Принципы генотерапии. Цели генной терапии

Обновлено: 26.04.2024

Трансфекция клеток

Для начала стоит ввести определения некоторых терминов. Транспорт генов осуществляется благодаря вектору – это молекула ДНК, используемая как «транспортное средство» для искусственного переноса генетической информации в клетку. Выделяют множество разновидностей векторов: плазмидные, вирусные, а также космиды, фазмиды, искусственные хромосомы и т.д. Принципиально важно, что векторы (в частности, плазмидные) обладают характерными для них свойствами: 1. Точка начала репликации (ori) – последовательность нуклеотидов, с которой начинается удвоение ДНК. Если векторная ДНК не сможет удваиваться (реплицироваться), то необходимый лечебный эффект не будет достигнут, потому что она просто быстро расщепится внутриклеточными ферментами-нуклеазами, а из-за недостатка матриц будет в итоге образовано гораздо меньше молекул белка. Следует отметить, что эти точки специфичны для каждого биологического вида, то есть если векторную ДНК предполагается получать путём её размножения в культуре бактерий (а не просто химическим синтезом, что обычно гораздо дороже), то потребуются отдельно две точки начала репликации – для человека и для бактерий; 2. Сайты рестрикции – специфические короткие последовательности (чаще палиндромные), которые узнаются специальными ферментами (эндонуклеазы рестрикции) и разрезаются ими определённым образом – с образованием «липких концов». Эти сайты необходимы для того, чтобы сшить векторную ДНК (которая, по сути, является «болванкой») с нужными терапевтическими генами в единую молекулу. Такая сшитая из двух или нескольких частей молекула зовётся «рекомбинантной»; 3. Понятно, что нам желательно бы получить миллионы копий рекомбинантной молекулы ДНК. Опять-таки, если мы имеем дело с культурой клеток бактерий, то далее эту ДНК нужно выделить. Проблема заключается в том, что далеко не все бактерии проглотят нужную нам молекулу, некоторые не станут этого делать. Чтобы эти две группы всё-таки различить, в векторную ДНК вставляют селективные маркёры – участки устойчивости к определённым химическим веществам; теперь если в среду добавить эти самые вещества, то выживут только те, которые обладают устойчивостью к ним, а остальные погибнут. Все эти три составляющие можно наблюдать и в самой первой искусственно синтезированной плазмиде: Сам процесс внедрения плазмидного вектора в определённые клетки называется трансфекцией. Плазмида – это довольно короткая и обычно кольцевая молекула ДНК, которая находится в цитоплазме бактериальной клетки. Плазмиды не связаны с бактериальной хромосомой, они могут реплицироваться независимо от нее, могут выбрасываться бактерией в окружающую среду или, наоборот, поглощаться (процесс поглощения – трансформация). С помощью плазмид бактерии могут обмениваться генетической информацией, например, передавать устойчивость к определённым антибиотикам. Плазмиды существуют в бактериях в естественных условиях. Но никто не может помешать исследователю искусственно синтезировать плазмиду, которая будет обладать нужными для него свойствами, вшить в нее ген-вставку и внедрить в клетку. В одну и ту же плазмиду можно вшивать разные вставки .

Методы генной терапии

Существует два основных подхода, различающиеся природой клеток-мишеней: 1. Фетальная, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу (оплодотворённую яйцеклетку) или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введённый материал попадёт во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению). В нашей стране она фактически запрещена ; 2. Соматическая, при которой генетический материал вводят уже родившемуся в неполовые клетки и он не передаётся половым клеткам. Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных (размноженных) и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в определённые ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения лёгочных заболеваний (муковисцидоз, рак лёгких). Разработке программы генной терапии предшествует много этапов. Это и тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена (т. е., синтеза на матрице гена какого-то белка в определённой ткани), и идентификация первичного биохимического дефекта, и исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Прямая доставка и клеточные носители терапевтических генов

Существует множество методов внедрения чужеродной ДНК в эукариотическую клетку: некоторые зависят от физической обработки (электропорация, магнетофекция и т.д.), другие – от применения химических материалов или биологических частиц (например, вирусов), которые используются как переносчики. Сразу стоит оговориться, что обычно комбинируются химические и физические методы (например, электропорация + окутывание ДНК липосомами). Прямые методы 1. Трансфекция на химической основе может быть классифицирована на несколько видов: с использованием вещества циклодекстрина, полимеров, липосом или наночастиц (с или без химической или вирусной функционализации, т.е. модификации поверхности): а) Один из самых дешевых методов – использование фосфата кальция. Он повышает эффективность включения ДНК в клетки в 10-100 раз. ДНК образует с кальцием прочный комплекс, что обеспечивает его эффективное поглощение. Недостаток – ядра достигает всего около 1 – 10% ДНК. Метод используется in vitro для переноса ДНК в клетки человека: б) Применение сильноразветвленных органических молекул – дендример, для связывания ДНК и переноса её в клетку: в) Очень эффективным методом для трансфекции ДНК является внедрение её через липосомы – малые, окруженные мембраной тельца, которые могут сливаться с клеточной цитоплазматической мембраной (ЦПМ), представляющая собой двойной слой из липидов. Для эукариотических клеток трансфекция производится эффективнее с применением катионных липосом, потому что клетки к ним более чувствительны. Процесс имеет своё название – липофекция. Этот метод сегодня считается одним из самых безопасных. Липосомы нетоксичны и неиммуногенны. Однако, эффективность переноса генов с помощью липосом ограничена, поскольку внесенная ими ДНК в клетках обычно сразу же захватывается лизосомами и разрушается. Введение ДНК в клетки человека с помощью липосом сегодня является главным при терапии in vivo: г) Еще один метод – использование катионных полимеров, таких как диэтиламиноэтил–декстран или полиэтиленимин. Отрицательно заряженные молекулы ДНК связываются с положительно заряженными поликатионами, и этот комплекс далее проникает в клетку путём эндоцитоза. ДЭАЭ-декстран изменяет физические свойства плазматической мембраны и стимулирует поглощение этого комплекса клеткой. Главный недостаток метода заключается в том, что ДЭАЭ-декстран в высоких концентрациях токсичен. Метод не получил распространения в генотерапии; д) С помощью гистонов и других ядерных белков . Эти белки, содержащие много положительно заряженных аминокислот (Lys, Arg), в естественных условиях помогают компактно уложить длинную цепь ДНК в сравнительно небольшое ядро клетки. 2. Физические методы: а) Электропорация – очень популярный метод; мгновенное повышение проницаемости мембраны достигается за счет того, что клетки подвергаются коротким воздействиям интенсивного электрического поля. Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. На человеке на сегодняшний день не используется. б) «Cell squeezing» – метод, изобретенный в 2013 г. Он позволяет доставить молекулы в клетки путём "мягкого сдавливания" клеточной мембраны. Метод исключает возможность токсичности или неправильного попадания по мишени, так как он не зависит от внешних материалов или электрических полей; в) Сонопорация – метод искусственного переноса чужеродных ДНК в клетки с помощью воздействия на них ультразвуком, вызывающим открывание пор в клеточной мембране; г) Оптическая трансфекция – метод, при котором производится крошечное отверстие в мембране (около 1 мкм в диаметре) при использовании сильносфокусированного лазера; д) Гидродинамическая трансфекция – метод доставки генетических конструкций, белков и т.д. путем контролируемого повышения давления в капиллярах и межклеточной жидкости, что вызывает кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран и образование в них временных пор. Осуществляется быстрой инъекцией в ткань, доставка при этом является неспецифичной. Эффективность доставки для скелетной мышцы – от 22 до 60% ; е) Микроинъекция ДНК – введение в ядро клетки животных с помощью тонких стеклянных микротрубочек (d=0,1-0,5 мкм). Недостаток – сложность метода, высока вероятность разрушения ядра либо ДНК; можно трансформировать ограниченное число клеток. Не используется для человека. 3. Методы на основе частиц. а) Прямой подход к трансфекции – генная пушка, при этом ДНК сцепляют в наночастицу с инертными твердыми веществами (чаще золото, вольфрам), которая затем «выстреливает» направленно в ядра клеток-мишеней. Этот метод применяется in vitro и in vivo для введения генов, в частности, в клетки мышечных тканей, например при таком заболевании, как миодистрофия Дюшена. Размеры частиц золота – 1-3 мкм. б) Магнитофекция - метод, использующий силы магнетизма для доставки ДНК в клетки-мишени. Сначала нуклеиновые кислоты (НК) ассоциируются с магнитными наночастицами, а далее, под действием магнитного поля, частицы загоняются в клетку. Эффективность почти 100%-ная, отмечена явная нетоксичность. Уже через 10-15 мин частицы регистрируются в клетке – это гораздо быстрее других методик. в) Импалефекция (impalefection; "impalement", букв. "сажание на кол" + "infection") – метод доставки с применением наноматериалов, таких как углеродные нанотрубки и нановолокна. При этом клетки буквально протыкаются подстилкой из нанофибрилл . Приставка «нано» применяется для обозначения их очень маленьких размеров (в пределах миллиардных долей метра). Отдельно стоит выделить такой метод, как РНК-трансфекция: в клетку доставляется не ДНК, а молекулы РНК – их «преёмники» в цепи биосинтеза белка; при этом активизируются специальные белки, разрезающие РНК на короткие фрагменты -- т.н. малые интерферирующих РНК (миРНК). Эти фрагменты связываются с другими белками и, в конце концов, это приводит к угнетению экспрессии клеткой соответствующих генов. Таким образом можно заблокировать в клетке действие тех генов, которые потенциально на данный момент приносят больше вреда, чем пользы. Широкое применение РНК-трансфекция нашла, в частности, в онкологии. Основные принципы доставки генов с использованием плазмидных векторов рассмотрены. Теперь можно перейти к рассмотрению вирусных методов. Вирусы – это неклеточные формы жизни, чаще всего представляющие собой молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), обёрнутой в белковую оболочку. Если вырезать из генетического материала вируса все те последовательности, которые вызывают возникновение заболеваний, то весь вирус также можно успешно превратить в «транспортное средство» для нашего гена. Процесс внедрения ДНК в клетку, опосредованное вирусом, называется трансдукцией. На практике чаще всего используют ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы (AAV). Для начала стоит разобраться, каким должен быть идеальный кандидат для трансдукции среди вирусов. Критерии таковы, что он должен быть: • стабилен; • ёмок, то есть вмещать достаточное количество ДНК; • инертным в отношении метаболических путей клетки; • точным – в идеале, должен встраивать свой геном в конкретный локус генома ядра хозяина и др. В реальной жизни очень сложно скомбинировать хотя бы несколько пунктов, так что обычно выбор происходит при рассмотрении каждого индивидуального случая в отдельности. Из всех трёх перечисленных наиболее используемых вирусов самыми безопасными и одновременно самыми точными являются AAV. Их почти что единственный недостаток – сравнительно малая ёмкость (ок. 4800 п.н.), которая, однако, оказывается достаточной для многих генов . Помимо перечисленных методов достаточно часто генная терапия применяется в комбинации с клеточной: при этом сначала в питательную среду высаживают культуру определённых клеток человека, после этого тем или иным способом внедряют в клетки нужные гены, некоторое время культивируют и снова пересаживают в организм хозяина. В результате клеткам можно вернуть их нормальные свойства. Так, к примеру, модифицировали белые клетки крови человека (лейкоциты) при лейкемии:

Судьба гена после его попадания в клетку

Так как с вирусными векторами всё более-менее ясно в силу их свойства более эффективно доставлять гены до конечной цели – ядра, то остановимся на судьбе плазмидного вектора. На данном этапе мы добились того, что ДНК прошла первый большой барьер – цитоплазматическую мембрану клетки. Далее, в комплексе с другими веществами, оболочкой или без, ей необходимо достигнуть клеточного ядра, чтобы специальный фермент – РНК-полимераза – синтезировала молекулу информационной РНК (иРНК) на матрице ДНК (этот процесс называется транскрипция). Только после этого иРНК выйдет в цитоплазму, образует комплекс с рибосомами и согласно генетическому коду синтезируется полипептид – например, фактор роста сосудов (VEGF), который начнёт выполнять определённую терапевтическую функцию (в данном случае – запустит процесс образования ветвлений сосудов в ткани, подверженной ишемии). Что касается экспрессии введенных генов в требуемом типе клеток, то эта задача решается с помощью регуляторных элементов транскрипции. Ткань, в которой происходит экспрессия, часто определяется комбинацией специфичного для этой ткани энхансера(«усиливающей» последовательности) с определенным промотором (последовательность нуклеотидов, с которой РНК-полимераза начинает синтез), который может быть индуцируемым . Известно, что активность генов можно модулировать in vivo внешними сигналами, а так как энхансеры могут работать с любым геном, то в вектора можно вводить еще инсуляторы, которые помогают энхансеру работать независимо от его положения и могут вести себя как функциональные барьеры между генами. Каждый энхансер содержит набор участков связывания активирующих или супрессирующих белковых факторов . С помощью промоторов можно также регулировать уровень экспрессии генов. Например, есть металлотионеиновые или температурочувствительные промоторы; промоторы, управляемые гормонами. Экспрессия гена зависит от его положения в геноме. В большинстве случаев существующие вирусные методы приводят лишь к случайному встраиванию гена в геном. Чтобы исключить такую зависимость, при конструировании векторов снабжают ген известными нуклеотидными последовательностями, которые позволяют гену экспрессироваться независимо от места его встраивания в геном. Наиболее простой путь регуляции экспрессии трансгена – это обеспечение его индикаторным промотором, который чувствителен к физиологическому сигналу, такому, как выделение глюкозы или гипоксия. Такие «эндогенные» контролирующие системы могут быть полезны в некоторых ситуациях, таких, как осуществление глюкозозависимого контроля продукции инсулина. Более надежны и универсальны «экзогенные» системы контроля, когда экспрессия гена контролируется фармакологически введением маленькой лекарственной молекулы. В настоящее время известны 4 основные системы контроля - регулируемые тетрациклином (Tet), стероидом насекомых, экдизоном или его аналогами, антипрогестиновым препаратом майфпристоном (RU486) и химическими димеризаторами, такими, как рапамицин и его аналоги. Все они включают лекарственно зависимое привлечение домена активации транскрипции к основному промотору, ведущему нужный ген, но отличаются по механизмам этого привлечения .

Заключение

Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivoи in vitro векторные системы далеки от совершенства . Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных доработках. Прежде всего, это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительному пребыванию внутри ядер). В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. Генная и клеточная терапия открывает блестящие перспективы для восстановления утраченных клеток и тканей и генно-инженерного конструирования органов, что, несомненно, существенно расширит арсенал методов для медико-биологических исследований и создаст новые возможности для сохранения и продления жизни человека .

Принципы генотерапии. Цели генной терапии

Генотерапия для лечения болезни человека имеет как уже продемонстрированные, так и теоретические риски трех общих типов.

Неблагоприятный ответ на вектор или комбинацию вектор/болезнь в генной терапии

Главная озабоченность — то, что пациент может неблагоприятно отреагировать на вектор или передаваемый ген. Такие проблемы в основном предполагают на основе животных моделей и предварительных исследований у человека. По крайней мере один пациент погиб из-за неблагоприятного иммунного ответа на введенный аденовирусный вектор.

Дополнительные соображения в этом случае — иммунный ответ у больного проявился вследствие катаболической реакции. Поскольку его генетическое заболевание — дефект цикла мочевины, способность переносить катаболизм белка была резко снижена.

Общий вывод из этого примера состоит в том, что при выборе подходящего вектора необходимо учитывать патофизиологические характеристики специфического заболевания; пациент, устойчивый к катаболизму, вероятно, смог бы перенести иммунную реакцию на введение аденовируса.

Инсерционный мутагенез, приводящий к злокачественным новообразованиям в генной терапии

Вторая причина для беспокойства — инсерционный мутагенез, т.е. вероятность того, что переданный ген, внедряясь в ДНК пациента, активизирует протоонкогены или нарушает гены — супрессоры опухолевого роста, возможно, вызывая злокачественное новообразование.

Текущее поколение вирусных векторов с меньшей вероятностью вызывает экспрессию онкогенов, так как они изменены для минимизации способности их промоторов активизировать экспрессию смежных генов хозяина. Инактивация генов-супрессоров, вероятно, будет встречаться редко, поэтому риск такого события оценивают как приемлемый при болезнях без другой терапевтической альтернативы.

Неожиданный механизм онкогенеза при генотерапии был обнаружен случайно при выявлении лимфопроли-феративных заболеваний у некоторых пациентов после генотерапии Х-сцепленного комбинированного иммунодефицита, обсуждаемого далее. Оказалось, что у этих больных перенос гена содействовал развитию злокачественного заболевания.

Следовательно, необходимо максимально предусматривать биологическое влияние передаваемого гена, когда он экспрессируется в необычном хромосомном положении за пределами своего нормального биологического контекста.

Инсерционная инактивация важного гена в генной терапии

Третий фактор риска — инактивация гена, существенного для жизнеспособности клетки — в основном не будет иметь значимого эффекта, поскольку ожидают, что такие летальные мутации будут редкими и повредят лишь единичные клетки.

Хотя векторы в основном включаются в транскрибируемые гены, а ретровирусы преимущественно в их 5'-конец, шанс, что один и тот же ген будет нарушен более чем в нескольких клетках, чрезвычайно низок, так как отдельные типы клеток экспрессируют около 10 000 генов.

Единственное исключение из этого правила относится к половым клеткам; инсерция в важный ген в половой клетке может вызвать патогенную доминантную мутацию у потомства пациента. Тем не менее, вероятно, такие события будут редкими, а риск приемлемым, поэтому на этом основании трудно оправдать отказ от тщательно спланированной и проверенной попытки генотерапии у пациентов, для которых нет других способов лечения.

Кроме того, проблема модификации половых клеток при лечении болезни не ограничивается генотерапией. Например, широко используемая при лечении злокачественных болезней химиотерапия мутагенна, но этот риск принимают из-за терапевтических преимуществ.

Этические проблемы генной терапии

Как и любое новое лечение, предложения по пересадке генов следует подвергать строгому изучению полномочными органами и этическими комитетами больниц. Тем не менее фактически все правительственные и религиозные учреждения, изучавшие предложения по применению генотерапии у человека для лечения генетической патологии, согласны, что эта терапевтическая возможность должна быть использована. Соматическая генотерапия, в отличие от передачи генов в половые клетки, поднимает всего несколько этических вопросов, не учитываемых при введении других новых видов лечения (например, новых противораковых препаратов).

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Генная терапия Х-сцепленного тяжелого иммунодефицита. Принципы

Кроме успешно пролеченных генотерапевтическими методами двух форм тяжелого комбинированного иммунодефицита, потенциальные кандидаты на коррекцию этим методом — множество других моногенных заболеваний.

Это такие болезни, как атрофии сетчатки, болезни крови (например, гемофилия и талассемия), заболевания, нарушающие белки печени (например, ФКУ), нарушения цикла мочевины, семейная гиперхолестеринемия и недостаточность альфа-1-антитрипсина.
Ниже приведены дополнительные соображения, актуальные при использовании генотерапии при Х-сцепленном тяжелом комбинированном иммунодефиците.

Тяжелые комбинированные иммунодефициты — группа заболеваний, вызванных мутациями в генах, необходимых для созревания лимфоцитов. Без лечения больные отстают в развитии и рано умирают от инфекционных заболеваний, поскольку у них отсутствуют функционирующие В- и Т-лимфоциты.

Одна форма болезни, Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит, вызванный мутацией Х-сцепленного гена, кодирующего субъединицу ус-цитокинового рецептора многих интерлейкиновых рецепторов. Недостаточность рецептора вызывает ранний блок роста, выживания и дифференцирования Т-лимфоцитов и естественных киллеров. Это заболевание выбрано для испытания эффективности генотерапии по двум главным причинам.

Во-первых, было известно, что пересадка костного мозга излечивает это заболевание, что подтверждает возможность устранения патофизиологических изменений за счет восстановления экспрессии ус-цитокинового рецептора лимфоцитов. Во-вторых, считали, что клетки, несущие перенесенный ген, должны иметь выборочное преимущество выживания перед нетрансдуциро-ванными клетками. (Клетки с введенным вирусным вектором называют «трансдуцированными».)

Результат первого эксперимента по генотерапии пациента с генетической болезнью (Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита), проведенного в 2000 г., оказался решающим и положительным. Последующее подтверждение эффективности лечения получено у восьми пациентов в этом же исследовании. Стволовые клетки костного мозга пациентов заражали в культуре (ех vivo) ретровирусным вектором, экспрессирующим кДНК ус-субъединицы.

Выборочное преимущество трансдуцированных клеток обеспечивалось перенесенным геном. Трансдуцированные Т-клетки и естественные клетки-киллеры заполняли кровь пролеченных пациентов, и Т-клетки начинали нормально функционировать. Хотя частота трансдуцированных В-клеток оказалась низкой, были получены требуемые уровни иммуноглобулинов сыворотки и антител. Наступало значительное клиническое улучшение, с разрешением хронического поноса и кожных повреждений и восстановлением нормального роста и развития.

Получен замечательный результат, однако по крайней мере у трех пациентов возникло лейкемоидное заболевание с развитием выраженного лимфоцитоза. В двух случаях считают, что злокачественная болезнь, по крайней мере частично, произошла вследствие вставки ретровирусного вектора в локус LM02 в хромосоме 11. Это привело к нарушению экспрессии гена LM02 в монокло-нальной популяции Т-клеток.

Примечательно, что ранее уже было известно об участии гена LM02 в развитии Т-клеточной лейкемии, подтверждающем связь между инсерцией ретровируса и лимфопролиферацией у этих пациентов. В ходе второго исследования генотерапии Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита ни у одного из 10 пролеченных больных лейкемические осложнения не обнаружены. Пока неясно, отличаются ли результаты второго исследования от первого, или это связано с небольшим количеством пациентов.

Возможно, отсутствие лимфопролиферации во второй группе пациентов вызвано различиями в протоколах, примененных во втором исследовании, включая структуру вектора и методы, использованные для трансдукции.

Эти первые исследования демонстрируют большой потенциал генотерапии для коррекции наследственных болезней, даже если происходит переоценка текущей стратегии и методов генотерапии Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита. В настоящее время для детей с Х-сцепленным тяжелым комбинированным иммунодефицитом пересадка стволовых клеток костного мозга остается лечением выбора, достаточно успешным при наличии HLA-совместимого донора.

Для пациентов без такого донора нужно рекомендовать пересадки гаплоидентичных стволовых клеток костного мозга, оставляя метод переноса генов для тех случаев, когда гаплоидентичная пересадка невозможна.

Цель генотерапии — улучшить здоровье пациента путем коррекции мутантного фенотипа. Для этого необходимо введение в соматические клетки нормального гена. Помимо этических и технических трудностей, не нужно и нежелательно изменять половые клетки пациента, получающего лечение по поводу генетической болезни.

Одно из опасений — то, что любая попытка внедрить нормальную копию гена в половые клетки (или в оплодотворенное яйцо) несет высокий риск ввести новую мутацию.

В таких случаях обычно не важно, в какой участок генома клетки включается пересаженный ген. В некоторых долгоживущих типах клеток стабильная продолжительная экспрессия может не требовать интеграции введенного гена в основной геном. Например, если переданная ДНК стабилизируется в клетке в форме эписомы (стабильная ядерная, но не хромосомная, молекула ДНК, формируемая, например, аденовирусным вектором, обсуждаемым далее) и если целевая клетка долгоживущая (например, нейрон, миоцит, гепатоцит), то продолжительная экспрессия может происходить без интеграции ДНК в геном.

Чтобы функционировать в клетке, продукт перенесенного гена должен иметь возможность усваивать кофакторы или другие молекулы, необходимые для его функции. Например, если ген ФАГ внести в клетки костного мозга или мышечные клетки, в норме не синтезирующие кофактор фермента ВН4, этот кофактор следует давать дополнительно перорально.

Во-вторых, генотерапия может использоваться для замены или инактивации доминантного мутантного аллеля, аномальный продукт которого вызывает болезнь. При болезни Гентингтона, например, необходимо заменить ген болезни, содержащий экспансию повторов тринуклеотида CAG или, по крайней мере, сам участок экспансии. Кроме того, можно попытаться разрушить мутантную РНК, не удаляя кодирующий ее ген.

Например, избирательное разложение мутантной мРНК, кодирующей доминантный коллаген pro-альфа-11(I), вызывающий несовершенный остеогенез, в принципе должно уменьшать костные аномалии при этом заболевании. Как уже упоминалось, в лабораторных исследованиях показано, что для избирательного разрушения мутантной мРНК может использоваться синтетический ген, кодирующий небольшую интерферирующую РНК.

Наконец, в-третьих, генотерапия может быть наиболее широко использована для получения фармакологических эффектов. От этого метода, вероятно, получат пользу пациенты с опухолями.

Стратегии передачи генов в генотерапии

Для передачи соответствующего искусственного гена в целевые клетки используют одну из двух основных стратегий. Во-первых, используют введение гена в полученные от пациента клетки ex vivo (т.е. за пределами организма), а затем вновь вводят их в организм. При втором методе ген вводят непосредственно в ткань или внеклеточную жидкость (из которых он выборочно усваивается целевыми клетками).

«Нацеливание» при этом типе передачи обычно достигают модификацией оболочки вирусного вектора, так чтобы вирусные частицы связывались только определенными клетками.

Генная и клеточная терапии

Спецпроект о генной и клеточной терапиях, тернистом пути их развития, первых успехах и надеждах, а также о сложностях регулирования, производства и изучения этих новейших методов лечения.

Партнер спецпроекта — Департамент разработки генотерапевтических препаратов одной из крупнейших российских биотехнологических компаний — BIOCAD. BIOCAD заслужил серьезные позиции на мировом фармацевтическом рынке благодаря выпуску лекарственных препаратов на основе антител.

В XX веке медицина и фармацевтика совершили невероятный скачок. Были созданы и внедрены в широкую практику самые разные лекарства — от антибиотиков до первых терапевтических антител, — благодаря чему существенно улучшилось здоровье и самочувствие многих людей, а также выросла средняя продолжительность жизни. Однако прогресс не остановить: доставка нужных генов прямо в клетки и ткани организма или их направленное редактирование позволяют «починить» неисправные молекулярные процессы, что дает в сравнении с традиционной фармацевтикой принципиально новые возможности для терапии ранее неизлечимых болезней. А поскольку технологии не стоят на месте, в будущем генная терапия займет важнейшее место в арсенале медиков.

Во второй статье нашего спецпроекта мы расскажем об особенностях регулирования генных и клеточных продуктов, о трудностях, с которыми сталкиваются разработчики в связи с невообразимой сложностью этих лекарств и о способах, которыми обеспечивается качество в процессе их разработки и производства.

Новостей о клеточной терапии становится всё больше. Мы много слышим о стволовых клетках, которые якобы помогают от множества болезней. Немного меньше — об успехах клеточной терапии в лечении редких наследственных и онкологических заболеваний. В рамках спецпроекта по генной и клеточной терапии разберемся, в каком состоянии сейчас находится эта область, какие тут применяются технологии, какие есть проблемы и успехи.

Генная терапия стремительно врывается в нашу жизнь, а ведь еще вчера она казалась будто сошедшей со страниц научной фантастики. Сегодня же упоминание вирусных векторов для доставки генов стало обыденным: они вовсю используются создателями вакцин от COVID-19, а профилактическая вакцинация такими препаратами совсем скоро должна стать повсеместной. Однако занятно другое: на переднем крае создания генных продуктов оказался один маленький вирус, который и полноценным патогеном-то назвать сложно: самостоятельно размножаться он не умеет. Речь об аденоассоциированном вирусе (AAV), векторы на основе которого стали ныне популярным средством доставки лечебных генов в клетку. О необычайной судьбе этих обладающих уникальными свойствами частиц, прошедших путь от «неизвестной примеси» до ключевого элемента передовой науки, и хотелось бы рассказать в этой статье.

Читайте также: