Пересадка ядра при генетических болезнях. Терапевтическое клонирование

Обновлено: 02.05.2024

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Обзор посвящен актуальному биомедицинскому направлению в заместительной клеточной терапии — терапевтическому клонированию, которое является наиболее универсальным подходом для получения пациент-специфичных линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с колоссальными возможностями в поддержании и восстановлении здоровья человека. В обзоре также представлены альтернативные подходы и тенденции в получении ЭСК человека, которые, в отличие от терапевтического клонирования, пока далеки от выхода в клиническую практику. Уникальная ценность ЭСК в лечебных целях определяет серьезную потребность в развитии терапевтического клонирования и в нашей стране.

Введение

Основой для возникновения одного из самых перспективных биомедицинских направлений в заместительной клеточной терапии — терапевтического клонирования явились два важнейших открытия конца XX века. Это, во-первых, создание клонированной овечки Долли [1], во-вторых, получение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) из бластоцист [2] и примордиальных зародышевых клеток человека [3]. В первом случае убедительно показано для млекопитающих, что если в энуклеиро-ванный овоцит ввести ядро соматической клетки взрослого организма, то под влиянием цитоплазмы овоцита ядро такой клетки репрограммируется и способно дать начало развитию эмбриона (клона), геном которого идентичен геному организма — донора ядер. Во втором случае показано, как можно получать и культивировать ЭСК человека. Объединение этих двух важных достижений создает принципиальную возможность получения паци-ент-специфичных линий ЭСК и на их основе прогени-торных клеток, детерминированных в определенном направлении (например, клетки гематопоэтического ряда), которые, по существу, будут клетками самого пациента, и полностью с ним иммуносовместимыми. В этом состоит главный смысл и главная цель терапевтического клонирования. Сейчас основными источниками получения стволовых клеток непосредственно для биомедицинских работ являются стволовые клетки из пуповинной крови и стволовые клетки взрослых. Оба источника имеют серьезные ограничения: стволовые клетки пуповинной крови аутогенны только вновь рожденным, а получение стволовых клеток от самого пациента небезопасно для него. Кроме того, по общему мнению, потенциальные возможности к дифференцировке у этих клеток ниже, чем у ЭСК. Очевидно, что наиболее универсальный и надежный источник получения стволовых клеток (СК) человека — с помощью технологий клонирования.

Перспективные потребности в терапевтическом клонировании

Можно уверенно утверждать, что перспективные потребности в терапевтическом клонировании неограниче-ны, поскольку этот подход позволяет практически для каждого человека создать собственный банк линий СК. Так как эти клетки быстро размножаются, их можно получать в любом количестве. Человек, по существу, станет обладать неограниченным запасом собственных стволовых и прогениторных клеток различной детерминации.

Если основываться на современных представлениях об огромной роли в нормальном функционировании человеческого организма природного пула стволовых клеток, который резко беднеет с возрастом, то становятся совершенно очевидными колоссальные возможности терапевтического клонирования в поддержании и восстановлении здоровья человека в процессе его жизни, в преодолении различных недугов и в продлении его активного возраста [4]. Жизненные возможности каждого конкретного человека при этом резко обогащаются.

Сейчас в ряде стран приняты законы, разрешающие исследования с ЭСК человека, хотя морально-этические проблемы, связанные с использованием для этого человеческих эмбрионов, по-прежнему продолжают вызывать в обществе самые острые дебаты в истории биомедицинской науки [5]. Обычно в репродуктивной практике получают примерно 24 овоцита от каждой женщины-клиента и лишь два-четыре эмбриона используют затем для имплантации в надежде, что один из них будет нормально развиваться в ходе беременности. Многие эмбрионы, остающиеся после искусственного оплодотворения, будут разрушены в любом случае, даже спустя годы хранения в криобанках. Менее 3% таких эмбрионов доступны сейчас для исследований [6]. В то же время, специальный анализ, проведенный в США, Канаде, Англии, Австралии и в других странах показал, что пациенты центров репродукции в преобладающем большинстве предпочли бы передать остающиеся ово-циты и эмбрионы в дар для научных исследований, в том числе и для получения СК [7—*10],

Совсем недавно в марте 2009 г. в США были законодательно разрешены исследования с эмбрионами и ЭСК человека в биомедицинских целях с проведением соответствующих клинических испытаний [11], хотя, фактически, эксперименты в этом направлении были начаты в 2006 г. в Гарвардском университете. Многомиллионные проекты по созданию клонированных человеческих эмбрионов с целью получения ЭСК были запущены также и в Австралии. С учетом этих фактов нет никаких сомнений, что терапевтическое клонирование в ближайшее время станет ведущим направлением в заместительной клеточной терапии и биомедицинской практике в мире. Уникальная ценность ЭСК в лечебных целях определяет серьезную потребность в развитии терапевтического клонирования и в нашей стране. Очевидно, что законодательное разрешение в России на проведение таких научно-исследовательских работ в определенных жестких этических рамках является сейчас важнейшей и насущной потребностью. Необходимо заметить, что терапевтическое клонирование человека и репродуктивное клонирование это принципиально разные по своим целям направления, и, безусловно, репродуктивное клонирование человека должно быть под строгим запретом по фундаментальным биологическим причинам, не говоря уже о возникающих при этом сложных этических, правовых и социальных проблемах.

Мировые тенденции развития терапевтического клонирования

Огромные возможности технологий терапевтического клонирования пока продемонстрированы на животных модельных объектах. Первая работа по терапевтическому клонированию опубликована в 2000 г. и была выполнена на мышах [12]. В работе было показано, что линии ЭСК из клонированных эмбрионов состоят из клеток с такими же плюрипотентными свойствами, как и обычные ЭСК. Затем появились десятки таких работ и сделаны удачные попытки при использовании технологии клонирования корректировать имеющиеся у экспериментальных животных патологии, в частности, комбинированный иммунодефицит [13]. Тем самым были продемонстрированы серьезные возможности сочетания терапевтического клонирования с генной терапией для успешного лечения различных генетических заболеваний.

Альтернативные подходы в получении пациент-специфичных линий ЭСК

Одновременно в мире ведется интенсивный поиск альтернативных возможностей для получения пациент-специфичных линий ЭСК в биомедицинских целях. Одна из возможностей состоит в пересадке ядер соматических клеток человека в овоциты животных. Стремительно возросший интерес к терапевтическому клонированию в лечении различных заболеваний требует получения ЭСК в больших количествах. Однако, даже в условиях законодательного благоприятствования, человеческих овоцитов и зародышей для этого всегда будет очень ограниченное количество, а их получение — дорогостоящим. Нехватка человеческих овоцитов, необходимых в исследовательских целях, может быть восполнена использованием овоцитов животных, которые более доступны. Гибридные гетероплазмичные эмбрионы с геномом человека и смешанной цитоплазмой человека и животного представляют собой привлекательную и удобную модельную систему для решения многих фундаментально-практических вопросов терапевтического клонирования. При проведении исследований строго запрещено имплантировать полученные гибридные эмбрионы в матку человека или животного, а также длительно выращивать их in vitro (более 14 сут).

Первая успешная работа в этом направлении принадлежит группе китайских ученых [22], которые методом переноса ядер соматических клеток человека (фибробластов) в энуклеированные кроличьи овоциты получили гибридные реконструированные эмбрионы и затем линии ЭСК. Тщательный анализ показал, что эти ЭСК фенотипически сходны с обычными человеческими ЭСК, включая способность к разнообразным клеточным диф-ференцировкам. Таким образом, оказалось возможным получать линии стволовых клеток человека без участия человеческих овоцитов. Эти же исследователи затем осуществили перенос ядер фибробластов человека в энуклеированные коровьи овоциты [23] и показали, что и в таких гибридах наблюдается перепрограммирование ядер клеток человека с соответствующей активацией эмбриональной генной экспрессии. Гибридные эмбрионы развивались до поздних предимплантационных стадий, что важно для генерации в дальнейшем ЭСК.

Проведение аналогичных исследований было разрешено в Англии, однако все усилия повторить работу китайских ученых оказались безуспешными: не удалось методом межвидовой пересадки ядер добиться развития таких же реконструированных гибридных эмбрионов человека и животных до стадии получения бластоцист и ЭСК [24, 25]. Аналогичные попытки межвидовой пересадки ядер человека, предпринятые в США, оказались тоже неудачными [26]. На основании большой серии опытов по переносу ядер соматических (кумулюс-ных) клеток человека в овоциты человека и различных животных: коров, кроликов и мышей, было показано, что в гибридах человека и животных не достигается соответствующего репрограммирования ядер, как в клонированных человеческих эмбрионах, у которых паттерн генной экспрессии был, практически, идентичен с нормальными человеческими эмбрионами. Особенно критично, что в гибридных эмбрионах отсутствовала экспрессия генов плюрипотентности, что необходимо для получения СК.

По мнению ряда исследователей, дефекты в развитии гибридов человека и животных могут быть связаны не только с недостаточным перепрограммированием эпигенетического статуса соматических ядер человека, но и с полной несовместимостью ядерного генома человека и митохондриального генома животного [27, 28]. Реконструированные гибридные зародыши выживают непродолжительное время только за счет человеческих митохондрий, поскольку ядра соматических клеток человека, как правило, переносятся в овоциты животного вместе с цитоплазмой [28]. Таким образом, на основании всех этих данных был сделан вывод, что овоциты животных не пригодны для использования в качестве реципиентов ядер человеческих клеток, и получение ЭСК человека из таких зародышей практически невозможно [26].

Другим подходом для создания пациент-специфичных плюрипотентных стволовых клеток является индукция дедифференцировки соматических клеток с помощью самих ЭСК, что было показано методом соматической гибридизации сначала на мышах [29, 30], а затем с ЭСК человека [31, 32]. Стволовые клетки при слиянии с соматическими клетками являются поставщиками факторов, требуемых для эпигенетического репрограммирования генома соматических клеток с соответствующей индукцией плюрипотентных свойств и характеристик [33, 34]. Показана возможность репрограммирования ядер соматических клеток с помощью экстракта ЭСК [35] и предприняты попытки селективной элиминации ЗСК-хро-мосом [36, 37], однако удаление всех хромосом технически пока мало достижимо, и рассматриваемый способ получения стволовых клеток в целом далек от выхода в терапевтическую практику.

Наиболее многообещающим альтернативным подходом для создания пациент-специфичных линий из соматических клеток в биомедицинских целях является получение ЗСК-подобных клеток или индуцированных плюрипотентных линий СК CiPSD. Это новое направление исследований в заместительной клеточной терапии, начало которому положила работа ученых из Японии 2006 г. на мышах по перепрограммированию фибро-бла-стов до статуса, аналогичного плюрипотентному [38]. Вскоре была показана возможность такой трансформации для фибробластов человека [39]. Генетическую модификацию фибробластов проводили с помощью ретровирусной трансфекции четырех ключевых факторов плюрипотентности: 0ct3/4, Sox2, Klf4, с-Мус, и последующая экспрессия этих генов индуцировала репрограммирование соматических клеток с возвратом к плюрипотентному состоянию. Хотя эффективность такого подхода была очень низка, и известно также, что использование вирусных векторов может приводить к малигниза-ции iPS-клеток, эти работы стали сенсацией [40—42]. Последовала целая серия исследований с факторами индукции и был предпринят активный поиск других способов введения генов в соматические клетки (не прибегая к ретровирусам) с минимизацией модификации генома [43—48]. В результате на мышах была показана возможность безопасного способа репрограммирования клеток с использованием транспозонов и всего одного фактора Klf4 [49].

Тем не менее, iPS-клетки преждевременно считать адекватной альтернативной заменой ЭСК для регенеративной терапии [50]. В биомедицинских целях необходимо репрограммировать собственные гены клеток вместо добавления новых копий и только технологии терапевтического клонирования предоставляют уникальную возможность такого репрограммирования ядер соматических клеток. Обратимость программы экспрессии генов под воздействием цитоплазмы овоцитов, возврат к паттерну эмбриональной экспрессии в соматических донорских ядрах позволяет в настоящее время рассматривать реконструированные эмбрионы человека как основной источник получения пациент-специфичных линий ЭСК.

Состояние исследований по терапевтическому клонированию в России

Несмотря на бум по поводу больших возможностей ЭСК в лечении различных заболеваний, работы по терапевтическому клонированию в России пока практически не ведутся. В первую очередь это объясняется отсутствием законодательной базы для проведения исследований с использованием овоцитов и эмбрионов человека. С принятием таких законов для России существует реальная возможность очень быстрого развития терапевтического клонирования. В нашей стране имеются эффективные клеточные технологии получения реконструированных эмбрионов методом трансплантации ядер. По-существу, основы современных технологий переноса ядер соматических клеток, сочетающие микрохирургию и электрослияние были разработаны впервые у нас в 80-х годах прошлого столетия [51]. Также имеются эффективные технологии получения линий человеческих ЭСК [52].

Реализовывать задачи терапевтического клонирования возможно на основе центров репродукции, которые помимо их прямого предназначения, могут стать центрами по получению линий ЭСК, в первую очередь, непосредственно для женщин — пациенток данного центра и любых членов их семей. Можно ожидать, что с развитием терапевтических технологий получение собственных ЭСК станет доступно каждому человеку. Необходимо осуществлять тесное сотрудничество центров репродукции с соответствующими научно-исследовательскими лабораториями, ориентированными на решение фундаментальных проблем и на разработку новых технологий. К подобным технологиям можно отнести реконструкцию эмбрионов с применением неинвазивных оптико-лазерных приемов микроманипулирования в целях терапевтического клонирования и заместительной клеточной терапии [53]. Разработка таких приемов приведет к появлению нового класса микроманипуляци-онной аппаратуры, совмещающей различные оптиколазерные микроинструменты (оптический пинцет, лазерный скальпель и т.д.) с компьютеризированным управлением. Следует ожидать, что при соответствующей последовательной направленной научно-организационной работе в отношении развития в нашей стране терапевтического клонирования, Россия может достичь в обозримом будущем зарубежного уровня в этой области биомедицинских исследований.

Пересадка ядра при генетических болезнях. Терапевтическое клонирование

Пересаженные клетки сохраняют генотип донора, поэтому пересадку можно рассматривать как форму генотерапии, поскольку она приводит к изменению соматического генома.

Для использования трансплантации при лечении генетических болезней существуют два основных показания. Во-первых, клетки или органы могут пересаживаться с целью введения копии генов дикого типа пациенту с мутациями.

Это показание имеет интересное следствие, что иногда приходится удалять полностью нормальный орган, поскольку его биохимическая дисфункция повреждает другие ткани. Так происходит, например, при гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, при которой эффективна пересадка печени, но она относится к процедурам высокого риска.

По мере накопления опыта с частичной пересадкой трансплантации целого органа, выполняемые по этим показаниям, должны становиться более редкими. Второе и более частое показание — пересадка клеток с целью компенсации органа, повреждаемого генетической болезнью (например, цирротической печени при недостаточности а1-антитрипсина).

Пересадка ядра при генетических болезнях

Пересадка ядер (также называемая переносом ядра или ядерным клонированим) — новая технология, имеющая большой потенциал для регенеративной медицины, также вызывает огромную дискуссию из-за пугающих этических проблем, связанных с ее использованием.

Пересадка ядра — перенос диплоидного ядра из соматической клетки, например, фибробласта кожи взрослого донора в цитоплазму овоцита (т.е. овоцита, собственное ядро которого предварительно удалено), с целью получения клонированного эмбриона.

Терапевтическое клонирование — использование эмбриональных стволовых клеток с пересаженным ядром для формирования различных типов клеток организма в культуре. Поскольку клетки, полученные при этой технике, генетически идентичны ядру донора, они могли бы использоваться для пересадки полученных клеток донору без опасения иммунной реакции.

Эту концепцию называют терминами «терапия пересадкой ядра» или «терапевтическое клонирование». Клетки, получаемые в ходе терапевтического клонирования, могли бы, в принципе, использоваться для лечения огромного числа болезней человека, как моногенных, так и генетически комплексных. Экспериментальные исследования на животных моделях показали, что таким методом возможно вылечить многие болезни.

Тем не менее в настоящее время применение данной технологии встречает множество трудностей. Во-первых, есть серьезные биологические ограничения, включая то, что экспрессия генов в клонированных клетках, как правило, значительно нарушена. Во-вторых, использование эмбрионов человека для терапевтического клонирования, независимо от возможных терапевтических преимуществ, отвергаются по многочисленным причинам этического характера.

В отличие от терапевтического, репродуктивное клонирование имеет отношение к процессу реимплантации эмбриона, полученного при пересадке ядра, в матку суррогатной матери, с целью позволить эмбриону развиться в клон человека-донора, ядро соматической клетки которого было использовано. Репродуктивное клонирование запрещено во всех странах из-за сложных этических вопросов, связанных с созданием клонов человека.

Видео генетика клонирования ДНК

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Генотерапия генетических болезней. Требования

Технология рекомбинантной ДНК предоставила замечательные возможности лечения генетических болезней на наиболее фундаментальном уровне — уровне непосредственно гена. Принцип генотерапии достаточно прост: ввести в клетку ген для достижения терапевтического эффекта.

При наследственных болезнях наиболее частое применение генотерапии — введение функциональных копий важного гена в соответствующие клетки пациента с мутацией, приводящей к утрате функции (поскольку такими мутациями вызвано большинство генетических болезней). Таким образом, возможна коррекция обратимых признаков для многих генетических заболеваний.

В действительности эта простая, предложенная уже десятилетия назад концепция оказалась неожиданно сложной в практическом применении. Однако первые успехи генотерапии у человека показаны на примере продолжительного (более 5 лет) эффекта коррекции двух форм тяжелого комбинированного иммунодефицита у детей (обсуждаемого позже) и на больших исследованиях животных моделей нескольких других болезней.

Минимальные требования, необходимые для использования переноса генов при лечении генетических заболеваний, представлены ниже.

Требования, необходимые для генотерапии наследованных заболеваний

• Сущность молекулярного дефекта. Должна быть известна сущность патологического гена или, по крайней мере, биохимическая природа заболевания.

• Функциональная копия гена. Должна быть доступны кДНК клона гена или сам ген. Если ген или к ДНК слишком велики для текущего поколения векторов, может оказаться достаточной функциональная версия гена с удаленными несущественными компонентами для уменьшения его размера.

• Знание патофизиологического механизма. Знание патофизиологического механизма болезни должно быть достаточным, чтобы понимать, как передача гена будет улучшать или корректировать патологический процесс и предохранять, замедлять или восстанавливать важные фенотипические отклонения. Мутации с потерей функции требуют введения функционального гена; для болезней с доминантным аллелем может потребоваться инактивации мутантного гена или его продуктов.

• Благоприятное соотношение риск/польза. Должны быть реальная тяжесть болезни и благоприятное соотношение потенциальных риска и пользы по сравнению с альтернативными методами лечения.

• Подходящие регулирующие компоненты для переносимого гена. Точное регулирование уровня экспрессии гена сравнительно неважно при некоторых болезнях и критично при других. Например, при талассемии избыточная экспрессия переданного гена будет вызывать новый дисбаланс цепей глобина в эритроцитах, а низкий уровень экспрессии окажется нерезультативным.
При некоторых энзимопатиях даже несколько процентов нормальной экспрессии могут вызвать терапевтический эффект, а аномально высокие уровни экспрессии могут не обладать вредными последствиями.

• Подходящая целевая клетка. Считают, что целевая клетка должна иметь длинный период жизни или хороший репликативный потенциал in vivo. Она также должна быть доступной для прямого введения гена или иметь возможность доставлять к ней (например, через кровоток) число копий гена, достаточное для достижения терапевтического эффекта.
Возможности для генотерапии часто увеличиваются, если целевые клетки могут культивироваться in vitro, что облегчает перенос гена; в этом случае необходима возможность введения достаточного количества клеток пациенту и их функционально интегрировать в соответствующем органе.

• Надежное подтверждение эффективности и безопасности. Необходимы доказательства как эффективности, так и безопасности используемых векторов и генов исследованиями на животных и культурах клеток. В идеале должно быть показано, что генотерапия эффективна, безопасна и имеет длительный эффект в генетических исследованиях на модели болезни у крупных животных.
В настоящее время многочисленные животные модели существуют только для нескольких моногенных болезней. Более широко используются искусственно созданные или спонтанные мутации у мышей.

• Разрешение регулирующих органов. Важно наличие одобрения протокола лечения соответствующими государственными организациями. В большинстве стран исследования по генотерапии человека требуют разрешения правительства.

Пересадка стволовых клеток при генетических болезнях. Эффективность

Стволовые клетки — самообновляющиеся клетки, которые характеризуются двумя свойствами:
1) способностью размножаться, формируя клетки различных типов тканей in vivo и
2) способностью самообновляться, формируя другие стволовые клетки.

Эмбриональные стволовые клетки, способные построить целый организм.

Использование эмбриональных стволовых клеток для лечения болезней в настоящее время — тема большой научной, этической и политической дискуссии. Тем не менее, если появится возможность дифференциации эмбриональных стволовых клеток в различные типы клеток для использования в качестве замены утраченных или поврежденных болезнью, взгляды общества на такое лечение могут измениться.

В настоящее время в клинических целях используют только два типа стволовых клеток — кроветворные, которые могут изменить кроветворную систему после пересадки костного мозга; и роговичные, используемые для регенерации эпителия роговицы. Возможность клинического использования стволовых клеток других типов в будущем огромна, поскольку их исследование — одна из наиболее активных и перспективных областей биомедицинских исследований.

Стволовые клетки обнаружены во многих различных зрелых тканях, включая, например, кожу или мозг, как у людей, так и у животных, и существует надежда, что эти клетки окажутся способными регенерировать утраченные или поврежденные клетки того типа ткани, из которой они произошли. Хотя легко преувеличить потенциал такого лечения, оптимизм в связи с будущим терапии стволовыми клетками вполне оправдан.

Пересадка кроветворных стволовых клеток при болезнях, не сопровождающихся накоплением метаболитов

Кроме применения при лечении опухолей, пересадка кроветворных стволовых клеток с использованием стволовых клеток костного мозга является также методом выбора при лечении группы моногенных нарушений иммунитета, включая тяжелые комбинированные иммунодефициты любого типа. Их роль в лечении генетической болезни вообще, тем не менее, оценивают осторожно.

Например, отличные результаты получены при пересадке костного мозга для лечения бета-талассемии у пациентов до 16 лет. Однако для каждой болезни, при которой пересадка костного мозга может приносить пользу, результаты следует оценивать в течение многих лет и сравнивать с результатами, полученными при других видах лечения.

Пересадка стволовых кроветворных клеток при лизосомных болезнях накопления

Пересадка стволовых кроветворных клеток костного мозга. Пересадка стволовых клеток костного мозга эффективна при лечении лизосомных болезней накопления во многих тканях, включая, для некоторых болезней, мозг.

Во-первых, пересаженные клетки служат источником лизосомных ферментов, способных передаваться в другие клетки через внеклеточную жидкость, что впервые показано в экспериментах по совместному культивированию клеток больных с синдромами Гурлер и Хантера.

Поскольку клетки, происходящие из костного мозга, составляют около 10% общей массы клеток тела, количественное влияние ферментов, передающихся из них, может быть значимым.

Во-вторых, система мононуклеарных фагоцитов в большинстве, если не во всех тканях, происходит из стволовых клеток костного мозга, поэтому после пересадки костного мозга эта система во всем организме становится донорского происхождения.

Пересадка костного мозга исправляет или уменьшает висцеральные нарушения при многих болезнях накопления, включая, например, болезнь Гоше. Нормализация или уменьшение в размере печени, селезенки и сердца также достигается при синдроме Гурлер, кроме того, улучшаются проходимость верхних дыхательных путей, общая подвижность и ослабление помутнения роговицы.

Полезным оказалось влияние пересадки и на неврологический компонент болезни. Пациенты, имевшие перед пересадкой хорошие показатели развития и перенесшие пересадку до 24-месячного возраста, после пересадки костного мозга продолжают интеллектуально развиваться, в отличие от неотвратимой утраты интеллектуальных функций в противном случае. Интересно, что в костном мозге донора обнаруживается эффект дозы генов; дети, получившие донорские клетки от гомозиготных нормальных доноров, с большей вероятностью сохраняют нормальный интеллект, чем реципиенты клеток гетерозиготных доноров.

Еще более радикальное влияние на неврологическую патологию при болезни накопления наблюдается после пересадки костного мозга пациентам с поздней формой глобоидноклеточной лейкодистрофии (или болезни Краббе) — дегенеративном заболевании белого вещества мозга.

Пациенты с поздним началом болезни, вызванной недостаточностью фермента галактоцереброзидазы, имеют начало клинических проявлений в возрасте от полугода до трех лет. В отсутствие лечения заболевание характеризуется неуклонной дегенерацией центрального и периферического миелина, спастичностью, деменцией и периферической нейропатией.

Реципиенты испытывали не только замедление процесса болезни, но и фактическое улучшение или нормализацию таких симптомов, как тремор, атаксия, моторная дискоординация и другие нарушения. Впечатляет, что даже структурные дефекты белого вещества в мозге пролеченных пациентов часто обратимы.

Пересадка стволовых кроветворных клеток из плацентарной крови при генетических болезнях

Открытие того факта, что плацентарная кровь — богатый источник кроветворных стволовых клеток, оказало заметное влияние на лечение наследственных болезней. Использование плацентарной крови имеет три больших преимущества перед костным мозгом как источником переносимых стволовых кроветворных клеток. Во-первых, реципиенты более гистосовместимы с плацентарной кровью, чем с другими клетками аллогенного донора.

Таким образом, приживление происходит, даже если между донором и реципиентом не совпадают три антигена HLA (поверхностные клеточные маркеры, кодируемые генами МНС). Во-вторых, широкая доступность плацентарной пуповинной крови с повышенной гистосовместимостью клеток донора существенно расширяет количество потенциальных доноров для любого реципиента. Эта характеристика особенно значима для пациентов из малых этнических групп со сравнительно небольшим пулом потенциальных доноров. В-третьих, при использовании плацентарных клеток в значительной степени уменьшается риск реакции «трансплантат против хозяина».

При лечении синдрома Гурлер пересадка плацентарной крови неродственных доноров оказалась такой же эффективной, как пересадка костного мозга от совместимого донора. При неонатальной форме болезни Краббе пересадка плацентарной крови играет особую роль, поскольку интеллектуальное развитие может быть сохранено только в том случае, если пересадку проводят очень рано (желательно до 45 дней жизни), до возникновения клинической симптоматики.

Поскольку рамки терапевтических возможностей при неонатальной форме болезни Краббе настолько узки, большая доступность и эффективность стволовых клеток плацентарной крови, в отличие от сложностей поиска подходящего донора для пересадки костного мозга, дают большое преимущество.

В данном обзоре рассматриваются возможности использования в медицине метода репрограммирования взрослых стволовых клеток человека в плюрипотентные (пребывающие в состоянии неполной дифференцировки). Именно плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) обладают способностью при дальнейшем их развитии преобразовываться в структурные компоненты любых органов и систем. Данные клетки не могут развиться в полноценный организм (эмбрион), что сразу же исключает этический барьер как тормозящий фактор в такого рода исследованиях. Метод индукции репрограммирования стволовых клеток (ИРСК) содержит в себе огромный потенциал для дальнейшего развития терапевтического клонирования как перспективного медицинского направления.

1. Учебник для студентов высших учебных заведений / Под ред. акад. РАО Н.В. Чебышева. – М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агенство», 2016. – 640 с.: ил.

2. Masako Tada, Yousuke Takahama, Kuniya Abe, Norio Nakatsuji, Takashi Tada. (2001). Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Current Biology. 11, 1553-1558;

4. Кузьмина Е.Ю. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для геннотерапевтической модели мыши: выпускная квалификационная работа бакалавра. Санкт-Петербург, 2016. 51 с.

Введение. Современная медицина активно разрабатывает и внедряет в практику разнообразные биотехнологии, которые открывают возможности для более полной и точной диагностики и лечения патологических состояний, ранее недоступных для коррекции. Идея регенеративной терапии различных заболеваний с использованием стволовых клеток - одно из магистральных направлений медицинской науки. К перспективным технологиям в контексте данного направления относится терапевтическое клонирование.

Терапевтическое клонирование заключается в получении пациент-специфичных линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), обладающих колоссальными возможностями в поддержании и восстановлении здоровья человека. С биологической точки зрения, терапевтическое клонирование – это то же репродуктивное клонирование, но с ограниченным (до 14 дней) сроком роста эмбриона. По прошествии обозначенного временного промежутка процесс размножения клеток приостанавливается. Название метода предопределено тем, что образующиеся в течение двух недель эмбриональные клетки способны в дальнейшем преобразоваться в дифференцированные клетки различных органов: сердца, печени, поджелудочной железы, почек и т.д. Этот факт благоприятствует использованию данного метода в медицине для терапии многих заболеваний [5].

Выделяя стволовые клетки из эмбриона, срок жизни которого не более 3 - 4 дней, их дальнейший алгоритм развития в лабораторных условиях можно спроектировать в любом направлении. В теории, стволовые клетки способны дать начало любой структуре тела человека, способной заместить патологически изменный фрагмент или даже орган. В том случае, если они получены из тканей, взятых у человека, которому выращивают трансплантат (аутотрансплантация), также решается проблема гистосовместимости при пересадке.

Технология искусственного получения эмбриональных стволовых клеток с помощью клонирования активно разрабатывается в комплексе с биохимическими направлениями по созданию специальных питательных сред для культивирования живых тканей.

При ПЯСК осуществляется перенос ядра, извлеченного из соматической клетки пациента, в цитоплазму энуклеированного ооцита, находящегося в метафазе второго деления мейоза. Как результат, развивающийся эмбрион будет генетической копией донора ядра. По достижении стадии бластоцисты, из ее клеточной массы выделяют клонированные ЭСК и производят исследования свойств полученных клеточных культур [1, с. 207].

Проведение экспериментов с использованием яйцеклеток человека затрудняют различные проблемы этического и биомедицинского характера. Это законодательные нюансы, связанные с получением разрешений регулирующих органов, проблема оценки качества образовавшихся в организме клеток, риск возникновения мутаций при генно-инженерных манипуляциях и т.д.

Разработка методик формирования линий стволовых клеток человека, несущих генетический материал пациента (полученных методом ПЯСК), откроет широкие перспективы для дальнейших исследований в области клеточной терапии.

Индукция репрограммирования стволовых клеток (ИРСК) человека в плюрипотентные стволовые клетки происходит при внедрении в клетки исходной культуры генов плюрипотентности, способных вернуть взрослые клетки в эмбриональное состояние.

Лаборатория японского учёного С. Яманаки работала над поиском факторов, поддерживающих в ЭСК программу плюрипотентности. Было найдено несколько десятков генов, активность которых в ЭСК была намного выше, чем в дифференцированных клетках. К моменту исследования уже был открыт и тот факт, что слияние ЭСК и специализированной клетки может дать две плюрипотентные клетки [2].

Вооруженная этим знанием, группа учёных внедрила в клетку фибробласта вектор с 24 генами, заставившими часть клеток дать колонии, подобные стволовым клеткам, и принялась по одному удалять гены из этого набора. В результате был установлен список из четырех генов: c-Myc, Oct4, Sox2 и Klf4 (Nanog и Lin28). Стоит отметить, что схема репрограммирования основана на внедрении в культуру соматических клеток человека ретровирусов, несущих такой генный набор. Полученные клетки, названные индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК), возникли в результате вышеупомянутой процедуры, имеющей крайне низкий выход, однако применяемые технологии селекции позволяют обнаружить даже одну перепрограммированную клетку на сотни тысяч. Далее последовала серия работ этой и других лабораторий, в которых исследователи оптимизировали состав перепрограммирующих факторов и способ введения вектора в клетку, чтобы повысить эффективность перепрограммирования и снизить вероятность образования опухолевых клеток в результате вызываемой метаморфозы [3].

Гены Sox2 и Oct4 кодируют ключевые белки, необходимые для пролиферации (деления) и поддержания плюрипотентности стволовых клеток. Продукты генов c-Myc и Klf4 способствуют активации Sox2 и Oct4. Ген c-Myc является протоонкогеном: при его гиперэкспрессии может происходить злокачественная трансформация нормальных клеток. Продукт гена Nanog требуется для индукции плюрипотентности соматических клеток. В последних исследованиях была показана целесообразность замены c-Myc и Klf4 на Lin28 и Nanog. Дальнейшую селекцию культур ИПС клеток проводят по соответствию морфологических (компактность колоний, высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение и т.д.), иммуногистохимических и генетических характеристик с ЭСК человека [4, с. 9].

Получение стволовых клеток методами ИРСК и ПЯСК не является равноценными и по технологии, и по возможным осложнениям. Применение в клеточной терапии методик, основанных на использовании ретровирусной трансфекции и внесения в клетки протоонкогенов, может представлять опасность. Несмотря на то, что сторонники метода ИРСК уверяют, что указанные проблемы легко преодолимы, сторонники ПЯСК убеждены в необходимости ускорения исследований в наиболее спорных направлениях (использование яйцеклеток человека в ПЯСК и т.д.) для скорейшего внедрения методики переноса ядра, как наиболее перспективной и безопасной. Наряду с этим, пока недостаточно проработаны гарантии безопасности биологического материала при генно-инженерных манипуляциях. Для успешного развития и внедрения в медицинскую практику данных технологий требуется не только детальная разработка вариантов самой методики, но и определение чётких показаний и противопоказаний для ее применения. Кроме того, необходимо наличие совершенных критериев оценки и методов коррекции отдаленных результатов, обучение высококвалифицированных специалистов, совершенствование материальной базы клиник и законодательной базы.

Тем не менее, несмотря на имеющиеся сложности, терапевтическое клонирование отмечается большинством специалистов как одно из наиболее перспективных направлений в заместительной клеточной терапии и, в целом, в мировой научной практике. Важнейшей потребностью сейчас является получение законодательного разрешения на проведение исследований, способствующих стремительному развитию данного направления, и преодоление уже выявленных недостатков и сложностей биомедицинского характера.

Читайте также: