Антигенная структура возбудителя газовой гангрены. Биохимические свойства clostridium perfringens. Патогенность клостридий ( возбудителя газовой гангрены ).
Обновлено: 13.05.2024
Медицинская микробиология:
Факторы патогенности возбудителя газовой гангрены (C. perfringens)
а) Факторы патогенности и клеточно-молекулярный механизм их действия. В отличие от возбудителей многих других инфекционных заболеваний человека, факторы патогенности гангренозных клостридий и клеточно-молекулярные механизмы их взаимодействия с клетками макроорганизма практически не исследованы.
Роль микробного фактора в патогенезе газовой гангрены чрезвычайно сложна и изучена недостаточно, что связано с поликлостридиальной природой заболевания, полиморфизмом каждого из возбудителей, многочисленностью вырабатываемых ими токсинов и энзимов, являющихся факторами патогенности.
Наиболее сложный токсический комплекс, включающий альфа-токсин (лецитиназа С), коллагеназу, гиалуронидазу, тета-гемолизин (перфринголизин), дезоксирибонуклеазу, нейраминидазу и другие биологически активные вещества (всего известно 12), продуцирует С. perfringens. Указанные субстанции в основном являются энзимами и обладают летальными, некротизирующими, фибринолитическими, протеолитическими, гемолитическими свойствами.
Штаммы С. perfringens типа А, вызывающие газовую гангрену, продуцируют преимущественно высокоактивный альфа-токсин, или лецитиназу С (фосфолипазу С), представляющий собой металлоэнзим, катализирующий гидролиз лецитина до фосфорилхолина и диглицерида.
Три другие вида гангренозных клостридий продуцируют токсины, представляющие собой различные по структуре и функциям токсические белки, характеризующиеся антигенной специфичностью в летальном тесте с соответствующими антитоксическими сыворотками для каждого вида.
Наибольшая часть работ посвящена изучению альфа-токсина (фосфолипазы С) его молекулярной структуре и механизму действия. Показано, что альфа-токсин является цинкосодержащим металлоэнзимом с размером молекулы около 60 кД. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности позволил выявить несколько доменов данной молекулы. Первый — сигнальный пептид, необходимый для секреции белка бактериальной клеткой. Следующий домен, обладающий гомологией с другими фосфолипазами, необходим для осуществления фосфолипазной активности.
Третий домен имеет существенную гомологию с одним из эукариотических ферментов, участвующих в каскаде арахидоновых кислот. Этот домен отсутствует у многих бактериальных фосфолипаз и, хотя сам по себе не проявляет ферментативной активности, необходим для осуществления гемолитического, летального и сфингомиелиназного эффекта.
Рентгеноструктурный анализ указывает, что данный С-терминальный домен необходим для взаимодействия молекулы с фосфолипидами эукариотических мембран. В эксперименте иммунизация мышей фрагментом белка этого домена защищает животных от развития газовой гангрены.
Полученные данные свидетельствовали о полифункциональности фосфолипазы С, что было подтверждено в датьнейших экспериментах. Было установлено, что введение животным незначительного количества очищенного белка приводило к быстрому (в течение 2-5 мин) образованию свободно перемещающихся внутрисосудистых тромбов. Нарастание тромбоза вело к окклюзии кровеносных сосудов с развитием ишемии и зон некроза. Обнаруженный феномен был связан с активацией рецепторов на поверхности тромбоцитов, механизм которой пока неизвестен.
Таким образом, возникновение и быстрое нарастание некротических процессов в тканях, присущее газовой гангрене, может быть вызвано альфа-токсином (фосфолипазой С), продуцируемым возбудителем.
В отношении механизма действия перфринголизина (тета-токсин), относящегося к классу тиолзависимых гемолизинов, показано, что он оказывает прямое некротизирующее действие на ткани, а также на лейкоциты воспалительного очага.
К потенциальным факторам патогенности С. perfringens относят нейраминидазу (сиалидазу), расщепляющую ацетилнейраминовую кислоту гликопротеинов, гликолипидов и олигосахаридов, что способствует разрушению рецепторного аппарата эукариотических клеток. Сочетанное действие нейраминидазы и гиалуронидазы (мю-токсин) клостридий может вести к разрушению соединительной ткани и быстрому распространению возбудителя в тканях.
К гистотоксическим продуктам С. perfringens относятся также дельта-токсин (гемолизин), каппа-токсин (коллагеназу), лямбда-токсин (протеиназу), механизм действия которых изучен весьма мало, хотя известно, что они, способствуя активному метаболизму микробной клетки, обеспечивают бурную вегетацию и инвазию возбудителей газовой гангрены в организме.
б) Биологические модели газовой гангрены. К возбудителям газовой гангрены чувствительны почти все лабораторные животные при заражении их культурами или токсинами клостридий. Так, например, к С. perfringens высоко чувствительны обезьяны, морские свинки, мыши, менее чувствительны кролики, крысы, собаки. Наиболее универсальными и доступными животными для моделирования газовой гангрены являются морские свинки и белые мыши. Для получения типичной клинической картины необходимо соблюдать следующие условия:
1) вводить микробную взвесь вместе с 5-10% раствором хлористого кальция, создающего благоприятные условия в тканях (некроз, ишемия, снижение фагоцитарной активности) для вегетации и токсинообразования возбудителей газовой гангрены;
2) инъекцию микробной взвеси производить внутримышечно, что обеспечивает глубокое ее проникновение в мышечную ткань и анаэробные условия. Определяют токсигенные свойства клостридий обычно на белых мышах, которые после внутривенного и внутрибрюшинного их введения быстро погибают с явлениями гематурии. Дермонекротические свойства гангренозных токсинов выявляют путем постановки кожной пробы на морских свинках.
Clostridium perfringens (клостридии перфрингенс)
Клостридии перфрингенс (лат. Clostridium perfringens) — вид бактерий, возбудителей газовой гангрены и токсикоинфекций человека. Старое название — Clostridium welchii.
Clostridium perfringens относятся к условно-патогенной микрофлоре человека. Они имеются в кишечнике 25-35 % здоровых людей.
Clostridium perfringens. Общие сведения
Clostridium perfringens — грамположительные, неподвижные, не имеющие жгутиков, спорообразующие строго анаэробные бактерии (за исключением серотипа А), по форме представляющие собой большие удлиненные палочки длиной от 4 до 8 мкм, толщиной от 0,8 до 1,5 мкм, с выпуклостью в середине. Clostridium perfringens способны длительное время сохраняться во внешней среде.
Clostridium perfringens часто встречается в почве (около 10 5 бактерий на 1 г почвы), уличной пыли, в сточных водах, различных отложениях почвы, а также в пищеварительном тракте человека и различных домашних и диких животных.
Споры Clostridium perfringens обладают высокой устойчивостью к воздействию ультрафиолет, радиацию, кислоты и щелочи, различных дезинфицирующих средств, хорошо переносят нагревание, охлаждение, высыхание, сохраняют жизнеспособность в домашних холодильниках и морозильных камерах.
Clostridium perfringens в систематике бактерий
По современной классификации вид Clostridium perfringens относится к роду клостридии (Clostridium), который входит в семейство Clostridiaceae, порядок Clostridiales, класс Clostridia, тип Firmicutes, Terrabacteria group, царство Бактерии.
Исходя из способности Clostridium perfringens вырабатывать различные по своим антигенным свойствами летальные и некротические токсины выделяют шесть основных серотипов Clostridium perfringens: A, B, C, D, E и F.
Вызываемые Clostridium perfringens заболевания
Зараженное Clostridium perfringens мясо, домашняя птица, бобовые и другие продукты могут вызывать пищевое отравление. Причиной интоксикации является выделяемый clostridium perfringens токсин. Болезнь проявляется через 8-14 часов после употребления инфицированной пищи в виде водянистой диареи, тошноты, колик в животе, иногда лихорадки и длится одни или двое суток.
Clostridium perfringens, серотип А, а также некоторые другие виды клостридий, при попадании в не подвергшиеся первичной хирургической обработке раны, раневые карманы, участки некроза, плохо снабжаемые кровью ткани, могут вызывать газовую (анаэробную) гангрену, характеризующуюся быстро развивающимся и прогрессирующим некрозом тканей с образованием отека, газов, тяжелой интоксикацией.
Серотип А Clostridium perfringens может вызывать анитибиотикоассоциированные диареи (ААД) — одно из осложнений, встречающееся у больных, принимающих антибиотики. Clostridium perfringens — далеко не единственный микроорганизм, способный вызвать ААД. Наиболее частой причиной ААД бывает другой вид клостридий — Clostridium difficile. Кроме того, ААД могут вызывать Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, грибы рода Candida и др.
Clostridium perfringens, серотип F, может быть причиной некротического энтерита, сопровождающегося омертвением тканей тонкой кишки и высокой смертностью (более 30 % заболевших).
Clostridium (клостридии)
Клостридии (лат. Clostridium) — род грамположительных спороносных бактерий. Клостридии входят в состав нормальной микрофлоры человека. Однако некоторые виды клостридий могут быть причиной заболеваний. Название «клостридии» происходит от греческого κλοςτεδ (веретено), так как при спорообразовании клостридии раздуваются в центре и приобретают форму веретена.
Клостридии — нормальная микрофлора человека
- у детей до года — до 10 3 КОЕ/г
- у детей старше года и взрослых до 60 лет — до 10 5 КОЕ/г
- у взрослых старше 60 лет — до 10 6 КОЕ/г
Клостридии — возбудители заболеваний
Большинство клостридий не патогенны, но некоторые виды клостридий могут быть причиной различных болезней человека, часть которых протекает тяжело и может приводить к летальному исходу. В частности, клостридии вида Clostridium botulinum могут быть причиной ботулизма, Clostridium tetani — столбняка, Clostridium perfringens, Clostridium novyi, Clostridium oedematiens и Clostridium septicum — газовой гангрены.
Clostridium perfringens также могут вызывать пищевую токсикоинфекцию, причиной которой является продуцируемый Clostridium perfringens токсин. Через 8-14 часов после употребления зараженного Clostridium perfringens мяса, домашней птицы, бобовых начинается водянистая диарея, тошнота, колики в животе, иногда лихорадка. Продолжительность болезни одни или двое суток.
Clostridium perfringens типа А могут вызывать антибиотикоассоциированную диарею или псевдомембранозный колит. Clostridium perfringens типа F может быть причиной некротического энтерита.
Clostridium tetani являются возбудителем столбняка — острого инфекционного заболевания человека и животных, характеризующегося поражением нервной системы и проявляющееся тоническим напряжением скелетной мускулатуры и генерализованными судорогами.
Клостридии могут вызывать заболевания мочеполовых органов человека, в частности, острый простатит.
Приказом Минздравсоцразвития России №1664н от 27 декабря 2011 г. «Об утверждении номенклатуры медицинских услуг» медицинские услуги «A26.02.002 Бактериологическое исследование раневого отделяемого на возбудителей газовой гангрены (Clostridium spp.)» и «A26.19.007 Бактериологическое исследование кала на клостридии (Clostridium spp.)» включены в номенклатуру медицинских услуг, раздел 26.
Антибиотики, активные в отношении клостридий
Антибактериальные средства (из имеющих описание в данном справочнике), активные в отношении клостридий: метронидазол, тинидазол, рифаксимин, тетрациклин, доксициклин, линкомицин.
Виды клостридий, устойчивые к клиндамицину: Clostridium sporogenes и Clostridium tertium.
Клостридии в систематике бактерий
По современной классификации род клостридии входит в семейство Clostridiaceae, порядок Clostridiales, класс Clostridia, тип Firmicutes, Terrabacteria group, царство Бактерии.
К роду клостридии относится более 100 видов: С. aceticum, C. acetireducens, C. acetobutylicum, C. acidisoli, C. aciditolerans, C. aestuarii, C. akagii, C. alcalibutyricum, C. alcaliphilum, C. algidicarnis, C. algifaecis, C. algoriphilum, C. amazonense, C. aminobutyricum, C. aminovorans, C. amylolyticum, C. arbusti, C. argentinense, C. aurantibutyricum, C. autoethanogenum, C. baratii, C. beijerinckii, C. bogorii, C. boliviensis, C. bornimense, C. botulinum, C. bovipellis, C. bowmanii, C. butyricum, C. cadaveris, C. caliptrosporum, C. caminithermale, C. carboxidivorans, C. carnis, C. cavendishii, C. celatum, C. cellulovorans, C. chartatabidum, C. chauvoei, C. chromiireducens, C. cochlearium, C. colicanis, C. collagenovorans, C. corinoforum, C. coskatii, C. crotonatovorans, C. cylindrosporum, C. diolis, C. disporicum, C. drakei, C. elmenteitii, C. estertheticum, C. fallax, C. favososporum, C. felsineum, C. filamentosum, C. formicaceticum, C. frigidicarnis, C. frigoriphilum, C. frigoris, C. fusiformis, C. ganghwense, C. gasigenes, C. grantii, C. guangxiense, C. haemolyticum, C. halophilum, C. homopropionicum, C. huakuii, C. hveragerdense, C. hydrogeniformans, C. hydrolyticum, C. ihumii, C. intestinale, C. isatidis, C. islandicum, C. kluyveri, C. kogasensis, C. lacusfryxellense, C. liquoris, C. ljungdahlii, C. longisporum, C. lundense, C. luticellarii, C. magnum, C. malenominatum, C. massiliodielmoense, C. maximum, C. merdae, C. moniliforme, C. neonatale, C. neuense, C. nitrophenolicum, C. novyi, C. oceanicum, C. oryzae, C. paraputrificum, C. pascui, C. pasteurianum, C. peptidivorans, C. perfringens, C. phoceensis, C. polyendosporum, C. polynesiense, C. proteolyticus, C. psychrophilum, C. punense, C. puniceum, C. putrefaciens, C. quinii, C. ragsdalei, C. roseum, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sardiniense, C. sartagoforme, C. saudiense, C. scatologenes, C. schirmacherense, C. senegalense, C. septicum, C. sordelli, C. sporogenes, C. subterminale, C. sulfidigenes, C. swellfunianum, C. taeniosporum, C. tagluense, C. tarantellae, C. tepidiprofundi, C. tepidum, C. tertium, C. tetani, C. tetanomorphum, C. thermobutyricum, C. thermopalmarium, C. thermophilus, C. thiosulfatireducens, C. tunisiense, C. tyrobutyricum, C. uliginosum, C. uzonii, C. ventriculi, C. vincentii, C. vulturis, [Butyribacterium] methylotrophicum.
Клостиридии C. sporogenes и другие имеют активные протеолитические ферменты и способны использовать в качестве субстратов белки и пептиды, гидролизуя их до аминокислот и подвергая затем последние сбраживанию. Такие клостридии относят к группе протеолетических клостридий.
Ранее клинически важный вид Clostridium perfringens назывался Clostridium welchii.
Изменения в составе рода Clostridium
В последние годы клостридии были серьёзно реклассифицированы, в частности:
Важнейший клинически вид Clostridium difficile был перенесён во вновь созданный род Clostridioides семейства Peptostreptococcaceae и ему присвоено наименование Clostridioides difficile. В этот же род был перенесён вид Clostridium mangenotii.
Вид Clostridium litorale перемещён в род Peptoclostridium того же семейства Peptostreptococcaceae и переименован в Peptoclostridium litorale.
Вид Clostridium sticklandii перемещён в род Acetoanaerobium семейства Peptostreptococcaceae и переименован в Acetoanaerobium sticklandii.
Вид Clostridium dakarense перемещён в род Romboutsia семейства Peptostreptococcaceae.
Clostridium hiranonis, Clostridium paradoxum, и Clostridium thermoalcaliphilum, их современные наименования: [Clostridium] hiranonis, [Clostridium] paradoxum и [Clostridium] thermoalcaliphilum, перенесены в семейство Peptostreptococcaceae без уточнения рода.
Вид Clostridium histolyticum был перемещён в род Hathewaya семейства Clostridiaceae и ему присвоено наименование Hathewaya histolytica. В этот же род были перенесены виды Clostridium limosum и Clostridium proteolyticum с изменением наименования на Hathewaya limosa и Hathewaya proteolytica, соответственно.
Вид Clostridium ramosum перемещён в род Erysipelatoclostridium, семейство Erysipelotrichaceae, порядок Erysipelotrichales, класс Erysipelotrichia и ему присвоено наименование Erysipelatoclostridium ramosum.
Виды Clostridium aerotolerans, Clostridium aldenense, Clostridium algidixylanolyticum, Clostridium aminophilum, Clostridium amygdalinum, Clostridium asparagiforme, Clostridium bolteae, Clostridium celerecrescens, Clostridium citroniae, Clostridium clostridioforme, Clostridium fimetarium, Clostridium glycyrrhizinilyticum, Clostridium herbivorans, Clostridium hylemonae, Clostridium indolis, Clostridium lavalense, Clostridium methoxybenzovorans, Clostridium polysaccharolyticum, Clostridium populeti, Clostridium saccharolyticum, Clostridium scindens, Clostridium sphenoides, Clostridium symbiosum, Clostridium xylanolyticum были перенесены в род Lachnoclostridium семейства Lachnospiraceae и они в настоящее время именуются [Clostridium] aerotolerans, [Clostridium] aldenense, [Clostridium] algidixylanolyticum, [Clostridium] aminophilum, [Clostridium] amygdalinum, [Clostridium] asparagiforme, [Clostridium] bolteae, [Clostridium] celerecrescens, [Clostridium] citroniae, [Clostridium] clostridioforme, [Clostridium] fimetarium, [Clostridium] glycyrrhizinilyticum, [Clostridium] herbivorans, [Clostridium] hylemonae, [Clostridium] indolis, [Clostridium] lavalense, [Clostridium] methoxybenzovorans, Lachnoclostridium phytofermentans, [Clostridium] polysaccharolyticum, [Clostridium] populeti, [Clostridium] saccharolyticum, [Clostridium] scindens, [Clostridium] sphenoides, [Clostridium] symbiosum, [Clostridium] xylanolyticum, соответственно.
Виды Eubacterium moniliforme и Eubacterium tarantellae перенесены из рода Eubacterium и названы Clostridium moniliforme и Clostridium tarantellae.
Антигенная структура возбудителя газовой гангрены. Биохимические свойства clostridium perfringens. Патогенность клостридий ( возбудителя газовой гангрены ).
Возбудители газовой гангрены (клостридии, Clostridium): морфологические и культуральные свойства
Возбудители газовой гангрены относятся к роду Clostridium семейства ВасШасеае. В этиологии газовой гангрены играют роль преимущественно представители 4 видов («грозная четверка», как их образно называют): С. perfringens, С. oedematiens (С. novyi), С. septicum, С. histolyticum. Ведущим возбудителем является С. perfringens типа А, впервые открытый Welch и Nuttall в 1892 г. Название ему дали позднее Veilon и Zuber (1897) от слова «perfringo» (проламываю) ввиду способности микроба распространяться и разрушать ткани.
С. perfringens обусловливает 70-80% случаев газовой гангрены, С. oedematiens — 20-30%, С. septicum — 10-15%, С. histolyticum — 4-8%.
Основные таксономические характеристики возбудителей газовой гангрены как представителей рода Clostridium изложены в соответствующем разделе главы 9 «Возбудитель столбняка Clostridium tetani».
Каждому виду возбудителя газовой гангрены присущ синтез в макроорганизме и в культуральной среде определенных токсинов, различающихся между собой как структурно и антигенно, так и по механизму действия, что позволяет использовать их в биотестах и иммунологических методах для идентификации клостридий, а также для подразделения микробов на типы (токсивары) внутри вида. С использованием реакции биологической нейтрализации (РБН) токсинов соответствующими антитоксическими сыворотками было установлено подразделение С. perfringens на 5 типов (А, В, С, L), Е). Показано также, что вид С. oedematiens бывает 4 типов (А, В, С, D). Однако в патологии людей играют роль только типы А указанных возбудителей.
Другие виды возбудителей газовой гангрены не имеют внутривидового членения по признаку продуцируемых токсинов.
Морфологические и культурально-биохимические свойства. Морфологически возбудители газовой гангрены представляют собой прямые или несколько изогнутые палочки, имеющие различные размеры в зависимости от вида. С. perfringens — короткие толстые (0,6-1,0x4,0-6,0 мкм) с обрубленными концами палочки, обычно располагающиеся парами или «обоймами» по несколько штук. С. oedematiens — наиболее крупная и полиморфная по длине палочка, размеры ее находятся в пределах 1,0-2,0x8,0-15,0 мкм. Эти микробы часто образуют длинные нити и располагаются цепочками или спиралями. Два других вида представляют собой средние по величине палочки размером 0,4-0,6x6,0-8,0 мкм.
Все виды клостридий окрашиваются по Граму положительно и образуют овальные или сферические споры, утолщающие поперечник микробной клетки. В зависимости от расположения споры (субтерминально или центрально) клетка приобретает булавовидный, что характерно для С. perfringens, или веретенообразный вид.
В отличие от других клостридий, С. perfringens не имеет жгутиков и не обладает подвижностью, что является одним из диагностических признаков при микроскопи-ровании нативных мазков из патологического материала или культуральных посевов. В патологическом материале капсулу, которая выглядит в мазках как светлый ободок, окружающий микроб, могут образовывать только С. perfringens. Это может служить диагностическим тестом для С. perfringens.
Все возбудители газовой гангрены относятся к анаэробам, имеющим, ввиду отсутствия у них цитохромов, цитохромоксидаз, каталазы и пероксидазы, особые обмен веществ и дыхание. Наиболее строгим анаэробом из этих микробов является С. oedematiens, растущий при вакууме около 700 мм рт. ст„ другие виды более толерантны к кислороду и могут расти при вакууме 500-600 мм рт. ст.
В целях снижения окислительно-восстановительного потенциала и обеспечения анаэробиоза в жидкие питательные среды вносят тиогликолиевую кислоту или ее соли. /Для создания относительного анаэробиоза жидкие среды разливают высоким столбиком в пробирки или флаконы и вносят в них различные адсорбенты кислорода (кусочки ваты, целлофана, вареного мяса или печени, пшено), сверху для предотвращения попадания кислорода на среду наслаивают вазелиновое масло слоем 4-5 мм.
Непосредственно перед посевом с целью удаления растворенного в среде кислорода пробирки со средой прогревают на водяной бане в течение 10-15 мин, затем охлаждают до 40-45°С, вносят 0,5-1,0% стерильного раствора глюкозы и делают посев.
Для обеспечения не только вегетации гангренозных клостридий, но и синтеза токсинов питательные среды должны отвечать сложным потребностям микроорганизмов в источниках азотистого и углеродного питания, а также в ростовых факторах. В качестве белковых основ питательных сред обычно используют гидролизаты глубокой степени расщепления белок-содержащих субстратов животного (мясо, печень, казеин, рыба, мозг) или растительного (кукуруза, пшено, соя и др.) происхождения с добавлением в бульон кусочков мяса или печени (по принципу среды Китт—Тароцци).
Плотные агаровые среды готовят на тех же питательных основах с 1,0-1,5% агара и добавлением различных дифференциально-диагностических добавок (кровь, яичный желток, молоко, сыворотки, углеводы, мочевина и др.).
Посевы на жидкие питательные среды выращиваются в обычных термостатах. Для обеспечения должного анаэробиоза посевы на плотные питательные среды (на поверхность среды) требуют выращивания в специальных устройствах приборного типа — микро- или макроанаэростатах, «анаэробных камерах». С этой целью также используют культивирование в газогенераторных системах типа Gaz-Pack. Следует учесть, что в отличие от культивирования аэробных микроорганизмов, чашки Петри с посевами ставятся в анаэростат вверх крышкой, чтобы предотвратить прилипание слоя агаровой среды при отсасывании воздуха.
В обычной лабораторной практике для обеспечения роста и проявления токсигенных свойств гангренозных клостридий применяется культивирование посевов при 37°С и значениях pH среды 7,0-7,4.
Из всех возбудителей газовой гангрены наиболее высокой потенцией роста обладает С. perfringens: нередко уже через 1-3 ч после посева на жидкие питательные среды, особенно при культивировании при 42—43°С, появляется интенсивный рост, сопровождающийся помутнением всего столбика среды и бурным газообразованием. За счет образования смеси газов (аммиак, сероводород, летучие амины, альдегиды, кетоны), при открывании пробирки над огнем может произойти взрыв газов!
Рост других гангренозных клостридий начинает проявляться только спустя 12—18 ч после посева сначала в придонной части пробирки с небольшим газообразованием, достигая к 48 ч полного помутнения среды с выпадением рыхлого осадка.
В столбике агаровой среды колонии С. perfringens формируются быстрее (в течение 24-36 ч), чем колонии других клостридий. В глубине агара при посеве одной и той же культуры могут наблюдаться два варианта колоний: S — гладкий и R — шероховатый. Гладкий вариант колоний имеет вид чечевичного зерна или диска, иногда колонии выглядят в виде сердца. В мазках из колоний S-форм обычно содержатся классические короткие палочки. R-формы колоний имеют вид пушинок с уплотненным центром; в мазках из этих колоний обнаруживаются нити или цепочки из коротких палочек.
На поверхности плотных сред также образуются два основных варианта колоний S и R, кроме того, бывает еще М-вариант (слизистый) колоний.
В начале роста гладкие колонии напоминают капли росы, а затем теряют прозрачность и приобретают сероватую или белую окраску. Колонии круглые сочные куполообразные с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями. Шероховатые колонии имеют неправильную форму с изрезанным фестончатым краем, иногда с отростками в виде шипов и бугристой поверхностью. М-колопии отличаются от гладких более высоким куполом и слизистой консистенцией. Они состоят из клеток, имеющих капсулу, которые при росте на жидких средах могут образовывать густую слизь.
Колонии С. perfringens на поверхности кровяного агара обычно окружены одной или двумя зонами гемолиза, что обусловлено гемолитическим действием продуцируемых микробом альфа— и тета-токсинов. Сульфитредуцирующие свойства гангренозных клостридий проявляются при росте на железосульфитной среде Вильсона—Блэра. На этой среде в результате взаимодействия H2S с солями железа и свинца уже спустя 4-6 ч после посева С. perfringens образует колонии черного цвета с интенсивным почернением среды вокруг. Другие виды клостридий вызывают значительно меньшее почернение среды в связи с более медленным ростом микроорганизмов.
На желточно-молочно-лактозном агаре (среда Виллиса—Хоббс), липолитические свойства клостридий проявляются в виде белой опалесценции вокруг колоний, лецитиназные свойства — в виде перламутровой (жемчужной) опалесценции, а лактозоферментирующие свойства — в виде покраснения среды. Эта среда может быть использована для дифференциации возбудителей газовой гангрены на основе их биохимической активности.
Для С. perfringens особенно характерен рост на лакмусовом молоке (по Минкевичу), проявления которого могут рассматриваться как экспресс-диагностический тест на этот микроб. Уже через 1-3 ч после посева, особенно при инкубировании при 42-43°С, в результате бурной ферментации молока и разложения лакмуса в кислой среде наблюдается выраженное створаживание молока с просветлением сыворотки и образованием губкообразного содержащего пузырьки газа сгустка оранжево-красного цвета, который под воздействием газа может быть даже вытолкнут из пробирки. Другие виды клостридий медленно пептонизируют лакмусовое молоко или никак его не изменяют.
Наиболее высокой биохимической активностью обладает С. perfringens: все штаммы сбраживают с образованием кислоты и газа глюкозу, галактозу, мальтозу, лактозу, левулезу, сахарозу; не ферментируют маннит и дульцит; некоторые штаммы могут разлагать глицерин, инулин, крахмал, медленно расплавлять свернутую сыворотку и 7% желатин.
Наиболее высокой протеолитической активностью из этой группы клостридий обладает С. histolyticum, который активно разжижает желатин, пептонизирует кусочки мяса, свернутую сыворотку, яичный белок.
В таблице ниже представлены основные биохимические характеристики, имеющие значение при идентификации возбудителей раневых клостридиозов.
Споры возбудителей газовой гангрены устойчивы к кипячению в течение от 20 до 160 мин. В связи с этим наиболее надежным способом обезвреживания является автоклавирование при 130°С в течение 20 мин. В объектах внешней среды (почва, вода, фецес и др.) микроорганизмы в споровой форме могут длительно сохраняться, а при благоприятных температурных условиях и влажности — даже вегетировать в них.
Вегетативные формы микробов чувствительны к прогреванию в течение 20-30 мин при 80°С, а также инактивируются в 1% растворе хлорамина или в 6% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства в течение 60 мин. Возбудители газовой гангрены, особенно С. perfringens, чувствительны к антибиотикам пенициллинового и метронидозолового рядов.
12.1.2. Возбудители газовой гангрены
Газовая гангрена - тяжелая раневая инвазивная полимикробная инфекция, для которой характерна выраженная интоксикация и прогрессирующий некроз тканей с развитием отека и газообразования.
Классификация
Наиболее часто (до 80% случаев) заболевание вызывает вид C. perfringens. Также возбудителями газовой гангрены являются C. novyi, C. septicum, C. hystolyticum.
К условно-патогенным возбудителям относят C. sordelii, C. fallax и некоторых других.
Все возбудители - грамположительные палочки, имеют спору, расположенную субтерминально или центрально.
C. perfrinqens представляют собой крупные, полиморфные бактерии, имеют спору, капсулу, однако не имеют жгутиков (неподвижны).
C. novyi - толстые, крупные палочки, образуют овальные споры, расположенные субтерминально, подвижны, не имеют капсулы.
C. septiсum - полиморфные подвижные палочки, споры расположены субтерминально, капсулы не имеют.
C. histolyticum - небольшие, подвижные спорообразующие палочки, споры располагаются субтерминально, капсул нет.
Культуральные свойства
Все клостридии - строгие анаэробы (C. perfrinqens может проявлять аэротолерантность). Температурный оптимум для роста - 45°С, растут в диапазоне 20-50°С. Культивируются на средах для выращивания анаэробов (Китта-Тароцци, железосульфитном агаре Вильсона-Блера, кровяном агаре в анаэростате и т.д.).
C. perfrinqens способна быстро в течение 2-5 часов створаживать молоко (среда Тукаева) и вызывать почернение среды Вильсона-Блера (в ее состав входят МПА, глюкоза, сульфит натрия, хлорид железа). При этом в процессе жизнедеятельности бактерий образуется сульфид железа, что вызывает почернение агара. Из-за активного разложения глюкозы с газообразованием в среде возникают множественные разрывы.
На кровяном агаре обычно появляются шероховатые бахромчатые колонии с зоной гемолиза, чернеющие на воздухе.
C. novyi при росте гемолиза не образуют, почернение среды Вильсон-Блера дают через сутки
C. septiсum на кровяном агаре растут в виде сплошного нежного налета.
C. histolyticum дают узкую зону гемолиза на кровяном агаре. Из-за выраженной протеолитической активности растворяют кусочки печени на среде Китта-Тароцци, быстро разжижают желатин. Почернение среды Вильсон-Блера отмечается через 3-6 часов.
Биохимические свойства
Возбудители вызывают анаэробный распад углеводов с образованием кислот (чаще масляной, уксусной) и газов (СО2, Н2, Н2S, иногда СН4). Для них характерен отрицательный оксидазный и каталазный тесты.
C. perfrinqens обладают выраженной сахаролитической активностью (разлагают многие углеводы, помимо маннита, до кислот и газа). Протеолитическая активность менее выражена. Разжижают желатин, коагулируют сыворотку и белки молока. Восстанавливают нитраты в нитриты.
C. novyi биохимически менее активны, чем C. perfrinqens. Ферментируют глюкозу, мальтозу, глицерин с образованием кислоты и газа. Разжижают желатин.
C. septiсum разлагают глюкозу, лактозу, мальтозу, но не разлагают сахарозу. При распаде белков образуют сероводород и аммиак. Желатин разжижают медленно.
C. histolyticum не ферментируют углеводы, но обладают выраженными протеолитическими свойствами, растворяют кусочки печени на среде Китта-Тароцци, быстро разжижают желатин.
Антигенная структура
Разделение возбудителей по серологическим свойствам зависит от антигенной структуры их токсинов.
Отсюда у C. perfrinqens различают 6 сероваров - А, В, С, D, Е, F, выделяющих различные по антигенной структуре экзотоксины с летальными, некротическими, гемотоксическими, нейротоксическими свойствами.
Различные комбинации 4 основных токсинов C. perfrinqens ( - альфа, - бета, ε - эпсилон и ι - йота) определяют принадлежность возбудителя к соответствующему серовару. У человека заболевания преимущественно вызывают бактерии типа A, реже C или D.
У C. novyi известны 4 серовара - А, В, С, D, наиболее патогенным для человека является тип А.
C. septiсum имеют 6 сероваров экзотоксина (А, В, С, D, Е, F), обладающих летальным, гемолитическим и некротическим действием.
У C. histolyticum по антигенной структуре токсинов выявлено 5 сероваров.
Факторы патогенности
Основные факторы патогенности клостридий - это ферменты агрессии и инвазии.
Данные ферменты катализируют гидролитическое расщепление клеточных мембран, компонентов мышечной и соединительной ткани с последующим развитием отека. Это сопровождается снижением окислительно-восстановительного потенциала в клетках, активацией эндогенных протеаз, приводящих к аутолизу тканей.
C. perfrinqens обладает широким набором (не менее 14) высокоактивных токсических ферментов и других факторов, а также специфическим энтеротоксином.
a-Токсин (фосфолипаза С или лецитиназа) является ведущим токсином возбудителя; оказывает дермонекротическое, гемолитическое и летальное действие (вызывает гибель лабораторных животных при внутривенном введении). Гидролизует мембранные фосфолипиды.
b-Токсин обладает выраженным некротическим действием на ткани, вызывает некротический энтерит, часто продуцируется клостридиями типа С.
d-Токсин проявляет гемолитическую активность, оказывает летальное действие на лабораторных животных; q-токсин (или перфринголизин) также оказывает гемолитическое, дермонекротическое и летальное действие;
e- и ι-токсины оказывают летальное, дермонекротическое действие, увеличивают проницаемость сосудов микроциркуляции.
k-Токсин (или фермент коллагеназа) разрушает мышечную ткань и коллагеновые волокна соединительной ткани; l-токсин (протеиназа) расщепляет денатурированный коллаген и желатин. Обусловливает некротические свойства возбудителя.
m-Токсин (гиалуронидаза) расщепляет гиалуроновую кислоту, n-токсин (микробная ДНКаза) - высокополимерные нуклеиновые кислоты; оба токсина увеличивают проницаемость тканей для клостридий.
Энтеротоксин в основном образуют C. perfringens типов А и С, которые являются распространенной причиной пищевых токсикоинфекций. Этот термолабильный протеин высвобождается возбудителями в толстом кишечнике при споруляции. Токсин прямо разрушает цитоплазматическую мембрану энтероцитов, что приводит к потере воды и электролитов; вызывает рвоту и диарею.
Другие виды клостридий также продуцируют множество факторов и энзимов с токсической активностью.
У C. novyi известно не менее 8 токсинов с гемолитической, лецитиназной, протеазной и гиалуронидазной активностью.
C. septiсum продуцирует токсины с гемолитической, гиалуронидазной, ДНКазной и некротической активностью.
C. histolyticum имеет 5 основных токсинов: a-токсин с летальной и некротической активностью, гемолизин, комплекс протеолитических ферментов (коллагеназа, эластаза, протеаза).
Резистентность
Споры возбудителей газовой гангрены весьма устойчивы во внешней среде, могут сохраняться до 20-25 лет без потери вирулентности. Их устойчивость к нагреванию различна, при этом у сероваров C. perfringens А и С они могут выдерживать кипячение до 6 часов. Обладают повышенной стойкостью к автоклавированию, действию дезинфектантов и антисептиков.
Патогенез и характеристика заболевания
Патогенные клостридии обитают в кишечнике человека и животных. Оттуда вместе с испражнениями попадают во внешнюю среду (в почву, на одежду, кожу).
Анаэробная инфекция возникает при наличии рвано-ушибленных осколочных ран, при сдавлении тканей, обширных ожогах высоких степеней, отморожениях.
Газовая гангрена развивается при загрязнении ран почвой или различными материалами, содержащими споры анаэробов. Особенно благоприятны для возбудителей раны с разможженными тканями, где имеются глубокие карманы, некротизированные ткани, в глубине которых создаются анаэробные условия.
Предрасполагающими факторами для развития газовой гангрены у пациентов являются заболевания с расстройством микроциркуляции в нижних конечностях - сахарный диабет, облитерирующий атеросклероз и др.
Важную роль играет сопутствующая аэробная и факультативно-анаэробная инфекция, которая ведет к потреблению кислорода в очаге поражения и снижению окислительно-восстановительного потенциала в тканях. Отсюда газовая гангрена в большинстве случаев - это смешанная инфекция.
При этих условиях споры прорастают, выделяют экзотоксины и ферменты, приводящие к нарушению кровообращения, распространению некроза, распаду тканей, тяжелой интоксикации. Анаэробная инфекция протекает без ярко выраженного воспаления. Газовая гангрена дает различные клинические проявления в зависимости от места локализации.
Из-за цитолитических свойств экзотоксина разрушаются цитоплазматические мембраны, что приводит к высвобождению содержимого клеток и последующей их гибели. За счет увеличения проницаемости тканей и стенок сосудов в тканях выпотевает жидкость, что приводит к развитию отека. За счет сахаролитических ферментов расщепляется гликоген мышечной ткани и другие углеводы, что приводит к скоплению газа в подкожной клетчатке.
Газообразование - результат ферментативной активности клостридий, а некроз - это результат действия токсинов и ферментов. К системной интоксикации присоединяется токсическое действие продуктов тканевого разложения.
Инкубационный период заболевания может длиться от нескольких часов до 5 дней.
Различают 4 основные клинические формы газовой гангрены:
1. Эмфизематозная - характеризуется обильным газообразованием в ране, обычно вызывается C. perfringens и С. septiсum.
2. Токсическая - характеризуется быстрым развитием отека с резким побледнением кожи (C. novyi).
3. Смешанная - отличается отеком и газообразованием. Чаще вызывается ассоциацией анаэробов.
4. Флегмонозная - сопровождается отеком без тенденции к распространению. Отделяемое гнойное, т.к. присоединяется вторичная микрофлора.
Помимо газовой гангрены, C. perfringens сероваров А и С часто вызывают пищевые токсикоинфекции, обусловленные продукцией энтеротоксина. Они сопровождаются рвотой, диареей. Данная патология протекает благоприятно и завершается в течение нескольки дней.
Редким, но тяжелым клостридиальным поражением кишечника является некротический энтерит. Он возникает при заражении C. perfringens серовара С и связан с продукцией возбудителем некротизирующего β-токсина. Поражается стенка тонкого кишечника с развитием геморрагической диареи. Без лечения болезнь может закончиться летально.
Иммунитет при газовой гангрене связан продукцией токсин-нейтрализующих АТ. Однако их протективная активность недостаточна для контроля инфекции и не предохраняет от повторного заражения.
Лабораторная диагностика
Материалом для исследования являются: отделяемое раны, фрагменты пораженных органов и тканей, перевязочный и шовный материал и т.д.
Ускоренный метод диагностики - газожидкостная хроматография. По спектру выделяемых жирных кислот (бутират и др.) способ позволяет быстро подтвердить наличие анаэробной инфекции в материале.
Наличие экзотоксинов в фильтрате исследуемого материала определяют в реакции преципитации, ИФА, РПГА. Для быстрого обнаружения экзотоксина в крови больного ставят РПГА с эритроцитарным поливалентным антитоксическим диагностикумом или ИФА.
Микроскопический метод. Кроме окрашенных по Граму мазков-отпечатков из ран, используется прямой метод иммунной флюоресценции с применением специфических люминесцирующих сывороток.
Бактериологический метод - измельченные ткани или отделяемое ран засевают на кровяной агар, среду Вильсон-Блера, Китта-Тароцци.
Посевы помещают в анаэростат и термостат, возбудителя идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим и токсигенным свойствам.
Обнаружение C.perfringens проводят по быстрому, в течение 3-х часов, почернению железосульфитной среды Вильсон-Блера и раннему (в течение 5-6 часов) створаживанию молока (среда Тукаева).
Быстрое определение C.novyi проводят с помощью бензидинового теста, для чего колонии, выросшие в анаэростате на глюкозо-кровяном агаре с бензидином, держат на воздухе. В условиях аэрации они быстро чернеют.
C.hystolytiсum активно расплавляют кусочки ткани в среде Китта-Тароцци.
В реакции нейтрализации на мышах используют специфические противогангренозные сыворотки. Учет проводят по выживаемости животных.
Лечение газовой гангрены комплексное и включает тщательную хирургическую обработку ран, дезинтоксикационную инфузионную терапию, назначение антибиотиков (β-лактамов, аминогликозидов и др.), которые подавляют рост анаэробов и сопутствующей микрофлоры.
При тяжелых интоксикациях возможно применение противогангренозных поливалентных антитоксических сывороток или иммуноглобулинов против наиболее частых видов возбудителей (C. perfringens, C. novyi, C. septicum), однако их активность снижается в условиях нарушенного кровообращения в пораженных тканях.
Профилактика
Профилактика заболевания неспецифическая. Анатоксин против газовой гангрены существенно менее эффективен, чем анатоксины столбняка либо дифтерии в профилактике соответствующих болезней. Предупреждение инфекции возможно при адекватном хирургическом лечении пациентов и назначении антибиотиков, активных в отношении клостридий.
Читайте также: