда транспорт протона будет не только облегчать перенос S через мембрану, но и действовать как насос, аккумулирующий субстрат внутри пузырька.
У живой клетки есть не только молекулярные генераторы и насосы, но и молекулярные «моторы». Эволюция создала несколько классов белков, способных преобразовывать химическую энергию в механическое усилие. Одни из них используют в качестве топлива гидролиз нуклеотидов, другие - непосредственно ионные градиенты. Есть шаговые белковые моторы, а есть роторные.
Последнее время проблемой преобразования химической энергии в механическую работу активно занялись компьютерные биологи. Они разработали математические модели, описывающие на формальном языке разные типы молекулярных моторов. Принципиальной трудностью, которую им пришлось преодолеть, оказалась невозможность использовать подходы, разработанные ранее для макроскопических моторов, поскольку на работу молекулярных моторов сильное воздействие оказывают термические флуктуации. По этой причине теоретики окрестили белковые моторы «Броуновскими машинами». Тем не менее, в 90-х г.г. XX столетия были разработаны алгоритмы, которые позволили создать ряд имитационных моделей, в частности, мотора бактериального жгутика, механического усилия полимеризующегося волокна, вращающегося мотора АТФ-синтазы.
Главный вывод, к которому пришли исследователи: работа молекулярных моторов вряд ли основана на новых физических или химических принципах, однако, похоже, что для каждого типа белковых моторов придется создавать свое теоретическое описание.
У электрической энергетики живой клетки есть еще одно очень важное свойство. При хемиосмотическом сопряжении энергии и работы не требуется прямого контакта между специфическим белком, создающим разность потенциалов через мембрану, и белком, совершающим какой-то вид работы: поток ионов или метаболитов обеспечит сопряжение двух векторных реакций на расстоянии при условии, что они соответствующим образом ориентированы в одной и той же мембране. Данное свойство успешно используется живыми клетками в митохондриальных сетях, работающих как электрические кабели. Учеными под руководством В.П. Скулачева митохондриальные сети были выявлены у разных типов клеток и исследованы с помощью современных методов электронной микроскопии, прижизненных флуоресцентных зондов, лазерной микрохирургии.
Более того, оказалось, что принцип Митчелла используется группами живых клеток для сопряжения производства энергии одной клеткой с совершением работы в соседней. Необходимое условие такой кооперации - наличие между клетками каналов, пропускающих значительные потоки ионов и метаболитов без утечек во внешнюю среду (см. ст. «Тайны нейроспоры», «В мире науки», №9, 2004 г.).
Броуновский храповый механизм транслокации белка за счет энергии АТФ
Организация клетки. Внутриклеточный транспорт
Транслокация белков. Шапероны
А. Транслокация белков
Перенос белков через биомембраны осуществляется специальными транспортными системами.
1. Пориновый комплекс. Из цитоплазмы в ядро (см. с. 210) белки попадают через крупный (125000 кДа) заполненный водой пориновый комплекс. Транспорт белков через комплекс энергозависим и поэтому может регулироваться Ядерные белки несут одну или несколько сигнальных последовательностей (см. с. 232), с помощью которых они связываются с пориновым комплексом и импортируются с сохранением третичной структуры.
2. Переносчики белков. Импорт белков из цитоплазмы в органеллы осуществляется белками-переносчиками, которые представляют собой белковые комплексы, переносящие линейные полипептиды через биомембраны энергозависимым образом. Специфичность процесса обеспечивается за счет связывания сигнальной последовательности (см. с. 232) с ближайшим рецептором (на схеме не приведен) Процессы развертывания и вторичной укладки белков контролируются шаперонами.
3. Везикулярный транспорт. Перенос белков от одних органелл к другим происходит с помощью везикул. Везикулы отпочковываются от мембран одной органеллы, а затем исчезают, сливаясь с мембраной другой органеллы. Белки переносятся в полости пузырька или в составе мембран подобно интегральным белкам.
Пептидная цепь, растущая в процессе трансляции, принимает вторичную и третичную структуру (см. с. 80) в результате сложного многоступенчатого процесса, идущего во времени Для образования правильной структуры с еще несвернувшейся пептидной цепочкой связываются специальные белки — шапероны . Шапероны обладают сродством к экспонированным гидрофобным участкам полипептидной цепи. Связывание с шаперонами препятствует агрегации с другими белками и тем самым создает условия для нормального сворачивания растущего пептида. Взаимодействие с шаперонами — процесс энергозависимый: при освобождении шаперонов гидролизуется АТФ (АТР).
Шапероны принадлежат к трем белковым семействам, так называемым белкам теплового шока (hsp60, hsp70, hsp90). Свое название эти белки получили потому, что и к синтез возрастает при повышении температуры и других формах стресса. При этом они выполняют функцию защиты белков клетки от денатурации. Белки — представители семейства hsp70 — связываются на начальной фазе образования растущего пептида. Одни из них контролируют процесс сворачивания белка в цитоплазме, другие — участвуют в переносе белков в митохондрии. Белки hsp60 охватывают синтезированный полипептид наподобие бочонка, тем самым обеспечивая условия для принятия правильной конформации.
В. Заякоривание белков в мембранах
Белки, синтезируемые в ШЭР и несущие «стоп-транспорт-сигнал» (см. сс. 226, 232), остаются в мембране ШЭР и закрепляются там за счет гидрофобных взаимодействий в качестве интегральных мембранных белков (см. с. 216). Фиксация белка в мембране может быть также осуществлена путем присоединения липофильного якоря. Такие периферические мембранные белки (см. с. 216) присоединяют липиды во время или сразу после трансляции. Соответствующий сигнал обычно содержится в белке в форме специфической пептидной последовательности.
Мембранными якорями являются жирные кислоты (ацильные остатки, см. с. 54) или изопреноиды (пренильный остаток, см. с. 58). Белки могут быть ацилированы пальмитиновой (C 16 ) или миристиновой (C 14 ) кислотами, пренилированы путем связывания с фарнезолом (С 15 ) или геранилгераниолом (С 20 ).
Некоторые белки несут на С-конце гликозилированный фосфатидилинозит (ГФИ (GPI)]. В эту группу входят многие адгезионные молекулы (например, N-CAM, гепаринсульфатпротеогликан), ряд мембранных ферментов, таких, как щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза и различные протеиназы.
Энергетика живой клетки
Неспособные к фотосинтезу клетки (например, человека) получают энергию из пищи, которой служит или биомасса растений, созданная в результате фотосинтеза, или биомасса других живых существ, питающихся растениями, или останки любых живых организмов.
Питательные вещества (белки, жиры и углеводы) преобразуются животной клеткой в ограниченный набор низкомолекулярных соединений - органических кислот, построенных из атомов углерода, которые с помощью специальных молекулярных механизмов окисляются до углекислоты и воды. При этом освобождается энергия, она аккумулируется в форме электрохимической разности потенциалов на мембранах и используется для синтеза АТФ или напрямую для совершения определенных видов работы.
История изучения проблем преобразования энергии в животной клетке, как и история фотосинтеза, насчитывает более двух веков.
У аэробных организмов окисление углеродных атомов органических кислот до углекислого газа и воды протекает с помощью кислорода и называется внутриклеточным дыханием, которое происходит в специализированных частицах - митохондриях. Трансформация энергии окисления осуществляется ферментами, расположенными в строгом порядке во внутренних мембранах митохондрий. Эти ферменты составляют так называемую дыхательную цепь и работают как генераторы, создавая разность электрохимических потенциалов на мембране, за счет которой синтезируется АТФ, подобно тому, как это происходит при фотосинтезе.
Основная задача и дыхания и фотосинтеза — поддерживать соотношение АТФ/АДФ на определенном уровне, далеком от термодинамического равновесия, что и позволяет АТФ служить донором энергии, смещая равновесие тех реакций, в которых он участвует.
Основными энергетическими станциями живых клеток служат митохондрии — внутриклеточные частицы размером 0,1-10μ, покрытые двумя мембранами. В митохондриях свободная энергия окисления продуктов питания превращается в свободную энергию АТФ. Когда АТФ соединяется с водой, при нормальных концентрациях реагирующих веществ, выделяется свободная энергия порядка 10 ккал/моль.
В неорганической природе смесь водорода и кислорода носит название «гремучей»: достаточно небольшой искры, чтобы произошел взрыв - мгновенное образование воды с огромным выделением энергии в виде тепла. Задача, которую выполняют ферменты дыхательной цепи: произвести «взрыв» так, чтобы освобождающаяся энергия была запасена в форме, пригодной для синтеза АТФ. Что они и делают: упорядоченно переносят электроны от одного компонента к другому (в конечном счете, на кислород), постепенно понижая потенциал водорода и запасая энергию.
О масштабах этой работы говорят следующие цифры. Митохондрии взрослого человека среднего роста и веса перекачивают через свои мембраны около 500 г ионов водорода в день, образуя мембранный потенциал. За это же время Н + -АТФ-синтаза производит около 40 кг АТФ из АДФ и фосфата, а использующие АТФ процессы гидролизуют всю массу АТФ назад в АДФ и фосфат.
Исследования показали, что митохондриальная мембрана действует как трансформатор напряжения. Если передавать электроны субстрата от НАДН прямо к кислороду сквозь мембрану, возникнет разность потенциалов около 1 В. Но биологические мембраны - двухслойные фосфолипидные пленки не выдерживают такую разность - возникает пробой. Кроме того, для производства АТФ из АДФ, фосфата и воды требуется всего 0,25 В, значит, нужен трансформатор напряжения. И задолго до появления человека клетки «изобрели» такой молекулярный прибор. Он позволяет в четыре раза увеличить ток и за счет энергии каждого передаваемого от субстрата к кислороду электрона перенести через мембрану четыре протона благодаря строго согласованной последовательности химических реакций между молекулярными компонентами дыхательной цепи.
Итак, два главных пути генерации и регенерации АТФ в живых клетках: окислительное фосфорилирование (дыхание) и фотофосфорилирование (поглощение света), — хотя и поддерживаются разными внешними источниками энергии, но оба зависят от работы цепочек каталитических ферментов, погруженных в мембраны: внутренние мембраны митохондрий, тилакоидные мембраны хлоропластов или плазматические мембраны некоторых бактерий.
Разгадан механизм движения «шагающего белка»
Так миозин V шагает по актиновой нити. Движение происходит справа налево. Сначала одна из «ног» миозина (зеленая) отделяется от актиновой нити, затем другая нога (синяя) наклоняется вперед. После этого зеленая нога хаотически вращается на шарнире до тех пор, пока не наткнется на актиновую нить. Рис. из обсуждаемой статьи в Science
Японские исследователи сумели пронаблюдать под микроскопом работу одного из «молекулярных моторов» живой клетки — шагающего белка миозина V, который умеет активно передвигаться вдоль актиновых волокон и перетаскивать прикрепленные к нему грузы. Каждый шаг миозина V начинается с того, что одна из его «ног» (задняя) отделяется от актиновой нити. Затем вторая нога наклоняется вперед, а первая свободно вращается на «шарнире», соединяющем ноги молекулы, до тех пор, пока случайно не коснется актиновой нити. Конечный итог хаотического движения первой ноги оказывается строго детерминирован благодаря фиксированному положению второй.
В основе любых активных движений, совершаемых живыми организмами (от движения хромосом при клеточном делении до мышечных сокращений), лежит работа «молекулярных моторов» — белковых комплексов, части которых способны двигаться друг относительно друга. У высших организмов важнейшими из молекулярных моторов служат молекулы миозина разных типов (I, II, III и т. д., вплоть до XVII), способные активно передвигаться вдоль актиновых волокон.
Многие «молекулярные моторы», в том числе миозин V, используют принцип шагающего движения. Они передвигаются дискретными шажками примерно одинаковой длины, причем впереди оказывается попеременно то одна, то другая из двух «ног» молекулы. Однако многие детали этого процесса остаются неясными.
Сотрудники физического факультета университета Васэда (Department of Physics, Waseda University) в Токио разработали методику, позволяющую наблюдать за работой миозина V в реальном времени под микроскопом. Для этого они сконструировали модифицированный миозин V, у которого стержни ног обладают свойством накрепко «приклеиваться» к тубулиновым микротрубочкам. Добавляя в раствор модифицированного миозина V фрагменты микротрубочек, ученые получили несколько комплексов, в которых кусок микротрубочки приклеился только к одной ноге миозина V, а вторая осталась свободной. Эти комплексы сохранили способность «шагать» по актиновым волокнам, и за их движениями можно было наблюдать, поскольку фрагменты микротрубочек гораздо крупнее самого миозина, и к тому же их метили флуоресцирующими метками. При этом использовали два экспериментальных дизайна: в одном случае фиксировали в пространстве актиновое волокно, а наблюдения вели за движением фрагмента микротрубочки, а во втором фиксировали микротрубочку и наблюдали за движением фрагмента актинового волокна.
Схема эксперимента: тубулиновая микротрубочка (зеленый цилиндр) присоединена к одной из ног миозина. Актиновая нить зафиксирована в пространстве. Рис. из обсуждаемой статьи в Science
В итоге «походку» миозина V удалось изучить в больших подробностях (см. первый рисунок). Каждый шаг начинается с того, что «задняя» нога миозина отделяется от актинового волокна. Затем та нога, которая осталась прикрепленной к волокну, резко наклоняется вперед. Именно в этот момент расходуется энергия (происходит гидролиз АТФ). После этого «свободная» нога (на рисунках — зеленая) начинает хаотически болтаться на шарнире. Это не что иное, как броуновское движение. Заодно, кстати, ученым удалось впервые показать, что шарнир, соединяющий ноги миозина V, совершенно не стесняет их движений. Рано или поздно зеленая нога касается своим концом актиновой нити и прикрепляется к ней. Место, где она прикрепится к нити (и, следовательно, длина шага) полностью определяются фиксированным наклоном синей ноги.
В эксперименте поиск актиновой нити свободной ногой миозина V занимал несколько секунд; в живой клетке это, видимо, происходит быстрее, поскольку там миозин шагает без гирь на ногах. Грузы — например, внутриклеточные пузырьки, окруженные мембранами — крепятся не к ногам, а к той части молекулы, которая на рисунке изображена как «хвостик».
Источник: Katsuyuki Shiroguchi, Kazuhiko Kinosita Jr. Myosin V Walks by Lever Action and Brownian Motion // Science. 2007. V. 316. P. 1208-1212.
Умелые руки: как доставить полипептид через мембрану?
Новость
Гипотетический (до сих пор!) механизм транслокации. Трансмембранный канал SecY 1 «пропускает» через себя полипептидную цепь ( оранжевым ), а «мотор» SecA 2 проталкивает его в полость канала, одновременно расширяя её.
1 три субъединицы SecY показаны сплошной разноцветной поверхностью.
2 показан элементами вторичной структуры.
Автор
Редакторы
Более трети всех синтезируемых клеткой белков секретируется либо встраивается в мембрану, то есть — подвергается трансмембранному переносу. Этот процесс осуществляет специальный транслокационный комплекс, состоящий у бактерий из интегрального мембранного канала SecY и «мотора» SecA, который с помощью энергии АТФ «проталкивает» белóк через узкий канал SecY. До недавнего времени этот процесс был изучен только в самом общем виде (хотя было известно, например, в каких случаях белóк будет «вытолкнут» из клетки, а в каких — останется в мембране). Последние исследования пролили свет на молекулярный механизм взаимодействия SecY-SecA и то, как они осуществляют транспорт белков.
Для интеграции в плазматическую мембрану клетки или секреции во внеклеточное пространство белки используют специализированные трансмембранные каналы, осуществляющие транслокацию, — SecYEG (канал состоит из субъединиц Y, E и G) — для краткости часто называемые просто SecY. (Если речь идёт не про бактерий, а про эукариот, то аналогичный транслокационный комплекс будет называться Sec61, и состоять он будет из субъединиц α, β и γ.) Часто транслокация начинается котрансляционно — то есть, «хвостик» белка, только что сошедший с рибосомы и не успевший ещё образовать какой-либо устойчивой структуры, «захватывается» устьем канала SecY и начинает транспортироваться через мембрану клетки или эндоплазматического ретикулума.
Предназначен ли белок для трансмембранной транспортировки, и если да, то через какую мембрану — определяется сигнальным (лидерным) пептидом, который, сослужив свою роль и «указав» место, куда должен быть доставлен белок, отщепляется за ненадобностью. В случае если транспорт белкá осуществляется не параллельно с синтезом, а уже когда экспортируемая молекула «готова», к процессу может подключаться периплазматический «мотор» SecA, «проталкивающий» белóк через канал SecY (при этом затрачивается энергия АТФ).
Кстати, транслокационный комплекс (транслокон) осуществляет не только экспорт белков, но также и доставку их в мембрану клетки. Определить, следует ли белок «выпускать» наружу или интегрировать его в мембрану, помогает уникальная особенность транслокона «чувствовать» гидрофобность проходящих через его канал белковых сегментов [1]. Если транспортируемый участок достаточно длинный (20-30 а/к остатков) и при этом гидрофобный — то, скорее всего, транслокон отреагирует на это, «вытолкнув» его в липидную фазу вместо внеклеточного пространства.
Интерес к молекулярным механизмам работы транслокона объясняет необходимость знания структуры этого комплекса, и если строение отдельных его частей — SecY [2] и SecA [3] — уже достаточно давно изучено, то как всё это устроено в комплексе и каким образом белóк проходит через канал, до недавнего времени оставалось понятным лишь в самых общих чертах. И вот недавно в одном номере Nature вышло сразу три работы 4, посвящённые структуре «целующегося» комплекса SecY и SecA, и механизмам их работы. (Шутливый термин «целующийся» обозначает, видимо, что два белковых комплекса, содержащих каналы, через которые проходит белок, соединяются «ртами».)
Трансмембранный канал SecY функционирует в качестве димера, каждая молекула в составе которого выполняет свою функцию: одна собственно транслоцирует белковые цепи, другая «заякоривает» SecA в нужном положении [2]. «Моторы» SecA тоже работают в паре, и каждый из них состоит из четырёх субъединиц — по два на связывание АТФ (между субъединицами) и на формирование «точки приёмки» белкá (последние для наглядности можно изобразить «руками» — см. рисунок 1а).
Рисунок 1. Транслокация полипептидной цепи в бактериальных клетках. Трансмембранный канал SecY (жёлтым) присоединяет к своей цитоплазматической стороне «мотор» SecA по схеме «рот в рот» («целующийся» комплекс). «Мотор» состоит из четырёх субъединиц, две из которых связывают АТФ и выполняют энергетическую функцию (синим и голубым), а две другие исполняют роль «точки приёмки» (фиолетовым и зелёным; метафорически изображены в виде рук). а — В «начальной» стадии канал SecY закрыт сужéнием в центральной части и подвижной «крышкой» с внеклеточной стороны (не показана). Субъединица «мотора» SecA, связывающая сигнальный пептид, находится в готовом к «захвату» состоянии. (Это же состояние наблюдается в структуре изолированного SecA [3].) б — Шарнирный поворот этого домена после захвата сигнального пептида переносит его вглубь «точки приёмки» в SecA, в область близкого контакта со второй «рукой». в — При расщеплении АТФ (не показана) конформация «энергетических» субъединиц меняется, и «палец» второй «руки» начинает проталкивать полипептидную цепь через канал, одновременно расширяя его. Схема основана на всех доступных структурных данных 2.
Структура комплекса SecY-SecA из бактерии Thermotoga maritima [4], полученная в лаборатории Тома Рапопорта (Tom Rapoport) — профессора медицинского факультета Гарварда и медицинского института имени Ховарда Хьюза, а также автора первой структуры канала SecY [2] — содержит мономеры SecY и SecA, в то время как функциональными единицами являются димеры. Однако даже она даёт много новой информации о механизме взаимодействия этих каналов и способе транслокации. Пóра трансмембранного канала в этой структуре закрыта, а «рука» мотора SecA закрывает полость связывания сигнального пептида (в структуре отсутствует). Чтобы пептид мог связаться, «рука» должна раскрыться, а «палец» второй «руки», прикрывающий устье трансмембранного канала, должен каким-то образом использовать энергию связывания АТФ в «энергетических» субъединицах, чтобы протолкнуть полипептидную цепь в канал.
Чтобы изучить этот процесс, в группе того же Рапопорта провели другое исследование, где модифицированный сигнальный пептид использовался в качестве «молекулярного эндоскопа» для зондирования связывания с «точкой приёмки» в Sec A [5]. Приём этот заключался во введении в сигнальный пептид остатков цистеина и последующем анализе, с каким парным цистеином в транслоконе он образует дисульфидную связь. В результате выяснилось, что в неактивной (закрытой) форме транслокона (без АТФ) N-конец сигнального пептида расположен вблизи кончика «пальца» (рис. 1б), а при добавлении АТФ и запуске работы транслокона пептид постепенно проникает в трансмембранный канал (рис. 1в)! Кроме того, учёные продемонстрировали, что кроме собственно «проталкивания» белковой цепи, «палец» расширяет пору канала, через которую секретируется белок.
В этой структуре «мотор» отсутствует; зато присутствует антитело, связывающееся с тем же сайтом на поверхности канала, что и «мотор», и фиксирует его в другой, предположительно — активированной, открытой конформации. При этом часть внутренней поверхности канала оказывается открытой для цитоплазмы, что, возможно, является дополнительным местом связывания сигнального пептида (при котрансляционном транспорте).
Изучение строение мембранных белков, а особенно их комплексов — крайне непростая задача, потому что подобные комплексы часто распадаются, а белки денатурируют при извлечении их из мембран (что необходимо для изучения их организации). Однако для окончательного понимания точнейшего механизма транслокации белковых молекул через мембрану всё же потребуется достичь ещё большего, в частности — получить структуры более высокого разрешения, и уже не мономера SecY-SecA, а димера, связывающего сигнальный пептид и молекулу АТФ; понять, как «мотор» преобразует энергию гидролиза АТФ в механическую работу движения «пальца»; и, в конце концов, изучить динамику этой невероятной молекулярной машины.
Читайте также: