Выявление метициллинрезистентных стафилококков. Определение чувствительности к антибиотикам у анаэробных бактерий.

Обновлено: 15.04.2024

1.1 . В настоящих методических указаниях представлена информация о роли метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка в возникновении внутрибольничных инфекций, их микробиологических и эпидемиологических особенностях, изложены традиционные и молекулярно-генетические методы идентификации и типирования.

1.2 . Методические рекомендации разработаны в помощь специалистам органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и лечебно-профилактических учреждений, осуществляющих организацию и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий по борьбе с внутрибольничными инфекциями.

2. Нормативные ссылки

2.1 . Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52-ФЗ от 30 марта 1999 г. (с изменениями от 30 декабря 2001 г., 10 января, 30 июня 2003 г., 22 августа 2004 г.)

2.2 . Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.

2.3 . Постановление № 3 от 05.10.2004 г. «О состоянии заболеваемости внутрибольничными инфекционными болезнями и мерах по их снижению».

2.4 . Методические указания МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПНР».

2.5 . Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

3. Общие сведения

В последнее десятилетие проблема внутрибольничных инфекций (ВБИ) приобрела исключительно большое значение для всех стран мира. Это обусловлено, прежде всего, значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов. Несмотря на значительный недоучет, в Российской Федерации ежегодно регистрируется около 30 тыс. случаев внутрибольничных инфекций, при этом минимальный экономический ущерб составляет более 5 млрд. рублей ежегодно. Среди возбудителей ВБИ одно из первых мест, по-прежнему, принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus , наиболее патогенным представителем которого является S . aureus . Эпидемиологическая ситуация осложняется в связи с широким распространением в стационарах, а также появлением и во внебольничной среде, клинических изолятов S.aureus, устойчивых к оксациллину (ORSA или MRSA). MRSA способны вызывать разнообразные клинические формы внутрибольничных инфекций, включая наиболее тяжелые, такие как: бактериемия, пневмония, синдром септического шока, септический артрит, остеомиелит и другие, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения. Появление осложнений, вызванных MRSA, приводит к увеличению сроков госпитализации, показателей летальности, значительным экономическим потерям. Показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах различных стран мира, обусловлен распространением эпидемических штаммов MRSA, многие из которых способны вырабатывать пирогенные токсины - суперантигены, подавляющие иммунный ответ на S . aureus.

С конца 90-х годов прошлого века в стационарах России отмечается рост частоты выделения MRSA, которая в ряде больниц достигла 30 - 70 %. Это делает неэффективным использование многих антимикробных препаратов и существенно ухудшает качество оказания медицинской помощи населению. В этих условиях совершенствование методов эпидемиологического и микробиологического мониторингов, направленных на выявление эпидемически значимых штаммов, приобретает все более актуальное значение.

4. Характеристика MRSA как возбудителей внутрибольничных инфекций

4.1. Таксономия и биологические особенности

4.2. Клиническое значение

В настоящее время MRSA являются ведущими возбудителями внутрибольничных инфекций в стационарах многих странах мира. Частота их выделения в стационарах США, Японии, многих стран Западной Европы достигает 40 - 70 %. Исключение составляют, по-видимому, только ряд скандинавских стран, где исторически были приняты жесткие противоэпидемические меры по контролю за распространением таких штаммов. В стационарах Российской Федерации частота выделения MRSA колеблется от 0 до 89 %. Наибольшая частота выделения отмечается в реанимационных, ожоговых, травматологических и хирургических отделениях стационаров, расположенных в крупных городах. Одной из основных причин этой закономерности является концентрация в таких стационарах пациентов с нарушениями целостности кожных покровов и поврежденными иммунологическими барьерами. Наиболее частым местом локализации инфекции являются послеоперационные и ожоговые раны и дыхательные пути. Первичные и вторичные бактериемии наблюдаются примерно у 20 % инфицированных больных. В случае инфицирования ожоговых больных частота бактериемии нередко возрастает до 50 %. Факторами, способствующими развитию бактериемии, является присутствие центрального венозного катетера, анемия, гипотермия и назальное носительство. Развитие бактериемии значительно увеличивает вероятность летального исхода. Особенно высокая смертность, обусловленная бактериемией, наблюдается среди пациентов, находящихся в ожоговых и отделениях интенсивной терапии, где она может достигать 50 % по сравнению с 15 % в контрольной группе. Риск развития летального исхода возрастает почти в три раза среди пациентов, у которых бактериемия обусловлена MRSA по сравнению с пациентами, инфицированными метициллинчувствительными штаммами S . aureus. Развитие госпитальной бактериемии приводит к значительному увеличению стоимости госпитализации. В современных условиях лечение таких пациентов требует, как правило, внутривенного введения ванкомицина, тейкопланина или линезолида, однако клиническая эффективность этих препаратов нередко оказывается значительно ниже, чем у антибиотиков, используемых для лечения пациентов с осложнениями, вызванными метициллинчувствительными S.aureus. По данным Центра по контролю за заболеваниями (США) средняя продолжительность пребывания пациента в больнице в случае хирургического вмешательства составляет 6,1 дня, тогда как при возникновении осложнений, вызванных MRSA она увеличивается до 29,1 дней, при этом средние расходы возрастают с 29455$ до 92363$ в пересчете на каждый случай. Заболевания, вызванные MRSA, могут начинаться на фоне терапии антибиотиками, в том числе аминогликозидами и цефалоспоринами. В этой связи необходимо отметить, что неадекватное назначение антибиотиков в случае тяжелых ВБИ драматически ухудшает прогноз заболевания. Летальность при осложнениях, вызванных MRSA, значительно колеблется и зависит как от возраста пациента, сопутствующего заболевания (артериальная гипертензия, диабет и др.), так и от присоединения дополнительной микрофлоры. Наиболее распространенными вторичными проявлениями инфекции, обусловленной MRSA, являются эндокардиты, гематогенный остеомиелит, септический артрит. Одним из наиболее грозных осложнений, вызываемых MRSA, является синдром токсического шока (СТШ). Клинические проявления СТШ включают следующий симптомокомплекс: гипертермия, сыпь, рвота, диарея, гипотензия, генерализованный отек, острый респираторный дистресс синдром, полиорганная недостаточность, диссеминированная интраваскулярная коагуляция. СТШ может развиться как осложнение после родов, хирургических вмешательств, при суперинфицировании S . aureus трахеальных повреждений, вызванных вирусом гриппа. Недавно описанные стафилококковая скарлатина и синдром упорной десквамации эпителия рассматривают как варианты СТШ.

4.3. Факторы патогенности и вирулентность

Многие эпидемические штаммы MRSA продуцируют пирогенные токсины, обладающие суперантигенной активностью (PTSAgs), к числу которых принадлежат энтеротоксины А, В, С и токсин синдрома токсического шока (TSST-1). Взаимодействуя с вариабельной областью b -цепи рецепторов Т-клеток PTSAgs активируют значительную популяцию (10 - 50 %) Т-лимфоцитов, что приводит к выбросу большого количества цитокинов. Суперантигены способны разрушать эндотелиальные клетки и могут элиминировать нейтрофилы из очагов воспаления. Они являются причиной или осложняют патогенез острых и хронических заболеваний человека таких, как септический шок, сепсис, септические артриты, гломерулонефрит, и некоторых других. Неменструальный синдром токсического шока может быть ассоциирован не только со штаммами-продуцентами TSST-1, но и со штаммами, продуцирующими энтеротоксины А, В и С. Следует иметь ввиду, что распознавание постхирургического токсического шока нередко бывает затруднено вследствие отсутствия характерных для золотистого стафилококка признаков нагноения в области хирургической раны. Отмечена корреляция между сенсибилизацией стафилококковыми энтеротоксинами А и В и тяжестью течения таких заболеваний, как аллергический ринит, атопический дерматит, бронхиальная астма, реактивные артриты. Гены, детерминирующие синтез PTSAgs , могут находиться на мобильных генетических элементах (бактериофагах «островах патогенности») в составе хромосомы MRSA .

Вопрос о вирулентности MRSA остается дискутабельным. Они практически не вызывают заболевания у здоровых лиц из числа медицинского персонала. Вместе с тем, в многочисленных исследованиях показано, что прогноз при тяжелых формах внутрибольничных инфекций, таких как пневмония и бактериемия, значительно хуже среди пациентов, инфицированных MRSA, по сравнению с пациентами, инфицированными метициллинчувствительными S.aureus.

4.4. Генетический контроль устойчивости к метициллину и особенности фенотипической экспрессии

Мишенью действия b -лактамных антибиотиков (как пенициллинов, так и цефалоспоринов) являются транс- и карбоксипептидазы - ферменты, участвующие в биосинтезе основного компонента клеточной стенки микроорганизмов - пептидогликана. Благодаря своей способности связываться с пенициллином и другими b -лактамами данные ферменты получили название пенициллинсвязывающих белков (ПСБ). У Staphylococcus aureus имеются 4 ПСБ, отличающиеся как по молекулярной массе, так и по функциональной активности. Устойчивость метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка (MRSA) к b -лактамным антибиотикам обусловлена продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего протеина - ПСБ-2 ¢ , отсутствующего у чувствительных микроорганизмов. При подавлении В -лактамным антибиотиком активности основных пенициллинсвязывающих белков ПСБ-2 ¢ , в силу своего более низкого сродства к препаратам данной группы, продолжает функционировать и сохраняет микробной клетке жизнеспособность. Синтез ПСБ-2 ¢ кодируется геном mec A , расположенным на хромосоме S.aureus, в специфической области, обнаруживаемой только у метициллинрезистетных штаммов стафилококка - тес ДНК. Ме c ДНК представляет новый класс мобильных генетических элементов, который получил название стафилококковая хромосомная кассета тес (Staphylococcal chromosomal cassette тес = SCCmec ). Выявлено существование 4 типов SCCmec , различающихся как размерами (от 21 до 66 т.п.н.), так и набором генов, составляющих данные кассеты. Разделение на типы основано на различиях в генах, образующих собственно комлекс тес, и в наборе генов, кодирующих рекомбиназы сс rА и сс r В, входящих в различных сочетаниях в стафилококковую хромосомную кассету (рис. 1 ). Комлекс тес может включать: тесА - структурный ген, детерминирующий синтез ПСБ-2 ¢ ; mec I - регуляторный ген, влияющий на транскрипцию тесА; mecR1 - ген, передающий внутрь клетки сигнал о наличии в среде b -лактамного антибиотика; а также инсерционные последовательности IS 431 и IS 1272. В настоящее время известны 4 варианта комплекса тес (рис. 2 ).

Кроме того, различия между типами кассет тес обусловлены присутствием ряда дополнительных генов, расположенных в генетических областях J1а, J 1 b.


Рис. 1. Типы SCCmec.

Генетическая структура комплексов тес различных классов

• Класс A, IS431 - mecA-mecR1-mec1

• Класс В , IS431 - mecA- D mec R1-IS1272

• Класс С , IS431 - mecA- D mec R1-IS431

• Класс D, IS431 - mec A- D mec R 1

Рис. 2. тесА - структурный ген, детерминирующий синтез ПСБ-2 ¢ ;

mecI - регуляторный ген, влияющий на транскрипцию тесА;

mecR1 - ген, передающий внутрь клетки сигнал о наличии в среде b -лактамного антибиотика; IS431 и IS1272 - инсерционные последовательности

Уникальность метициллинрезистентности заключается также и в существовании феномена гетерорезистентности, суть которого состоит в том, что в условиях инкубации при 37 °С не все клетки популяции проявляют устойчивость к оксациллину. Генетический контроль феномена гетерорезистентности до настоящего времени полностью не выяснен. Известно только, что на экспрессию устойчивости могут влиять регуляторные гены b -лактамазы, а также ряд дополнительных генов, так называемые fem (factors essential for methicillin resistance) или aux, локализованные в различных частях хромосомы S.aureus, вне SCCmec . Сложность регуляции проявляется в фенотипических различиях. Выделяют 4 стабильных фенотипа (класса) резистентности. Первые три класса являются гетерогенными. Это означает, что в популяциях стафилококков, относящихся к этим классам, присутствуют субпопуляции микробных клеток с разным уровнем резистентности. При этом клоны стафилококков, получаемые из изолированных колоний (образовавшихся при рассеве первичной культуры) по популяционному составу полностью совпадают с исходной культурой.

Класс 1. Рост 99,99 % клеток подавляется оксациллином в концентрации 1,5 - 2 мкг/мл, рост 0,01 % микробов подавляется только при 25,0 мкг/мл.

Класс 2. Рост 99,9 % клеток подавляется при концентрации оксациллина 6,0 - 12,0 мкг/мл, тогда как рост 0,1 % микробов подавляется при концентрации > 25,0 мкг/мл.

Класс 3. Рост 99,0 - 99,9 % клеток подавляется при концентрации 50,0 - 200,0 мкг/мл и только рост 0,1 - 1 % микробной популяции подавляется при концентрации оксациллина 400,0 мкг/мл.

Класс 4. Представители этого класса характеризуются гомогенным уровнем устойчивости, который превышает 400,0 мкг/мл для всей популяции.

В связи с наличием гетерогенности по устойчивости к оксациллину могут возникать трудности при идентификации MRSA традиционными микробиологическими методами.

4.5. Особенности эпидемиологии MRSA

С помощью различных молекулярно-генетических методов типирования установлено, что глобальное распространение MRSA носит эпидемический характер. В отличие от метициллинчувствительных S.aureus, подавляющее большинство клинических изолятов MRSA принадлежат к ограниченному числу генетических линий или клонов. Выявленные в разных стационарах различными группами исследователей они первоначально получили и разные названия (табл. 1). Так, эпидемические штаммы EMRSA-1 - EMRSA-16 были впервые идентифицированы английскими исследователями, а эпидемические клоны: Иберийский, Бразильский, Японо-Американский, педиатрический - группой американских исследователей под руководством G . de Lencastre. Следует иметь в виду, что четкой градации между понятиями эпидемический штамм и эпидемический клон не существует. Согласно обычно используемой терминологии, эпидемическим считается штамм, вызвавший три и более случая заболеваний среди пациентов нескольких стационаров. Эпидемический клон - это эпидемический штамм, распространившийся в стационарах стран различных континентов. Вместе с тем, многие из первоначально идентифицированных в Великобритании эпидемических штаммов стали фактически эпидемическими клонами в силу своего широкого географического распространения. Использование для типирования метода секвенирования внутренних фрагментов 7 «housekeeping» генов, т.е. генов, ответственных за поддержание жизнедеятельности микробной клетки (метод мультилокусного секвенирования), позволило установить принадлежность этих многочисленных клонов всего лишь к 5 филогенетическим линиям или клональным комплексам: СС5, СС8, СС22, СС30, СС45. Внутри клональных комплексов возможно подразделение на группы или сиквенс-типы, которые различаются 1 - 3 мутациями или рекомбинациями в структуре секвенированных генов. Установлена довольно жесткая взаимосвязь между принадлежностью MRSA к определенному генетическому «бэкграунду» и содержанием определенного типа тес ДНК. Наиболее диверсифицированными и многочисленными являются клональные комлексы СС5 и СС8, которые содержат эпидемические клоны с различными типами SCCmec . В то же время SCCmec типа IV может присутствовать в различных «бэкграундах». Особенно многочисленной является группа St239, которая представляет отдельную ветвь внутри клонального комплекса СС8. Эта группа включает различные эпидемические штаммы и клоны: EMRSA-1, -4, -7, -9, -11, Бразильский, Португальский (табл. 1). В настоящее время в стационарах России выявлено эпидемическое распространение штаммов MRS А генетически родственных EMRSA-1 (Бразильскому клону) и Иберийскому клону.

Будучи однажды занесенными в стационар, MRSА могут выживать там в течение длительного времени. Это определяет стратегию противоэпидемических мероприятий: очень важно не допустить занос и распространение в стационаре эпидемических штаммов.

Следует отметить, что периодически происходит смена эпидемического штамма, доминирующего на отдельных территориях. Так, по данным стафилококковой референс-лаборатории в Colindale ( London), в 1996 г. штаммы EMRSA-15 и EMRSA-16 были ответственны за более чем 1500 инцидентов, охвативших трех и более пациентов, в 309 больницах Англии, тогда как остальные эпидемические штаммы были ответственны только за 361 инцидент в 93 больницах. Распространение этих эпидемических штаммов привело к росту смертности от MRSA в 15, а частоты бактериемии в 24 раза за период с 1993 по 2002 г.г. согласно данным национального департамента статистики Великобритании.

Продолжает нарастать спектр антибиоткорезистентности эпидемических штаммов MRSA. Они гораздо быстрее, чем метициллинчувствительные, приобретают устойчивость к препаратам из группы фторхинолонов. Характерной чертой многих эпидемических штаммов MRSA является устойчивость практически ко всем известным классам антимикробных препаратов, за исключением гликопептидов и оксазолидинонов. В последние годы участились случаи выделения изолятов MRSA, обладающих умеренной чувствительностью к ванкомицину и даже ванкомицинрезистентных. Распространение таких штаммов в стационарах России может иметь драматические последствия.

С проблемой госпитальных штаммов MRSA тесно переплетается и проблема MRSA вне госпитального происхождения. Эти штаммы пока не обладают множественной резистентностью к антибиотикам, генетически отличаются от госпитальных штаммов, их происхождение остается неизвестным. Предполагается, что они сформировались из спорадических госпитальных штаммов. Внегоспитальные штаммы MRSA способны вызывать некротизирующую форму пневмонии, характеризующуюся крайне тяжелым течением и требующей госпитализации пациента, в связи с чем возникает угроза заноса и распространения таких штаммов в стационарах.

Выявление метициллинрезистентных стафилококков. Определение чувствительности к антибиотикам у анаэробных бактерий.

А.В. Дехнич
Институт антимикробной химиотерапии, г.Смоленск

А.Н. Маянский
Заведующий кафедрой микробиологии Нижегородской медицинской академии
В.В. Тец
Заведующий кафедрой микробиологии Санкт-Петербургской медицинской академии им. ак. И.П. Павлова

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

С момента появления в 70-х годах и до настоящего времени метициллинрезистентные стафилококки и, прежде всего, метициллинрезистентные штаммы Staphylococcus aureus (MRSA) являются одними из ведущих возбудителей нозокомиальных инфекций. Частота MRSA в структуре стафилококковых инфекций за последние годы резко возросла во всём мире (например в США - с 2% в 1975 г. до 35% в 1996 г.).

Резистентность стафилококков к оксациллину (метициллину) может быть обусловлена тремя основными механизмами:

  • продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего белка (ПСБ) - ПСБ-2а (фермента, участвующего в синтезе клеточной стенки), кодируемого хромосомальным геном "mecА" - классическая или истинная резистентность к метициллину (оксациллину);
  • инактивацию вследствие гиперпродукции бета-лактамаз;
  • модификацию нормальных ПСБ.

С клинической точки зрения важно дифференцировать штаммы с классической ("mecА"-обусловленной) резистентностью, от штаммов с двумя другими редко встречающимися механизмами резистентности, обусловливающими низкий или пограничный уровень устойчивости. Это связано с тем, что при инфекциях, вызванных штаммами с mecA-обусловленной резистентностью терапия бета-лактамными антибиотиками (пенициллинами, цефалоспоринами, карбапенемами) будет неэффективна, кроме того, эти штаммы часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиков, за исключением гликопептидов (ванкомицин, тейкопланин). Фенотипические характеристики, которые могут помочь дифференцировать три перечисленные выше механизма резистентности, изложены в таблице:

Таблица. Типы резистентности к метициллину (оксациллину) у стафилококков.

Штаммы с классическим типом резистентности могут в свою очередь быть гомо- или гетерогенными по типу экспрессии резистентности. При гомогенном типе экспрессии практически все микробные клетки проявляют резистентность в стандартных in vitro тестах, в то время как при гетерогенном типе только небольшая часть клеток проявляет резистентность фенотипически. Нередко только 1 из 10-100 млн. клеток в популяции с наличием гена mecА экспрессирует резистентность, что ведёт к получению пограничных результатов при определении чувствительности к оксациллину (МПК - 2-8 мг/л). Резистентность, обусловленная гиперпродукцией бета-лактамаз и мутацией нормальных ПСБ, также приводит к получению пограничных значений МПК. Однако, резистентность к оксациллину, обусловленную гиперпродукцией бета-лактамаз, можно легко отличить от классической резистентности по обратимости резистентности при использовании ингибиторов бета-лактамаз.

В отличие от штаммов с классической резистентностью гиперпродуценты бета-лактамаз и штаммы с мутациями нормальных ПСБ обычно не имеют множественной резистентности к другим антибиотикам.

Наличие классической резистентности наиболее легко определить методом скрининга так как рост микробных клеток с неклассическими типами резистентности обычно ингибируется.

Примечание Для определения чувствительности используется оксациллин ввиду его более высокой стабильности при хранении по сравнению с метициллином.

Принцип

Для идентификации резистентности к оксациллину (метициллину) у стафилококков необходимо соблюдение следующих условий:

  1. Наличие в агаре NaCl в концентрации 4%
  2. Сниженная температура инкубации - при 35 o С
  3. Строгое соблюдение длительности инкубации: 24 часа для S.aureus и 48 часов для коагулаза(-) стафилококков
  4. Стандартизированное число микроорганизмов - 1,5 х 10 8
  5. рН 7,2-7,4, так как при более низком рН увеличивается число ложноотрицательных результатов

Микроорганизм

Материалы

Контроль качества

  1. Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллер-Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
  2. Контрольные штаммы (могут быть предоставлены Институтом антимикробной химиотерапии):
    S.aureus ATCC 38591 - резистентный.
    S.aureus ATCC 29213 - чувствительный.

Постановка теста

Приготовление инокулюма

Бактериальную взвесь стафилококка готовят из нескольких колоний с одинаковой морфологией на стерильном физиологическом растворе (3 мл) и доводят до мутности 0,5 по Мак Фарланду (1,5x10 8 КОЕ/мл).

Инокуляция

  1. Метод I (микропипеткой)
    а) приготовить разведение 1:100 стандартного инокулюма 0,5 по МакФарланду для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5x10 6 КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физ. раствора).
    б) с помощью микропипетки нанесите каплю (10 мкл) разведённой стандартной суспензии на поверхность агара с оксациллином.
  2. Метод II (с помощью тампона)
    а) погрузите стерильный ватный тампон в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по МакФарланду), затем отожмите избыток влаги о стенку пробирки
    б) коснитесь тампоном поверхности агара с оксациллином.

Инкубация

Штаммы S.aureus инкубируются при температуре +35 o С в течение полных 24 часов, а коагулаза(-) стафилококков - в течение 48 часов.

Примечание. Среда АГВ не может быть рекомендована для постановки теста в связи с высокой частотой ложноположительных результатов.

Учет результата

Интерпретация

  1. Появление видимого роста более 1 колонии на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину (метициллину).
  2. При отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый штамма учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину).
  3. При получении сомнительных результатов, а также для штаммов, выделенных у больных с клинически неэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecA.

Представление результата

  1. S.aureus или коагулаза(-) стафилококк (S.epidermidis), чувствительный к метициллину (оксациллину).
  2. S.aureus или коагулаза(-) стафилококк (S.epidermidis) резистентный к метициллину (MRSA или MRSE).

Ограничения метода

  1. Скрининг на агаре с оксациллином предназначен для фенотипического определения штаммов имеющих ген mecA, однако, штаммы с другими типами резистентности иногда могут давать ложноположительный результат.
  2. Применение метода скрининга для выявления резистентности к оксациллину (метициллину) менее надёжен у коагулаза(-) стафилококков, чем у S.aureus.

Примечание

Оксациллин, в сравнении с метициллином, менее стабилен к действию стафилококковых бета-лактамаз, что может привести к получению большего числа ложноположительных результатов, чем при использовании метициллина. В то же время, метициллин, в сравнении с оксациллином, значительно менее стабилен при хранении, что и ограничивает его применение.

Ванкомицин-резистентный S.aureus

В результате углубленного исследования ванкомицинрезистентности у MRSA, при скрининге более чем 2000 штаммов из различных стационаров, было выявлено от 1% до 25% (!) штаммов с гетерогенной (индуцибельной) резистентностью к ванкомицину, экспрессирующих её с частотой около 1 клетки на миллион. Такие штаммы могут являться предшественниками VRSA.

Специалисты до сих пор не пришли к согласию, какой термин использовать (VRSA или VISA), что связано с тем, что несмотря на значения МПК, соответствующее диапазону умеренной резистентности, налицо клиническая неэффективность ванкомицина при терапии VRSA и VISA инфекций. Другими словами, при отсутствии резистентности с фармакологической точки зрения, эти штаммы резистентны к ванкомицину с клинической и биологической точек зрения.

Многие специалисты предлагают свои методы для скрининга ванкомицинрезистентности у стафилококков, однако, до сих пор не разработано общепринятых стандартов. Таким образом, чрезвычайно важным является разработка методов лабораторной диагностики и мониторинга ванкомицинрезистентности, особенно у пациентов, получающих или получавших терапию ванкомицином/тейкопланином и при неэффективности этой терапии. Следует разработать методики для контроля за VRSA-инфекциями, предпринять меры по изоляции больных и носителей для предупреждения распространения VRSA. Кроме того, политика применения антибиотиков должна предусматривать снижение необоснованного назначения ванкомицина.

В России пока что не было описано ни одного штамма S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину, вероятнее всего в связи с редким использованием ванкомицина в клинической практике.

1. Область применения


Нужен полный текст и статус документов ГОСТ, СНИП, СП?
Попробуйте профессиональную справочную систему
«Техэксперт: Базовые нормативные документы» бесплатно

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (А.И.Верещагин, М.В.Зароченцев, И.В.Новокшонова, М.А.Ярославцева); ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора (М.В.Храмов, В.М.Храмов); ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве" (Н.Я.Салова, Ф.М.Абасова) при участии ООО "СИ-ЛАБ", Москва (А.М.Веселовский, М.Б.Беглов).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г.Онищенко 30.06.2011.

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации патогенных биологических агентов, обнаруженных в продовольственном сырье и пищевых продуктах, парфюмерно-косметической и другой продукции, объектах окружающей среды, клиническом (биологическом) материале, и устанавливают методы определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антимикробным препаратам.

1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, парфюмерно-косметической и другой продукции, объектов окружающей среды, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке.

4. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

5. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

7. СанПиН 1.2.681-97 "Производство и контроль парфюмерно-косметической продукции для обеспечения ее безопасности и качества".

8. СанПиН 2.1.3.2630-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность".

9. МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".

3. Общие положения

3.1. Автоматизированная система для биохимического анализа (далее - система) может быть использована при биохимической идентификации видовой принадлежности штаммов микроорганизмов, выделенных из различного материала в соответствии с действующими методическими документами и определении чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам. Биохимическая идентификация микроорганизмов с применением системы может осуществляться альтернативно биохимической идентификации, проводимой общепринятыми методами in vitro.

3.2. Работы по идентификации микроорганизмов и определению чувствительности их к противомикробным препаратам с применением системы следует осуществлять в соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов, регламентирующих безопасность работы с патогенными биологическими агентами.

4. Сущность метода

4.1. Идентификация микроорганизмов с применением системы основана на регистрации и анализе результатов изменения биохимических субстратов под действием микроорганизмов (биохимическая идентификация) в сопоставлении с базой данных, включающей информацию о биохимических профилях микроорганизмов.

4.2. Принцип определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам с применением системы основан на определении ингибиции роста микроорганизмов антимикробными препаратами различных концентраций с установлением их минимальных ингибирующих концентраций (МИК), либо на выявлении множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов.

4.3. Система позволяет осуществлять идентификацию аэробных и факультативно-анаэробных бактерий различных групп и семейств, дрожжевых, дрожжеподобных и других микроскопических грибов (прилож.1).

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и антимикотическим препаратам осуществляется с применением системы и различных типов планшет (прилож.2).

4.4. Система включает фотометр, который позволяет считывать результаты, полученные при проведении идентификации микроорганизмов и определении их чувствительности к антибиотикам на адаптированных к ней тест-планшетах. Результаты обрабатываются и интерпретируются автоматически. Информация о результатах идентификации микроорганизмов (с указанием рода, вида, биотипа, альтернативного близкородственного вида, статистических данных) отражается на экране компьютера в течение нескольких секунд. Возможно сохранение данных на диске и вывод их на печать.

4.5. Наименования микроорганизмов, идентифицируемых системой, приводятся в соответствии с 9-м изданием международного "Определителя бактерий Берджи".

5. Отбор, подготовка проб (культур) и внесение бактериальной суспензии

5.1. При работе с применением системы используются суточные бактериальные культуры, выращенные на питательной среде в соответствии с инструкцией по применению тест-планшетов и стрипов. Если исследуемый материал находился в лиофилизированном состоянии в ампулах, то необходимо восстановить культуру на питательной среде, рекомендуемой в инструкциях по применению тест-планшетов или стрипов, после чего еще раз пересеять культуру на аналогичную питательную среду.

5.2. Для внесения исследуемого материала в тест-планшеты необходимо приготовить бактериальную суспензию определенной мутности (в зависимости от типа теста) по стандартам мутности подобных Mc-Farland или ФГБУ "НЦЭСМП" или с аналогичными характеристиками.

5.4. Все работы, в т.ч. пересевы, приготовление бактериальной суспензии и внесение ее в лунки планшета, осуществляют асептично с соблюдением требований биологической безопасности и техники лабораторных работ.

6. Аппаратура, материалы и реактивы

Система, подобная МикроТакс, SY-LAB Gerate, GmbH (или Система с аналогичными характеристиками), включющая:

2) инкубатор МТ-5 (внутренняя камера которого выполнена из нержавеющей стали) с жидкокристаллическим дисплеем. Диапазон температур: от 20 до 70 °С. Отклонение от температуры при 37 °С: ±0,5 °С, время нагрева до 37 °С - 37 мин, время охлаждения с 37 до 30 °С - 79 мин;

4) управляющий блок на базе персонального компьютера с программным обеспечением и принтером.

Тест-планшеты, подобные МикроТакс или с аналогичными характеристиками - стандартные, 96-луночные, с внесенными компонентами:

- МикроТакс-IDS (4 теста/планшет) - для быстрой (экспресс) в течение 5-6 ч идентификации 113 наиболее клинически значимых штаммов энтеробактерий, стафилококков, стрептококков, энтерококков;

- МикроТакс-RPO (2 теста/планшет) - для идентификации 167 видов бактерий родов: стафилококки, стрептококки, энтерококки, коринебактерии, листерии;

- МикроТакс-Candida (4 теста/планшет) - для идентификации 32 видов клинически значимых грибов/дрожжей за 24 ч;

- МикроТакс-STREP 2 (4 теста/планшет) - для идентификации клинически значимых стрептококков и энтерококков за 20-24 ч;

- МикроТакс-AM КН2 (1, 2 или 4 теста/планшет) - для определения чувствительности дрожжей и криптококков к антимикотическим агентам (6 антимикотических агентов в различных концентрациях) за 22-24 ч;

- МикроТакс-AM MIC (1, 2 или 4 теста/планшет) - для определения чувствительности дрожжей и криптококков к антимикотическим агентам (9 антимикотических агентов в различных концентрациях) за 22-24 ч;

- МикроТакс-SВ/быстрый тест (1, 2 или 4 теста/планшет) - для определения бактериальной чувствительности к антибиотикам за 6 ч;

Стрипы, подобные перечисленным, или с аналогичными характеристиками:

- MIC-стрип ESBLII (1 контроль) - фенотипический подтверждающий тест для детекции ESBL (-лактамазы), которая продуцируется энтеробактериями;

- MIC-стрип MRSA (1 контроль) - фенотипический подтверждающий тест для детекции метициллин-резистентных стафилококков;

- MIC-стрип PEN (1 контроль) - фенотипический подтверждающий тест для детекции резистентности к пенициллину у пенициллиноустойчивых изолятов стрептококков и пневмококков;

- MIC-стрип VAN (1 контроль) - фенотипический подтверждающий тест для детекции ванкомицин-резистентных грамположительных бактерий.

Реактивы и питательные среды:

- типа NF-Susmed, реактив для МикроТакс-NF или с аналогичными характеристиками;

- типа Candida-Susmed, реактив для МикроТакс-RC или с аналогичными характеристиками;

Читайте также: