Значение протеиндисульфидизомеразы (ПДИ) в сворачивании белка

Обновлено: 24.04.2024

Все белки, синтезируемые мембраносвязанными рибосомами, имеют гидрофобную СП, необходимую для проникновения полипептидной цепи через мембрану ЭПС.

Митохондриальные белки, как уже упоминалось, в подавляющем большинстве (95%) образуются свободными рибосомами; да и остальные 5% приходятся не на мембраносвязанные, а на внутримитохондриальные рибосомы.

Однако при трансляции этих белков тоже образуется СП. Это обеспечивает прохождение пептидной цепи через мембраны митохондрий — из гиалоплазмы в митохондриальный матрикс. Потом (в матриксе) эта СП отщепляется.

Более того, если белок должен в конечном счете оказаться в межмембранном пространстве, он имеет и вторую СП, которая экспонируется после удаления первой СП. Тогда с помощью второй СП белок проникает из матрикса в межмембранное пространство.

Причем до окончания всех этих транспортных процессов полипептидная цепь остается в развернутом состоянии, что обеспечивается специальными шаперонами.

В итоге последовательность событий выглядит так, как показано на рис. 2.8.

а) Синтезируемая на свободных рибосомах цепь митохондриального белка, во-первых, имеет СП (одну или две) и, во-вторых, сразу связывается с шаперонными белками, препятствующими фолдингу.

б) По окончании трансляции цепь сохраняет связь с шаперонами и диффундирует к митоходрии. Здесь она с помощью СП пересекает (уже без шаперонов) обе митохондриальные мембраны в месте их соприкосновения.

в) В матриксе митохондрии (если это конечный «пункт маршрута») другие шапероны обеспечивают правильный фолдинг вновь прибывшего белка.

Что касается ядерных белков, то многие из них тоже имеют СП и тоже проникают с их помощью через поры в ядерной оболочке (которая опять-таки состоит из двух мембран). Возможно, в процессе этого проникновения в диафрагме, закрывающей пору, образуются временные каналы.

Требование о наличии СП относится и к транскрипционным факторам. Правда, СП не обязательно должна находиться на N-конце цепи: она может быть расположена и в середине. Очевидно, в этих случаях она просто является «меткой», которая узнается теми структурами, которые обеспечивают перенос в ядро.

В то же время для гистоновых белков СП не требуется. Очевидно, это связано с тем, что данные белки являются небольшими и содержат значительные гидрофобные области (для взаимодействия друг с другом). То и другое облегчает перенос через ядерную оболочку.

2.4. Образование коротких пептидов

Помимо белков, в клетках синтезируются и пептиды. Это может происходит двумя способами:

· путем вырезания из более длинной полипептидной цепи,

· путем прямого безматричного синтеза.

В первом случае в ДНК имеется ген, кодирующий первичную пептидную цепь, которая, как обычно, синтезируется на рибосомах.

В определенных участках этой цепи содержатся аминокислотные остатки, по месту нахождения которых действует специальная протеаза. Это и ведет к высвобождению пептида.

Так синтезируются пептидные гормоны (окситоцин, вазопрессин, нейропептиды) и прочие биологически активные вещества (кинины, ангиотензины и т. д.).

Во втором случае в ДНК нет гена, прямо кодирующего последовательность аминокислот в пептиде. Но зато кодируются специальные ферменты, способные синтезировать пептид.

Образуясь на рибосомах, эти ферменты катализируют цепь реакций, в ходе которых определенные аминокислоты присоединяются друг к другу в определенной последовательности.

У животных и человека так синтезируются очень небольшие пептиды: трипептид глутатион, специфические дипептиды мышечной ткани (карнозин, ансерин) и пр.

У бактерий этот способ синтеза пептидов имеет большее значение. С его помощью образуются пептидные компоненты клеточных стенок, антибиотик грамицидин (циклический декапептид) и другие соединения.

2.5. РАСПАД БЕЛКОВ

В клетках постоянно происходит не только синтез белков, но и их распад.

Причинами такого распада являются:

· Во-первых, белки, как и ДНК, подвергаются «старению» — так или иначе модифицируются под действием свободных радикалов, излучения, тепловых флуктуации и т.д. И если в случае ДНК просто взять и разрушить всю молекулу нельзя, а приходится ее «ремонтировать», то в случае белков легче заменить «старую», поврежденную молекулу на новую.

· Во-вторых, содержание тех или иных белков в клетке или внеклеточной среде не всегда должно быть постоянным. В процессе адаптации к меняющимся условиям жизнедеятельности нередко возникает необходимость в изменении концентрации определенных белков — повышении или снижении. Это осуществляется, как правило, путем соответствующего изменения скорости их синтеза. Но, чтобы последнее эффективно сказывалось на концентрации, должен постоянно происходить распад белковых молекул.

В то же время белки значительно различаются по средней продолжительности жизни своих молекул. Наиболее короткоживущими являются регуляторные белки (например, белок р53, являющийся ключевым транскрипционным фактором).

Структурные белки (например, мышечные) имеют гораздо большую продолжительность жизни. Но и они периодически обновляются. Причем при ряде состояний (недостаточной функции или голодании) распад начинает преобладать над синтезом и мышечная масса снижается.

Многие белки разрушаются в тех же клетках, где и синтезируются. Это большинство внутриклеточных белков.

Но есть и такие белки, которые образуются в одних, а разрушаются в других клетках. В основном, это внеклеточные белки (соединительной ткани, плазмы крови и т. д.). Однако сюда же относятся и некоторые внутриклеточные белки, например гемоглобин. Его синтез происходит в клетках эритроидного ряда (предшественниках эритроцитов), а распад — в макрофагах селезенки, захватывающих «старые» эритроциты.

Как бы ни были пространственно разделены синтез и распад белка, содержание последнего является постоянным (стационарным), если скорости синтеза и распада совпадают.

Так, постоянство содержания гемоглобина в крови обеспечивается тем, что ежесуточно и образуется (в красном костном мозгу), и разрушается (в селезенке) примерно 6,25 г этого белка.

Хотя чаще всего количество белка меняется в результате изменения скорости его образования в результате тех или иных регуляторных воздействий, скорость распада тоже изменяется. Обычно она прямо пропорциональна текущей концентрации белка. Поэтому, например, при повышении скорости синтеза постепенное накопление белка ведет к «автоматическому» росту и скорости распада. Так что в итоге эти скорости вновь уравниваются, и достигается новое стационарное состояние — но на более высоких уровнях концентрации белка и скоростей его обмена. Причем количество белка увеличится ровно во столько раз, во сколько возросла скорость синтеза (а затем и распада).

Относительно того, как и в каких структурах разрушаются белки многое еще остается неясным. Однако известно, что у эукариот распад короткоживущих белков (например, того же белка р53) является убиквитин-зависимым. Убиквитин (Убн) — небольшой белок (76 аминокислотных остатков), который связывается с данными белками и тем самым как бы «метит» их.

Для присоединения Убн к белку-мишени требуются три фермента:

- Убн-активирующий фермент (Е₁), формирующий по С-концу Убн тиоэфирную связь;

- Убн-конъюгирующий фермент (Е₂), принимающий Убн на себя; таких ферментов — целое семейство; из них каждый служит донором Убн для определенных белков;

- Убн-лигаза (Е₃), переносящая Убн с Е₂ на белок; она также представлена различными формами, специфичными в отношении тех или иных белков.

Связывание Убн осуществляется через остатки лизина белка, причем с одной молекулой белка соединяется сразу много молекул Убн. Это происходит по следующим причинам:

- во-первых, в белке может быть несколько остатков лизина;

- во-вторых, последующие молекулы Убн, видимо, могут присоединяться к предыдущим, образуя цепочки.

Помеченные таким образом белки затем быстро разрушаются в специальных частицах — протеосомах.Это мультибелковые цилиндрические структуры, которые содержат многочисленные протеазы.

Вполне возможно, что для рассмотренной системы «безразлично», имеет ли какие-либо дефекты белок, с которым связывается Убн, или нет. Т.е. связывание Убн происходит с любой «попавшейся под руку» молекулой белка соответствующего вида. Такая «беспринципность» обеспечивает требуемый эффект — очень быстрый обмен молекул данного белка в клетке.

Другие белки — с большей продолжительностью жизни — разрушаются в лизосомах.Здесь уже может иметь значение функциональное состояние белка — точнее, состояние его структуры, «диагностируемое» шаперонами. Как уже отмечалось ранее, последние, видимо, участвуют в переносе «старых» белковых молекул в лизосомы.

1. Молекулярная биология клетки: В 5 т.: Пер. С англ./ Б.Албертс, Д.Брей, Д.Льюис и др. - М.: Мир, 1986.

2. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. - М.: МИА, 2003.- 535 с.

3. Рис Э., Стенберг М. Введение в молекулярную биологию. - М.: Мир, 2002.- 141 с.

4. Птицын О.Б. Сворачивание белков: нуклеация и компактные интермедиаты.// Биохимия, 1998.- №63.- С.435-443.

5. Спирин А.С. Молекулярная биология: Структура рибосом и биосинтез белка.- М.: Высш. Школа, 1986.- 302 с.

6. Страйер Л. Биохимия М.: Мир, 1985. Т. 1,3

7. Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. М.:НИИБМХ, 1999.- 372 с.

8. Harper’s Biochemistry: 24-th ed./ R.K.Murray, D.K.Granner, P.A.Mayes, V.W.Rodwell.- Stamford:Appleton@Lange, 1996.- 870 p.

Значение протеиндисульфидизомеразы (ПДИ) в сворачивании белка

Механизм образования нативной структуры белков шаперонами

• Молекулярные шапероны связываются с белками в люмене и обеспечивают образование их нативной структуры.

После того как новообразующиеся полипептиды подверглись переносу и модификации, у них начинает образовываться нативная структура. Образование нативных структур белков представляет собой один из наиболее активных процессов, происходящих в люмене ЭПР, куда постоянно поступают транслоцированные белки.

Поскольку белки, обладающие дефектной нативной структурой, представляют большую опасность для клетки, одна из главных функций ЭПР заключается в контроле за нативной структурой белков, вступающих на секреторный путь. Для этого в ЭПР существует активная система контроля качества, которая распознает нескрученные или неправильно скрученные белки и либо обеспечивает им возможность принять правильную нативную конфигурацию, либо вызывает их деградацию.

Для образования нативной структуры в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) характерны те же проблемы, что и для ее образовании в цитозоле. Движущей силой при формировании нативной структуры белка являются гидрофобные взаимодействия: гидрофобные домены проявляют тенденцию связываться друг с другом, а не оставаться в водном окружении.

Однако гидрофобные домены могут связываться неправильным образом, что приводит к дефектной нативной структуре белка или к его агрегации при взаимодействии с другими белками. In vivo молекулярные шапероны способствуют образованию нативной структуры белка, обеспечивая надлежащее окружение для протекания этого процесса и контроль за его результатами. Структурные перестройки могут повторяться до тех пор, пока белок не приобретет правильную нативную конформацию.

Шапероны в в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) очень активны и составляют основу системы контроля структуры белка. Пока белок связан с шаперонами, он не может выйти из ЭПР и транспортироваться в аппарат Гольджи.

Многие распространенные шапероны ЭПР родственны шаперонам цитозоля. В люмене к числу наиболее полно охарактеризованных шаперонов относится белок BiP, из группы hsp70. Этот белок — самый часто встречающийся в ЭПР и взаимодействует со многими белками на ранних этапах образования их нативной структуры.

Поскольку обычно гидрофобные области скрыты в сердцевине глобулярных белков, присутствие на поверхности молекулы гидрофобных участков свидетельствует о том, что белок полностью не приобрел нативную структуру. Эти участки служат местами связывания BiP с нативной цепью. За счет последовательных циклов гидролиза АТФ BiP неоднократно связывается с новообразующимся белком и высвобождается. Тем самым предупреждается агрегация образующегося белка и облегчается образование им правильной нативной структуры.

На активность BiP в качестве шаперона влияют дополнительные белки, стимулирующие гидролиз АТФ, а также белки, способствующие обмену АДФ на АТФ. Возможно, что таким образом, в зависимости от потребностей клетки, может регулироваться скорость образования нативной структуры белка. После того как белок образовал компактную структуру, гидрофобные участки которой находятся внутри, связывание BiP прекращается. Очень высокое содержание BiP в люмене ЭПР позволяет предполагать, что он является одним из первых шаперонов, с которыми встречается большинство новообразующихся белков, и что при попытке формирования нативной структуры поблизости всегда оказываются молекулы BiP.

Данный белок с самого начала участвует в этом процессе и играет основную роль в облегчении скручивания белковой цепи.

К другим шаперонам, содержащимся в люмене и цитозоле, относится белок Grp94, принадлежащий к семейству hsp90. Хотя этот белок, так же как и BiP, находится в люмене в больших количествах, в отличие от последнего он связывается с белками, которые уже частично приобрели нативную структуру, а не с теми, которые только что вышли в люмен и таковой не обладают. Grp94 взаимодействует с меньшим количеством субстратов, чем BiP, и неизвестно, какое свойство белка он узнает.

Вероятно, функция его в основном заключается в том, чтобы способствовать эффекту BiP и других шаперонов, участвующих в формировании нативной структуры. Существование белка Grp94 служит показателем того, что контроль качества образования нативной структуры белковой цепи носит многоуровневый характер.

BiP связывается с открытыми гидрофобными областями транслоцированных белков.
После приобретения белком нативной структуры его гидрофобные участки оказываются в глубине и более недоступны для BiP.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Механизм возвращения в цитозоль и деградации неправильно свернутых белков клетки - ERAD

• Транслоцированные в ЭПР белки могут экспортироваться обратно в цитозоль, где они подвергаются убиквитинилированию и деградации протеосомами — процесс известный как деградация, связанная с ЭПР.

• Белки возвращаются в цитозоль путем ретроградной транслокации, механизм которой менее понятен, чем механизм транслокации в ЭПР.

Такие белки должны каким-то образом деградировать. Одним из путей решения этой проблемы служит использование ретроградной транслокации (иногда называемой дислокация или ретротранслокация) для экспорта неправильно собранных белков обратно в цитозоль. Там они взаимодействуют с убиквитином и деградируют с участием больших протеазных комплексов, протеосом. Этот путь деградации называется — деградация, связанная с ЭПР (ERAD).

Открытие этого пути последовало после понимания того факта, что белки, обладающие неправильной нативной структурой, не накапливаются в ЭПР, а деградируют. Первоначально предполагалось, что деградация происходит в самом ЭПР, однако, несмотря на тщательные поиски, в этой органелле не были обнаружены соответствующие протеазы. Вместо этого начали появляться данные о том, что белки деградируют под действием протеаз, содержащихся в цитозоле.

Вначале было показано, что химические ингибиторы протеосом блокируют деградацию вновь синтезированного интегрального мембранного белка (CFTR, или регулятор трансмембранного переноса при кистозном фиброзе). Эти данные позволили предположить, что белки должны экспортироваться из ЭПР до деградации. В дальнейшем было показано, что ингибирование функций протеосом приводит к накоплению в цитозоле полностью транслоцированных белков.

Каким образом белок отбирается для ERAD? В отличие от процесса транслокации в ЭПР сигнальная последовательность на белке для его направления на деградацию отсутствует. Скорее всего, при ERAD распознаются какие-то свойства, которые отличают белки с неправильной структурой от белков, обладающих нативной конформацией или временно не имеющих правильной структуры высшего порядка.

Например, мутация, которая дестабилизирует нативную структуру белка, может вызывать ее деградацию. Фактически мутировавший белок может быть признан субстратом для ERAD, даже если мутация мало повлияла на его функцию. Даже белки, не обладающие заметными дефектами структуры, могут быть отобраны для ERAD, что свидетельствует о существовании скрытых, неизвестных нам признаков, которые, однако, узнаются клеткой.

Рисунок ниже иллюстрирует основные этапы ERAD. Первый этап отбора белка для ERAD — это обнаружение неправильной структуры. Хотя мы и не знаем, каким образом это происходит, возможно, что существенную роль здесь играют шапероны. Однако ассоциация с шаперонами не может являться единственным критерием отбора белка для ERAD, поскольку шапероны участвуют в организации конформации всех новообразующихся белков. Не исключено, что сигнал к ретроградной транслокации зависит от промежутка времени, в течение которого белок находится в связанной с шаперонами форме.

При ретроградной транслокации белки с неправильной нативной структурой возвращаются из люмена эндоплазматического ретикулума (ЭПР) обратно в его мембрану и в цитоплазму.
Там они подвергаются деградации в протеосомах. По-видимому, определенную роль в переадресовании играют шапероны люмена,
поскольку они должны связываться с белками, обладающими неправильной нативной структурой.

Шапероны остаются в связанной форме до тех пор, пока белок не приобретет нативную структуру. Если образование такой структуры невозможно, то белок дольше, чем обычно, будет оставаться связанным с шаперонами. Впрочем, вообще не ясно, каким образом продолжительность связи белка с шаперонами дает сигнал к ретроградной транслокации. В случае неправильной структуры гликопротеинов фермент а-маннозидаза I отщепляет маннозу и тем самым дает сигнал к деградации белка. Не ясно, однако, что служит сигналом к отщеплению маннозы.

После отбора белка для ретроградной транслокации, он должен пройти через мембрану ЭПР. Многочисленные генетические и биохимические данные позволяют предполагать, что роль канала ретроградной транслокации выполняет комплекс Sec61p. В некоторых случаях, однако, ретроградная транслокация не зависит от Sec61, и поэтому возникает вопрос о природе канала или даже о наличии нескольких каналов, специфичных для различных типов белков, обладающих неправильной структурой. Независимо от природы канала, для ретроградной транслокации надо выполнять те же шаги, как и для прямой транслокации.

Для того чтобы прошел экспорт, белок должен вначале попасть в канал, канал должен открыться, и затем — белок пройти через него в цитозоль.

Большинство белков направляются на деградацию только после завершения транслокации. Неизвестно, остаются ли эти белки поблизости от транслокона, пока не разрешится вопрос об их деградации. Также неизвестно, каким образом неправильно скрученные белки попадают в канал ретроградной транслокации. Фактически вырисовывающаяся картина позволяет предполагать, что путь, по которому направляется субстрат из ЭПР, и белки цитозоля, необходимые для деградации, сильно зависят от типа деградируемого белка и от того, где в нем располагается неправильно скрученная область.

Не исключено, что растворимые и трансмембранные белки деградируют по крайней мере частично отличающимся друг от друга путями и что среди трансмембранных белков эти пути зависят от положения мутации в домене люмена или цитозоля.

Как только белок оказался в ретроградном транслоконе, он, вероятно, начинает проходить через канал под действием сил цитозоля. Убиквитинилирование играет роль в экспорте многих (хотя и не всех) субстратов. Большинство субстратов деградации подвергается полиубиквитинилированию, и убиквитинилирование происходит, пока они еще находятся в связанном с мембраной состоянии. Мутации в каком-либо компоненте системы убиквитина приводят к образованию в ЭПР агрегатов, состоящих из белков неправильной структуры. Это позволяет предполагать, что канал блокируется в случае, когда субстрат не может модифицироваться.

Однако одного убиквитинилирования недостаточно для перехода белков в цитозоль. Также необходимо присутствие АТФазы цитозоля (р97 Cdc48 у дрожжей), которая связывается с мембраной ЭПР, при этом р97 связывает цитозольные кофакторы, которые прямо соединяются с субстратом ERAD. Пока неясно, каким образом эта АТФаза приводит к высвобождению субстрата в цитозоль, но аналогичные АТФазы бактерий и митохондрий непосредственно связываются с интегральными мембранными белками и извлекают их из мембраны. Не исключено, что АТФаза, требующаяся для ретротранслокации, действует аналогичным образом, связываясь или непосредственно с субстратом, или с присоединенным к нему остатком убиквитина и вытягивая белок из канала в цитозоль. Пока неизвестно, какую роль играет протеосома в процессе ретроградной транслокации.

Еще одним ключевым компонентом системы ERAD является небольшой мембранный белок дерлин. Этот белок необходим для ретроградной транслокации некоторых белков, обладающих неправильной структурой. Показано, что он взаимодействует как с неправильно скрученным белком в ЭПР, так и с р97 через связывание с белком VIMP. Поэтому дерлин представляет собой, по крайней мере, один компонент молекулярного «моста» между люменом ЭПР и аппаратом деградации цитозоля, хотя, конечно, существуют и другие.

Как иллюстрирует рисунок ниже, в некоторых случаях белки могут отбираться для деградации даже до завершения их транслокации в ЭПР. Это используется для особенно больших субстратов для того, чтобы избежать затрат энергии на транслокацию белка целиком, если он начинает принимать неправильную конфигурацию уже в самом начале синтеза. Отбор белков для ретроградной транслокации в процессе их импорта позволяет не помечать их повторно. Наилучшим примером этому является деградация аполипопротеина В. Это очень большой секретируемый белок, который на первом шаге сборки липопротеинов низкой плотности связывается с липидами люмена ЭПР и жирными кислотами.

Неспособность фермента люмена ЭПР переносить липиды на аполипопротеин В по мере транслокации вызывает начало деградации белка до момента завершения его синтеза и транслокации.

Когда белки достигают цитозоля, они обычно узнаются и деградируют. Однако в некоторых случаях экспортируемые белки подвергаются агрегации в цитоплазме. При этом белки накапливаются в цитоплазме в специальных образованиях, которые называются агресомы. Они способны сохранять для деградации большие количества белка.

Исследование ERAD еще только начинается. Очевидно, в этом процессе участвует больше компонентов, чем известно на сегодняшний день, и его молекулярные основы исследованы пока недостаточно. Сюда относятся фундаментальные вопросы, связанные с распознаванием белков, обладающих неправильной структурой. Выяснение деталей этих процессов позволит реконструировать их in vitro.

Деградация некоторых белков начинается до того момента, как они полностью транслоцировались.
Когда белок отобран для деградации, в цитоплазме начинают накапливаться и убиквитироваться фрагменты его цепи.

• Протеин-дисульфид-изомераза катализирует образование дисульфидных связей и процессы молекулярной перегруппировки в ЭПР.

Поскольку белки BiP и Grp94 находятся и в цитозоле, система специальных шаперонов должна также присутствовать в люмене ЭПР. Особенно важно, что белки были способны образовывать дисульфидные связи по мере необходимости. Образование дисульфидных связей является следствием окислительного окружения, характерного для люмена ЭПР и для внеклеточной среды.

Дисульфидные связи возникают между цистеиновыми остатками при сворачивании белковой молекулы (хотя они иногда образуются также и между различными белками). Процесс катализируется семейством ферментов, нозываемых протеиндисульфидизомеразы (ПДИ). Как показано на рисунке ниже, эти ферменты могут образовывать не только надлежащим образом ориентированные дисульфидные связи, но часто в процессе скручивания образуют неправильные связи.

Это приводит к возникновению неправильной конформации молекулы или даже к ее агрегации, если связи не могут занять правильное положение. В таких случаях ПДИ катализирует перегруппировку и образование новых дисульфидных связей. Таким образом, этот фермент и другие тиоловые изомеразы обеспечивают молекулам насцентных белков необходимую гибкость, снимая ограничения, возникающие из-за дисульфидных связей.

Протеиндисульфидизомераза (ПДИ) катализируют образование дисульфидных связей при участии цистеиновых остатков, находящихся в собственном активном центре. Образование дисульфидной связи представляет собой окислительновосстановительную реакцию, при которой происходит обмен электронов между цистеиновыми остатками белка и ПДИ. Для того чтобы началась реакция, катализируемая ПДИ, остатки цистеина в ферменте должны находиться в окисленном состоянии (в виде дисульфидной связи).

Также должна присутствовать система их последующего окисления. Вначале предполагалось, что повторное окисление ПДИ происходит с участием небольшой молекулы глутатиона. Окисленная форма глутатиона селективно импортируется в люмен ЭПР и поддерживает ПДИ в окисленной форме. Однако недавно было показано, что, по крайней мере в некоторых белках, дисульфидные связи могут образовываться и перегруппировываться даже при отсутствии глутатиона.

Сейчас кажется очевидным, что белок ЭПР, называемый Ero1p, главным образом отвечает за окисление ПДИ, хотя, возможно, определенную роль все-таки играет глутатион.

Эта реакция схематически показана на рисунке ниже. Сам Ero1p, вероятно, окисляется с участием флавинаденин динуклеотида (ФДД).

Как показано на рисунке ниже, ПДИ использует другой механизм изомеризации существующих дисульфидных связей в неправильно скрученном белке. В этой реакции один из остатков цистеина в активном сайте ПДИ образует временную дисульфидную связь с цистеиновым остатком неправильно скрученного белка. Пока существует эта связь, образование нативной структуры может продолжаться, несмотря на связь с ПДИ. Когда белок принимает конформацию, при которой возможно образование другой дисульфидной связи, связь с ПДИ разрывается. Каким образом ПДИ контролирует правильность образования дисульфидной связи и прекращает взаимодействовать с белком, пока неизвестно.

Возможно, что плотная упаковка полипептидной цепи в правильно уложенном белке делает его дисульфидные связи недоступными для ПДИ. Наряду с оксидазным и изомеразным действием, ПДИ может действовать как шаперон, активность которого регулируется степенью его окисления.

Хотя ИДИ является наиболее изученной тиолизомеразой и экспрессируется практически во всех тканях, известно много других типов шаперонов, содержащихся в люмене ЭПР, которые функционируют по окислительно-восстановительному принципу. Возможно, что некоторые или даже большинство из них обладают специфичностью по отношению к определенному типу клеток или даже субстратов. Интересно, что к этому семейству также относится белок ERdj5, способный также стимулировать гидролиз АТФ под действием BiP. Поэтому не исключено, что ERdj5 служит связующим звеном между процессами образования нативной структуры с участием белка BiP и перегруппировкой дисульфидных связей.

При попытке транслоцированного белка приобрести нативную структуру могут образоваться неправильные дисульфидные связи.
Эти связи должны узнаваться и замениться на правильные до поступления белка в аппарат Гольджи. Дисульфидная связь в ПДИ используется для образования связи в новообразующемся полипептиде.
После этого фермент регенерирует дисульфидную связь в ПДИ, так что этот механизм может использоваться многократно. Белок Ero1 содержит дисульфидную связь, которая используется в реакции дисульфидного обмена при регенерации ПДИ.
После окончания реакции дисульфидная связь в Ero1p регенерируется за счет протекания другой реакции, которая не требует ПДИ. В процессе сворачивания белка неправильные дисульфидные связи могут узнаваться ПДИ.
После соединения с ПДИ эти связи удаляются, и белок продолжает созревать до тех пор, пока за счет дисульфидного обмена в нем не образуется другая связь.
Обратите внимание, что белок созревает, находясь в связанном с ПДИ состоянии.

Модели сворачивания белков.

Предложена в 1972 г О.Б. Птицыным. В соответствии с этой моделью фолдинг белка осуществляется в несколько стадий.

1.Случайный клубок – нет ни вторичной ни третичной структур, пептидная цепь развернута.

2. Состояние-предшественник расплавленной глобулы – вторичная структура сформирована не до конца, третичная структура отсутствует, цепь частично развернута.

3.Расплавленная глобула – вторичная структура полностью сформирована, цепь свернута в компактную глобулу, но жесткая третичная структура отсутствует.

4.Нативный белок – цепь свернута в компактную глобулу, которая имеет определенную третичную структуру.

Исходной формой глобулярного белка непосредст-венно после трансляции явля-ется случайный клубокили развернутая цепь. Развернутая не означает растянутая. Если исключить все взаимодействия между аминокислотными остатками в пептидной цепи кроме пептидных связей, то термодинамически наиболее выгодным состоянием цепи будет рыхлый клубок. Чтобы растянуть этот клубок и выпрямить необходимо прило-жить силу. После прекращения действия силы цепь вновь возвращается в наиболее вероятное состояние клубка. Т.е. такой белок подобно каучуку обладает эластично-стью его можно назвать каучукоподобны.

Затем формируется вторичная структура и на следующем этапе - коллапсирование (сжимание) белка в т.н. расплавленную глобулу. Движущей силой сжатия является взаимодействия между радикалами аминокислот. Принципиальное отличие расплавленной глобулы от нативной структуры в том, что в этой глобуле аминокислотные радикалы еще не нашли своих окончательных партнеров не заняли «правильного» положения, а взаимодействуют «с кем придется». Поэтому общее количество одновременно существующих связей относительно невелико и связи, а с ними и конфигурация молекулы, неустойчивы. В конце концов, белок находит термодинамически наиболее оптимальную структуру, при которой между радикалами образуется максимально возможное количество связей. В случае достаточно большого белка вначале формируется структура доменов, и потом они занимают правильное положение друг относительно друга. Позже всего происходит связывание мономеров в олигомеры (если нативный белок состоит из нескольких субъединиц).

1.2.2. Сворачивание по принципу «все или ничего».

В отличие от вышеизложенного, у очень маленьких белков (до 100 аминокислотных остатков) промежуточные стадии (расплавленная глобула и состояние-предшественник) отсутствуют и фолдинг фактически проходит по принципу «все или ничего».

Действительно, из-за малого числа аминокислотных остатков «неправильные» взаимодействия, лежащие в основе расплавленной глобулы, практически не случаются. Поэтому нет феномена коллапсирования (сжатия) клубка до образования нативной третичной структуры.

В этих случаях фолдинг происходит следующим образом. Развернутая пептидная цепь в течение достаточно длительного времени флуктуирует без образования контактов между аминокислотными остатками — просто потому, что способные к взаимодействию остатки не сближаются друг с другом.

Затем случайно цепь достигает состояния, в котором может образоваться несколько «правильных», или нативных, контактов. Тем самым как бы появляется ядро сворачивания (ядро нуклеации).

После этого фолдинг завершается очень быстро. Наличие нескольких «правильных» связей удерживает цепь в такой конфигурации, в которой легко находят друг друга остальные «правильные» пары.

Хорошо изученным белком с подобным механизмом фолдинга является химотрипсиновый ингибитор 2 (белок СI2), включающий 65 аминокислотных остатков. Во вторичной структуре он имеет одну a-спираль и пять тяжей b -структуры (b₁, . b₅). Критическим моментом фолдинга этого белка служит образование a-спирали и тяжей b₄, b₅, а также гидрофобное взаимодействие трех аминокислотных остатков в составе этих элементов — Ала₁₆ (a-спираль), Лей₄₉ (b₄) и Иле₅₉ (b₅). Это и означает формирование ядра нуклеации.

1.2.3. Феномен кооперативности

В обеих изложенных моделях фолдинга очень важную роль играет феномен кооперативности. Суть его в том, что образование одной или нескольких «правильных» связей резко ускоряет замыкание других нативных связей.

На этом, по существу, построено представление о ядре нуклеации. И таков же, очевидно, механизм каждой стадии фолдинга более крупных белков - например, превращения расплавленной глобулы в нативную структуру.

Продемонстрируем значение данного феномена на следующем примере.

Пусть белок включает п = 100 аминокислотных остатков и нативная конформация включает 50 пар строго определенных взаимодействий остатков.

При этих условиях общее число всевозможных комбинаций попарных взаимодействий равно произведению нечетных чисел до n: в данном случае - 3х5х. х97х99 = 3·10 78 .

Если представить, что в секунду перебирается 10 13 различных комбинаций, то в отсутствие эффекта кооперативности среднее время поиска нативной конформации составляло бы 4,5·10 57 лет! Что исключает саму возможность не только фолдинга хотя бы одной молекулы белка, но и образования жизни на Земле.

Теперь фолдинг того же белка рассмотрим с учетом феномена кооперативности.

Пусть его вторичная структура включает 5 a-спиральных участков примерно по 20 аминокислотных остатков. Спирализация каждого такого участка поначалу представляет собой свободный перебор всех возможных 190 пар взаимодействия групп —NН₂— и —СО—. Из них «правильных» пар -16.

Даже при относительно небольшой скорости перебора в 10 6 пар в секунду требуются ничтожные доли секунды (порядка 10 -5 с), чтобы образовалась хотя бы одна «правильная» связь.

Дальше действует эффект кооперативности: от этой связи в обе стороны рассматриваемого участка пептидной цепи с большой скоростью (10 9 пар/с) начинают замыкаться остальные «правильные» связи a-спирали. Продолжительность этой стадии еще на несколько порядков меньше (около 10 -8 с.) чем первой — лимитирующей — стадии.

В итоге спирализация всего участка укладывается практически в те же доли секунды (порядка 10 -5 с), что занимал поиск одной «правильной» связи.

Причем, поскольку все 5 участков спирализуются независимо друг от друга, то за то же время происходит формирование всей вторичной структуры белка.

На этапе образования третичной структуры взаимодействуют радикалы аминокислот, находящихся в разных элементах вторичной структуры (в нашем случае — в разных a-спиралях); взаимодействия же в пределах одного элемента невозможны. Данное обстоятельство само по себе уменьшает количество взаимодействий. Но еще выше роль эффекта кооперативности.

Можно найти, что общее число межрадикальных пар (исключая пары в пределах одной a-спирали) равно 4000. Пусть замыкание из них двух определенных связей имеет критическое значение (подобно образованию ядра нуклеации в случае маленьких белков). При той же скорости перебора, что при образовании вторичной структуры (10 6 пар/с), на поиск этих связей уходит порядка 10 -3 с.

Остальные связи, благодаря кооперативности, замыкаются гораздо быстрее.

В итоге весь фолдинг белка вместо бесконечного количества лет занимает время меньше секунды. В крайнем случае, для крупных белков со сложной структурой, он укладывается в несколько минут.

1.2.4. Отношение фолдинга к трансляции

Когда происходит фолдинг новых белков — еще в ходе трансляции, лишь по ее окончании, или он столь протяженен, что охватывает и трансляцию, и последующее время?

Известный биохимик А. С. Спирин отстаивает представление о ко-трансляционном сворачивании белков. Согласно ему, фолдинг полипептидной цепи происходит по мере ее роста на рибосоме в направлении от N- к С-концу.

В качестве доказательства приводятся три экспериментальных факта.

а) Фермент ПДИ катализирующий перемещение в новосинтезируемых белках дисульфидных связей, для правильного замыкания этих связей должен присутствовать во время трансляции.

Если его добавить в белоксинтезирующую смесь, составленную in vitro, позже, у белка оказывается неправильная структура и он лишен активности. Это продемонстрировано на примере одной из цепей иммуноглобулина.

б) При синтезе белковых субъединиц гемоглобина они приобретают способность связывать гем еще до окончания трансляции — по достижении примерно двух третей своей полной длины.

Следовательно, гем-связывающий центр формируется во время трансляции.

в) Фермент светлячков люцифераза после денатурации восстанавливает свою активность весьма долго. В то же время он оказывается активным сразу после образования на рибосоме. Значит, и в этом случае фолдинг произошел во время трансляции.

Пока трудно сказать, не допускают ли эти результаты какой-либо другой интерпретации, а если нет, то насколько они являются общими.

Более вероятно, что для одних белков фолдинг, действительно, является только ко-трансляционным, а для других — и ко-, и пост-трансляционным процессом.

Читайте также: