Патогенез (биохимические основы) болезни Гентингтона. Молекулярная генетика

Обновлено: 04.05.2024

Хорея Гентингтона — это наследственное, медленно прогрессирующее заболевание нервной системы, характеризующееся хореическими гиперкинезами, психическими нарушениями и прогрессирующей деменцией. Заболевание диагностируется с помощью молекулярно-генетического анализа и томографии головного мозга. Этиотропного лечения не разработано. Пациентам проводится симптоматическая терапия, направленная на подавление гиперкинезов. Прогноз неблагоприятный.

МКБ-10

Общие сведения

Хорея Гентингтона — нейродегенеративное заболевание с аутосмоно-доминантной наследственностью, характеризующееся деменцией и моторными нарушениями. Понятию «хорея Гентингтона» соответствуют также: болезнь Гентингтона, хорея наследственная, хорея дегенеративная, хорея прогрессирующая хроническая. Популяционная частота - 1:10 000. Обычно хорея Гентингтона начинает проявляться клинически в возрастном периоде от 20 до 50 лет. Заболевание имеет неблагоприятный прогноз, летальный исход наступает в среднем через 10-13 лет после манифестации заболевания.

Причины

Ген хореи Гентингтона находится на коротком плече хромосомы 4р16.3. Он кодирует белок гентингтин, функция которого до конца не выяснена. Однако известно, что аномальный белок токсичен для нейронов головного мозг, что и обусловливает постепенную атрофию церебральных структур. Способ наследования - аутосомно-доминантный, возможна передача дефектного гена как по женской, так и по мужской линии.

Патогенез

Доказано, что хорея Гентингтона развивается в результате увеличения числа тринуклеотидных повторов — цитозин-аденин-гуанин, расположенных в первом экзоне гена. Триплет цитозин-аденин-гуанин кодирует аминокислоту глутамин, поэтому в белке образуется удлиненный полиглутаминовый тракт. Формируя подобие «замка-застежки», расширенный полиглутаминовый участок белка гентингтина изменяет свою собственную информацию и прочно соединяется с другими белками. В результате происходит агрегация белков, нарушаются межбелковые взаимодействия, что приводит к апоптозу клеток.

Симптомы хореи Гентингтона

Хорея Гентингтона манифестирует, как правило, в возрасте от 20 до 50. Случаи ювенильной формы заболевания довольно редки (не более 10%); наиболее ранний дебют заболевания, известный на сегодняшний день — 3 года. Типичное проявление хореи Гентингтона у взрослых — хореический синдром, в подростковом возрасте он встречается редко. Локализация хореических гиперкинезов приходится на лицевую мускулатуру, что вызывает выразительные гримасы с высовыванием языка, подергиванием щек, поочередным нахмуриванием и/или приподниманием бровей.

В ряде случаев наблюдались гиперкинезы в руках в виде быстрого сгибания и разгибания пальцев, в ногах — в виде поочередного скрещивания и разведения ног в сторону. Движения обычно не столь стремительны, как при малой хорее, но сложнее, иногда замедленные (по типу атетоидных). С прогрессированием хореи Гентингтона гиперкинезы усиливаются, приобретают характер атетоза и резко выраженной дистонии, впоследствии переходящей в ригидность.

При ювенильных формах хореи Гентингтона в 50% случаев заболевание манифестирует в виде брадикинезии и ригидности. Судороги возникают в 30-50% случаев (в отличие от взрослых пациентов). С развитием заболевания у больных происходит расстройство речевой функции. В первую очередь возникают проблемы со звукопроизношением, семантическая и синтаксическая структура речи остается сохранной до последней стадии заболевания. Со временем меняются скорость речи и ее ритм.

Глазодвигательные нарушения наблюдаются в большинстве случаев на ранних стадиях хореи Гентингтона. У пациентов нарушается автоматизация саккадирующих движений глазных яблок: удлиняется латентный период начала саккадирующих движений глаз, снижается скорость перевода взора и точность слежения. С развитием заболевания у большинства пациентов возникает вертикальный, реже горизонтальный, иногда комбинированный нистагм.

Диагностика

На КТ или МРТ головного мозга определяют атрофию головок хвостатых ядер, которая нарастает по мере прогрессирования заболевания. Верификацию диагноза «хорея Гентингтона» проводят на молекулярно-генетическом уровне. С помощью полимеразной цепной реакции определяют количество поворотов триплета цитозин-аденин-гуанин в гене HD. У взрослых пациентов количество повторов превышает 36, при ювенильной форме заболевания — 50.

Лечение хореи Гентингтона

На сегодняшний день специфическое лечение не разработано. Показано симптоматическое лечение у невролога, основной целью которого является борьба с хореическими гиперкинезами. Назначают препараты, снижающие активность дофаминергических систем головного мозга (галоперидол, резерпин). Дозу препарата увеличивают каждые 2-3 дня. Эффективность стереотаксических операций для лечения хореи Гентингтона не доказана.

Прогноз и профилактика

В большинстве случаев хореи Гентингтона прогноз на жизнь малоблагоприятный. Смерть, обусловленная различными осложнениями (пневмония, застойная сердечная деятельность), наступает через 10-13 лет течения заболевания. Продолжительность жизни пациентов колеблется от 45 до 55 лет.

В отсутствии методов обследования, позволяющих выявить носителей патогена до проявлений клинических признаков хореи Гентингтона, медико-генетическая консультация представляет определенные затруднения. Семьям пациентов не рекомендуют в дальнейшем иметь детей.

Патогенез (биохимические основы) болезни Гентингтона. Молекулярная генетика

Болезни экспансии нестабильных повторов: механизмы развития, классификация

Типы наследования болезней, вызванных экспансией нестабильных повторов, включают неустойчивую динамическую природу мутаций, вызванных экспансией в пределах патологического гена в области транскрибируемого участка, управляющих последовательностей, как, например, в кодоне глутамина (CAG) при болезни Гентингтона и при большинстве нейродегенеративных заболеваний — спинно-мозжечковых атаксий (для которых обнаружено по крайней мере девять локусов), или тринуклеотидов в некодирующих участках РНК, включая CGG при синдроме ломкой Х-хромосомы, GAA при атаксии Фридрейха и CTG при миотонической дистрофии 1.

Хотя все описанные вначале болезни нуклеотидных повторов вызваны экспансией тринуклеотидных повторов, сейчас обнаружены заболевания, происходящие вследствие экспансии более длинных повторов; это тетрануклеотид (CCTG) при миотонической дистрофии 2 (генокопия миотонической дистрофии 1) и пентануклеотид (АТТСТ) при спинно-мозжечковой атрофии 10. Поскольку патологический ген передается от поколения к поколению, количество повторов может увеличиваться в разы, в конце концов создавая помехи нормальной экспрессии и функции гена.

Увеличение числа повторов от поколения к поколению объясняет феномен антиципации — проявления болезни в более раннем возрасте при передаче в семье. Наиболее часто предлагаемый биохимический механизм, лежащий в основе экспансии последовательности повторов, — неравное спаривание «со сдвигом». Примечательно, что экспансии повторов, оказывается, происходят не только в размножающихся клетках, типа сперматогониев (в ходе мейоза), но и в неразмножающихся соматических клетках, например в нейронах.

Следовательно, экспансия может происходить, в зависимости от болезни, в ходе обеих репликаций ДНК и при использовании генома (т.е. при репарации ДНК).

По неясным причинам болезни нестабильных нуклеотидных повторов первично неврологические; клиническая симптоматика включает атаксию, когнитивные дефекты, деменцию, нистагм, паркинсонизм и спастичность. Тем не менее иногда включаются и другие системы, что иллюстрируют некоторые обсуждаемые здесь болезни.

Патогенез болезней вызванных экспансией нестабильных повторов

Болезни экспансии нестабильных повторов разнообразны по своим патогенетическим механизмам и могут быть подразделены на три класса.

• Класс 1: болезни экспансии некодирующих повторов, вызывающие дисфункцию белков, нарушая транскрипцию патологического гена преРНК. Примеры: синдром ломкой Х-хромосомым и атаксия Фридрейха.

• Класс 2: болезни экспансии некодирующих повторов, вызывающие появление новых свойств РНК. Примеры: миотоническая дистрофия 1 и 2, синдром тремора/атаксии с ломкой Х-хромосомой (FXTAS — fragile Х-associated tremor/ataxia syndrome).

• Класс 3: болезни экспансии кодирующих повторов (например, глутаминового триплета С AG), вызывающие новые свойства мутантного белка. Примеры: болезнь Гентингтона, спинно-мозжечковые атаксии.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Болезнь Гентингтона: причины, диагностика, лечение

Этиология и встречаемость болезни Гентингтона. Болезнь Гентингтона (MIM № 143100) — панэтническое аутосомно-доминантное прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, вызванное мутациями в гене HD. Распространенность болезни Гентингтона колеблется от 3 до 7 на 100 000 среди западных европейцев до 0,1—0,38 на 100 000 среди японцев. Эти изменения распространенности отражают изменения в распределении аллелей болезни Гентингтона и гаплотипов, предрасполагающих к мутации.

Патогенез болезни Гентингтона

Продукт гена HD, белок генгтинтин, экспрессируется повсеместно. Функция генгтинтина остается неизвестной.

Болезнетворные мутации в гене HD обычно вызваны экспансией последовательности повторов CAG в экзоне 1, кодирующем полиглутаминовую цепочку; в норме аллели HD имеют от 10 до 26 повторов триплета CAG, тогда как мутантные аллели имеют больше 36 повторов. Приблизительно у 3% пациентов болезнь Гентингтона развивается в результате новой экспансии повторов CAG; 97% наследуют мутантный аллель HD от больного родителя.

Новые мутантные гены болезни Гентингтона возникают вследствие перехода премутации (27-35 повторов CAG) в полную мутацию. До настоящего времени все описанные пациенты наследовали новую полную мутацию от отца.

Экспансия полиглутаминового участка генгтинтина приводит к появлению у него нового свойства, и как необходима, так и достаточна для индукции болезни Гентингтона. Кроме выраженной рассеянной атрофии неостриатума, основного признака болезни Гентингтона, экспрессия мутантного генгтинтина вызывает дисфункцию нейронов, общую атрофию мозга, изменения уровней нейромедиаторов и накопление ядерных и цитоплазматических агрегатов в нейронах. В итоге экспрессия мутантного генгтинтина вызывает гибель нейронов; тем не менее похоже, что клинические симптомы и дисфункция нейронов предшествуют развитию внутриклеточных агрегатов и смерти нейронов. Механизм того, как экспрессия увеличенного числа глутаминовых остатков вызывает болезнь Гентингтона, остается неясным.

Фенотип и развитие болезни Гентингтона

Возраст начала болезни обратно пропорционален числу повторов CAG в гене HD. Пациенты с началом болезни во взрослом возрасте обычно имеют 40-55 повторов; в юношеском возрасте — обычно более 60 повторов. Пациенты с 36-41 повторами CAG имеют неполную пенетрантность, т.е. у них болезнь может не развиться в течение всей жизни. За исключением возраста начала, число повторов не влияет на другие проявления болезни Гентингтона.

Нестабильность и экспансия повторов CAG часто приводит к явлению антиципации, т.е. более раннему возрасту начала в последующих поколениях семьи. Достигнув однажды значения 36, число повторов увеличивается в ходе сперматогенеза отца; экспансия при материнской передаче мутации встречается реже. Поскольку число повторов триплета CAG обратно коррелировано с возрастом начала, индивидуумы, унаследовавшие мутацию от отца, имеют повышенный риск развития болезни с ранним началом; приблизительно 80% молодых пациентов наследуют мутантный ген болезни Гентингтона от отца.

Приблизительно треть пациентов имеют психиатрические нарушения; две трети — комбинацию познавательных и двигательных нарушений. Средний возраст пациентов на начало болезни — 35-44 года; приблизительно у четверти пациентов болезнь Гентингтона проявляется после 50 лет и у одной десятой — до 20 лет. Среднее выживание после установления диагноза — 15-18 лет, а средний возраст смерти — 54-55 лет.

Для болезни Гентингтона характерны прогрессирующие двигательные, познавательные и психиатрические расстройства. Двигательные нарушения включают как произвольные, так и непреднамеренные движения. Первоначально эти движения создают незначительные помехи ежедневной деятельности, но обычно приводят больного к нетрудоспособности по мере развития болезни.

Хорея, присутствующая у более чем 90% пациентов, — наиболее частая форма непроизвольного гиперкинеза; характеризуется неповторяющимися непериодическими толчками, которые не могут быть подавлены усилием воли. Познавательные нарушения начинаются в начале болезни и влияют на все аспекты познания; речь обычно затрагивается позднее, чем другие функции.

Поведенческие нарушения, обычно развивающиеся в ходе болезни, включают антиобщественное поведение, агрессию, взрывы гнева, апатию, сексуальные отклонения и повышенный аппетит. Психиатрические проявления, развивающиеся на любой стадии болезни, включают изменения личности, легкие психозы и шизофрению.

В конечных стадиях болезни Гентингтона обычно развиваются настолько выраженные двигательные нарушения, что больные полностью зависят от постороннего ухода. Они также теряют массу тела, у них появляются нарушения сна и мутизм. С течением болезни поведенческие нарушения уменьшаются.

Особенности фенотипических проявлений болезни Гентингтона:
• Возраст начала: от подросткового до старости
• Двигательные нарушения
• Познавательные нарушения
• Психиатрические нарушения

Лечение болезни Гентингтона

К настоящему времени никакого эффективного лечения при болезни Гентингтона нет. Помощь сводится к уходу и фармакологическому лечению поведенческих и неврологических проблем.

Риск наследования болезни Гентингтона

Каждый ребенок родителя с болезнью Гентингтона имеет 50% риск унаследовать мутантный аллель болезни Гентингтона. За исключением аллелей с неполной пенетрантностью (36-41 повтор CAG), у всех детей, унаследовавших мутантный аллель, если они имеют нормальную продолжительность жизни, развивается болезнь Гентингтона.

Дети отцов, несущих премутацию, имеют эмпирический приблизительно 3% риск унаследовать аллель болезни Гентингтона, в котором премутация перешла в полную мутацию. Тем не менее не все мужчины, несущие премутацию, равновероятно передают полную мутацию.

Доклиническое тестирование и пренатальная диагностика доступны благодаря анализу числа повторов CAG в 1 экзоне гена HD. Доклиническое тестирование и пренатальная диагностика — методики прогностические, поэтому лучше интерпретируются в случае подтверждения экспансии CAG у больного члена семьи.

Пример болезни Гентингтона. М.П., 44-летний мужчина, отметил ухудшение памяти и внимания. По мере снижения интеллектуальных функций в течение последующего года у него развились непроизвольные движения пальцев кистей и стоп, а также мимических мышц лица типа гримасничания. Он понимал свое состояние и впал в депрессию. До этого М.П. был здоров, и в его анамнезе не было аналогично больных родственников; его родители погибли в сорокалетнем возрасте в автокатастрофе. У пациента одна здоровая дочь.

После углубленного осмотра невролог диагностировал состояние больного как болезнь Гентингтона. Диагноз болезни Гентингтона подтвержден анализом ДНК, показавшим наличие 43 повторов триплета CAG в одном из аллелей гена HD (в норме не более 26). Последующее пресимптоматическое обследование дочери показало, что она также унаследовала мутантный аллель HD. Оба получили подробную консультацию.

Видео пример хореи Гентингтона

Синдром Жильбера - симптомы и лечение

Что такое синдром Жильбера? Причины возникновения, диагностику и методы лечения разберем в статье доктора Васильева Романа Владимировича, гастроэнтеролога со стажем в 15 лет.

Над статьей доктора Васильева Романа Владимировича работали литературный редактор Маргарита Тихонова , научный редактор Сергей Федосов

Определение болезни. Причины заболевания

Синдром Жильбера — это генетический пигментный гепатоз с аутосомно-доминантным типом наследования, протекающий с повышением уровня неконъюгированного (свободного) билирубина, чаще проявляющееся в период полового созревания и характеризующийся доброкачественным течением [1] .

Краткое содержание статьи — в видео:

Синонимы названия болезни: простая семейная холемия, конституциональная или идиопатическая неконъюгированная гипербилирубинемия, негемолитическая семейная желтуха.

По распространённости данное заболевание встречается не менее, чем у 5 % населения, в соотношении мужчин и женщин — 4:1. Впервые заболевание описал французский терапевт Августин Жильбер в 1901 году.

Чаще синдром Жильбера проявляется в период полового созревания и характеризуется доброкачественным течением. Основным проявлением этого синдрома является желтуха.

К провоцирующим факторам проявления синдрома можно отнести:

голодание или переедание;
жирную пищу;
некоторые лекарственные средства;
алкоголь;
инфекции (грипп, ОРЗ, вирусный гепатит);
физические и психические перегрузки;
травмы и оперативные вмешательства.

Причина заболевания — генетический дефект фермента УДФГТ1*1, который возникает в результате его мутации. В связи с этим дефектом функциональная активность данного фермента снижается, а внутриклеточный транспорт билирубина в клетках печени к месту соединения свободного (несвязанного) билирубина с глюкуроновой кислотой нарушается. Это и приводит к увеличению свободного билирубина.

При обнаружении схожих симптомов проконсультируйтесь у врача. Не занимайтесь самолечением - это опасно для вашего здоровья!

Симптомы синдрома Жильбера

Некоторые специалисты трактуют синдром Жильбера не как болезнь, а как физиологическую особенность организма.

До периода полового созревания данный синдром может протекать бессимптомно. Позже (после 11 лет) возникает характерная триада признаков:

желтуха различной степени выраженности;
ксантелазмы век (жёлтые папулы);
периодичность появления симптомов [1] .

Желтуха чаще всего проявляется иктеричностью (желтушностью) склер, матовой желтушностью кожных покровов (особенно лица), иногда частичным поражением стоп, ладоней, подмышечных впадин и носогубного треугольника.

Заболевание нередко сочетается с генерализованной дисплазией (неправильным развитием) соединительной ткани.

Усиление желтухи может наблюдаться после перенесения инфекций, эмоциональной и физической нагрузки, приёма ряда лекарственных препаратов (в частности, антибиотиков), голодания и рвоты.

Клиническими проявлениями заболевания общего характера могут быть:

слабость;
недомогание;
подавленность;
плохой сон;
снижение концентрации внимания.

В отношении ЖКТ синдром Жильбера проявляется снижением аппетита, изменением привкуса во рту (горечь, металлический привкус), реже возникает отрыжка, тяжесть в области правого подреберья, иногда наблюдается боль ноющего характера и плохая переносимость лекарственных препаратов.

При ухудшении течения синдрома Жильбера и существенном повышении токсичной (свободной) фракции билирубина может появляться скрытый гемолиз, усиливая при этом гипербилирубинемию и добавляя в клиническую картину системный зуд.

Патогенез синдрома Жильбера

В норме свободный билирубин появляется в крови преимущественно (в 80-85 % случаев) при разрушении эритроцитов, в частности комплекса ГЕМ, входящего в структуру гемоглобина. Это происходит в клетках макрофагической системы, особенно активно в селезёнке и купферовских клетках печени. Остальная часть билирубина образуется из разрушения других гемсодержащих белков (к примеру, цитохрома P-450).

У взрослого человека в сутки образуется приблизительно от 200 мг до 350 мг свободного билирубина. Такой билирубин слаборастворим в воде, но при этом хорошо растворяется в жирах, поэтому он может взаимодействовать с фосфолипидами ("жирами") клеточных мембран, особенно головного мозга, чем можно объяснить его высокую токсичность, в частности токсичное влияние на нервную систему.

Первично после разрушения комплекса ГЕМ в плазме билирубин появляется в неконъюгированной (свободной или несвязанной) форме и транспортируется с кровью при помощи белков альбуминов. Свободный билирубин не может проникнуть через почечный барьер за счёт сцепления с белком альбумином, поэтому сохраняется в крови.

В печени несвязанный билирубин переходит на поверхность гепатоцитов. С целью снижения токсичности и выведения в клетках печени свободного билирубина при помощи фермента УДФГТ1*1 он связывается с глюкуроновой кислотой и превращается в конъюгированный (прямой или связанный) билирубин. Конъюгированный билирубин хорошо растворим в воде, он является менее токсичным для организма и в дальнейшем легко выводится через кишечник с желчью.

При синдроме Жильбера связывание свободного билирубина с глюкуроновой кислотой снижается до 30% от нормы, тогда как концентрация прямого билирубина в желчи увеличивается.

В основе синдрома Жильбера лежит генетический дефект — наличие на промонторном участке A(TA)6TAA гена, кодирующего фермент УДФГТ1*1, дополнительного динуклеотида ТА. Это становится причиной образования дефектного участка А(ТА)7ТАА. Удлинение промонторной последовательности нарушает связывание фактора транскрипции IID, в связи с чем уменьшается количество и качество синтезируемого фермента УДФГТ1, который участвует в процессе связывания свободного билирубина с глюкуроновой кислотой, преобразуя токсичный свободный билирубин в нетоксичный связанный.

Вторым механизмом развития синдрома Жильбера является нарушение захвата билирубина микросомами сосудистого полюса клетки печени и его транспорта глутатион-S-трансферазой, которая доставляет свободный билирубин к микросомам клеток печени.

В конечном итоге вышеперечисленные патологические процессы приводят к увеличению содержания свободного (несвязанного) билирубина в плазме, что обуславливает клинические проявления заболевания [6] .

Классификация и стадии развития синдрома Жильбера

Общепринятой классификации синдрома Жильбера не существует, однако условно можно разделить генотипы синдрома по полиморфизму.

CRISPR/Cas против болезни Гентингтона

Сегодня, по данным Гарвардского центра нейроисследований, только в США около 5 млн человек страдают от болезни Альцгеймера; 1 млн — от болезни Паркинсона; 400 тыс. — от рассеянного склероза; по 30 тыс. — от бокового амиотрофического склероза (болезнь Лу Герига) и болезни Гентингтона. Эти расстройства, относящиеся к группе нейродегенеративных заболеваний, плохо изучены, и для них отсутствуют эффективные способы лечения. Решить эту проблему может помочь инструмент редактирования генов — система CRISPR/Cas9, которая на сегодняшний день активно и успешно применяется в биологии и медицине.

Об авторах

Туяна Баировна Маланханова — аспирант Новосибирского государственного университета, старший лаборант лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Автор и соавтор 3 научных работ и 1 монографии.

Сурен Минасович Закиян — доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией эпигенетики развития Института цитологии и генетики, лабораторией стволовой клетки Центра новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск); лабораторией молекулярной и клеточной медицины Национального медицинского исследовательского центра им. акад. Е. Н. Мешалкина (Новосибирск), лабораторией клеточной инженерии ФЕН Новосибирского государственного университета. Автор и соавтор более 200 научных работ, в том числе 33 монографий, и 5 патентов.

За последние десятилетия средняя продолжительность жизни человека увеличилась, и теперь большее число людей доживает до того возраста, когда могут начать проявляться различные болезни, связанные со старостью. К таким «болезням старости» относятся и нейродегенеративные заболевания, большинство которых характеризуется постепенной и избирательной гибелью специфических типов нервных клеток. Причинами этих болезней чаще всего являются нарушения в геноме.

Рассмотрим эту проблему на примере болезни Гентингтона (другие названия — синдром Гентингтона, хорея Гентингтона или Хантингтона), проявляющейся такими симптомами, как нарастающая потеря двигательного контроля и психические расстройства. Несмотря на то, что генетическая мутация, вызывающая это заболевание, была выявлена более 20 лет назад, молекулярные механизмы его развития все еще до конца не выяснены, так же как не найдено эффективной терапии этой болезни.

У людей с болезнью Гентингтона наблюдаются неправильные и неконтролируемые движения практически всех мышц тела («пляска святого Витта»), а также психические и когнитивные нарушения. Это тяжелое заболевание обычно начинает проявляться после 35 лет и имеет прогрессирующий характер.

Моделируем болезнь

Причина болезни Гентингтона — увеличение числа тринуклеотидных повторов CAG в гене НТТ, кодирующем белок гентингтин. В норме в этом гене содержится от 8 до 36 повторов, но, когда это число достигает 37 и более, начинается развитие заболевания. Триплет CAG кодирует аминокислоту глутамин. Соответственно, при болезни Гентингтона синтезируется гентингтин с удлиненной полиглутаминовой цепочкой. Такой белок имеет неправильную пространственную структуру и не может выполнять свою функцию в клетках, которая, кстати сказать, до сих пор точно неизвестна. Кроме того, в стриатуме, одном из отделов мозга, регулирующих мышечный тонус, мутантный белок формирует агрегаты, обладающие токсическим эффектом. При этом тяжесть протекания болезни напрямую зависит от числа повторов CAG.

Чтобы исследовать молекулярные процессы, приводящие к развитию патологии, а также для тестирования новых лекарственных препаратов, нужна биологическая модель, максимально близко воспроизводящая болезнь человека. Для создания модели болезни Гентингтона ученые внесли в геном лабораторных мышей мутантный ген НТТ человека. Однако результаты, полученные в подобных «мышиных» моделях, не всегда точно отражают процессы, протекающие в организме человека. Выход — клеточные линии, полученные от человека.

Для изучения болезни Гентингтона необходимо иметь клетки стриатума, но получить такой биоматериал затруднительно. Эта проблема решается с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые достаточно легко с помощью перепрограммирования можно получить из клеток кожи или крови человека. Далее эти клетки можно наращивать в неограниченных количествах и дифференцировать (превращать) в практически любой нужный тип клеток.

Система геномного редактирования CRISPR/Cas9 сегодня используется для создания клеточных линий, моделирующих болезнь Гентингтона, через получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток человека

Обычно при моделировании болезней используют клетки от больных людей, а в качестве контроля — от здорового донора. Однако из-за наличия в геноме людей огромного числа однонуклеотидных полиморфизмов такие пары клеток не совсем корректно сравнивать. Идеальным контролем для «больных» клеток будут клетки с точно таким же геномом, но уже без мутации, вызывающей заболевание. Такие клетки называют изогенными парами или линиями. Для создания изогенных линий и используют инструмент для редактирования генов CRISPR/Cas9.

Исследуем генное окружение

Несмотря на то, что болезнь Гентингтона является моногенным заболеванием, т. е. обусловлена мутацией в одном гене, известно более 100 так называемых генов-модификаторов, которые могут повлиять на время возникновения первых симптомов, тяжесть заболевания и т. д. Наиболее удобным инструментом для выяснения роли этих генов в патогенезе болезни Гентингтона является система GeCKO на основе CRISPR/Cas9 (Shalem et al., 2014). Она позволяет создавать целые библиотеки генных мишеней для CRISPR/Cas9 и выключать тысячи генов всего лишь за пару этапов. Таким образом, можно за короткий срок произвести нокаут (выключение) всех генов-модификаторов и выяснить, как это влияет на жизнеспособность клеток, скорость их деления и т. д.

С помощью инструментов на основе CRISPR/Cas9 сейчас можно редактировать не только геном, т. е. наследственную информацию, но и эпигеном, который отражает изменения в работе генов, не затрагивающие структуру ДНК. Благодаря геномному редактированию у нас появилась возможность менять уровень экспрессии целевых генов. Для этого уже разработаны инструменты, в которых используется «выключенный» Cas9, к нему присоединены различные ферменты, способные активировать или, напротив, подавлять уровень наработки того или иного белка. Например, в случае болезни Гентингтона можно специфически подавлять синтез мутантного белка, тем самым препятствуя образованию белковых агрегатов и гибели нейронов стриатума.

Однако можно активировать и соединения, которые будут способствовать ускоренному удалению или деградации белков с неправильной структурой. Например, такой эффект достигается за счет активации белков теплового шока (шаперонов), которые прикрепляют «метки смерти» к неправильным белкам. Помеченные таким образом белки попадают в специальные клеточные структуры, где и разрушаются.

Кроме того, инструменты для модификации эпигенома на основе CRISPR/Cas9 способны изменять уровень синтеза белка за счет модификации хроматина — компактного комплекса ДНК, РНК и белков в хромосомах. Можно вносить такие модификации в хроматин, которые приведут к более «рыхлой» укладке ДНК, что активирует транскрипцию (считывание генетической информации на РНК). Другие же модификации могут, наоборот, способствовать более компактной укладке ДНК и замедлять или даже полностью блокировать транскрипцию.

Лечим?

CRISPR/Cas9 можно использовать и для лечения болезни Гентингтона. Есть два варианта воздействия: укорочение повторов CAG или специфическое выключение мутантной копии гена.

В первом случае с помощью CRISPR/Cas9 вносятся двунитевые разрывы в последовательность с повторами. Однако такое вмешательство имеет и обратный результат — увеличение числа повторов CAG. Проблема была решена путем использования никаз Cas9 — мутантных белков Cas9, которые вносят в ДНК однонитевые разрывы. Эксперимент показал, что последовательные однонитевые разрывы в регионах с повторами в худшем случае не изменяют длину участка с повторами, а в лучшем — приводят к его ожидаемому укорочению (Cinesi et al., 2016).

Схема укорочения удлиненного тракта повторов CAG гена HTT с помощью стандартной системы CRISPR/Cas9, вносящей в ДНК двунитевые разрывы, и с использованием никаз Cas9, которые вносят однонитевые разрывы. По: (Cinesi et al., 2016)

Использовать стратегию выключения гена можно в тех редких случаях, когда между двумя копиями гена НТТ имеются однонуклеотидные различия. Если такие полиморфизмы будут находиться по обе стороны от участка с неправильными повторами, их можно будет использовать как мишени для «ножниц» CRISPR/Cas9. При этом нормальная копия гена не будет затронута (Shin et al., 2016).

Исследования болезни Гентингтона с применением системы CRISPR/Cas9 сегодня проводятся и в России. Так, в лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск) ведутся работы по получению изогенных линий стволовых клеток, моделирующих болезнь Гентингтона, путем внесения удлиненных трактов CAG в нормальный ген НТТ, а также по дифференцировке ИПСК в нейроны стриатума. В дальнейшем новосибирские исследователи планируют перейти к изучению роли генов-модификаторов в патогенезе этой болезни с использованием клеточной модели.

Есть основания надеяться, что результаты исследований приведут к созданию эффективного метода лечения. Кроме того, они, возможно, помогут при изучении других нейродегенеративных заболеваний, развитие которых обусловлено подобной мутацией.

Литература
1. Медведев С. П. Как отредактировать наследственность // Наука из первых рук. 2014. Т. 55. № 1. С. 10–14.
2. Cinesi C., Aeschbach L., Yang B., Dion V. Contracting CAG/CTG repeats using the CRISPR-Cas9 nickase // Nat. Commun. 2016. V. 7. P. 13272–13281.
3. Shalem O., Sanjana N. E., Hartenian E. et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells // Science. 2014. V. 343. N. 6166. P. 84–87.
4. Shin J. W., Kim K.-H., Chao M. J., et al. Permanent inactivation of Huntington’s disease mutation by personalized allele-specific CRISPR/Cas9 // Hum. Mol. Genet. 2016. V. 25. N. 20. P. 4566–4576.

Читайте также: