Микроскопия и культивирование в стоматологии. Определение чувствительности к антибиотикам

Обновлено: 25.04.2024

Для чего нужен анализ на чувствительность к антибиотикам

Микроорганизмы по отношению к конкретному виду антибиотика могут характеризоваться как чувствительные, условно-устойчивые и устойчивые. Чувствительными патогенными микроорганизмами являются те, что подавляются рекомендованными дозами антибактериального препарата. Условно-устойчивые для подавления требуют увеличение дозы. Активность устойчивых патогенных микроорганизмов не подавляется даже повышенными дозами антибиотика.

Чувствительность микрофлоры к антибиотикам индивидуальна: у разных людей бактерии могут реагировать на одни и те же антибиотики по-разному. Поэтому назначение антибактериальных препаратов на основании лишь среднестатистической картины не всегда дает желаемый лечебный эффект. Между тем любой антибиотик – это серьезное лечебное средство, обладающее побочными действиями. В частности, при его применении гибнут не только патогенные бактерии, но и полезные микроорганизмы. Может получиться ситуация, когда антибиотик уничтожит полезную микрофлору, а возбудитель заболевания не пострадает – по причине его устойчивости к данному антибиотику.

Чтобы обеспечить эффективность проводимого курса антибактериальной терапии, врач должен быть уверен, что назначаемый им антибиотик действительно справится с выявленным возбудителем заболевания. Для этого и нужен анализ на чувствительность к антибиотикам.

Когда назначается анализ на чувствительность к антибиотикам

Анализ на чувствительность микрофлоры к антибиотикам назначается, если необходимо:

• определить наиболее эффективно действующий препарат. Чаще всего анализ на чувствительность к антибиотикам назначается при лечении ЗППП, но необходимость в нем может возникнуть и при лечении других инфекционных заболеваний;
• избежать «привыкания» патогенных микроорганизмов к антибиотику – в случаях повторного использования антибактериальной терапии в течение ограниченного периода времени;
• заменить один препарат на другой, например, в случае проявления аллергической реакции.

Как делается анализ на чувствительность к антибиотикам

АО Семейный доктор - Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

Для анализа используется различный биологический материал – в зависимости от заболевания это может быть моча, кал, мазок (из влагалища, уретры, с задней стенки глотки), грудное молоко, мокрота, слюна, и т.д.

Анализ на чувствительность к антибиотикам относится к культуральным (микробиологическим) исследованиям. Поэтому другое его название – посев на чувствительность к антибиотикам.

В «Семейном докторе» для анализа чувствительности к антибиотикам используется также автоматический анализатор Vitek, обеспечивающий высокую стандартизацию и компьютеризацию исследования.автоматический анализатор

Сколько времени занимает анализ на чувствительность к антибиотикам

Автоматический анализатор

В зависимости от метода анализа результаты анализа поступают к врачу через 2-3 дня после сдачи материала в лабораторию.

Как долго действительны результаты анализа на чувствительность к антибиотикам

Анализ на чувствительность к антибиотикам действителен только в период заболевания, по поводу которого он был назначен, и до начала антибиотикотерапии. То есть пока не началось лечение антибиотиками, картина остаётся та же, но само лечение может сказаться на чувствительности патогенных организмов к применяемым антибиотикам. Поэтому в случае повторного заболевания анализ может быть назначен снова.

Подготовка к анализу на чувствительность к антибиотикам

Необходимо соблюдать стандартные требования для сдачи каждого вида биологического материала:

• при сдаче мочи собирается средняя порция (первая порция мочи пускается в унитаз). Моча собирается в стерильный контейнер. Перед сбором мочи обязательны гигиенические процедуры;
• грудное молоко собирается до кормления ребенка. Первая порция молока из каждой груди сбрасывается, следующие 0,5-1 мл молока из каждой груди собираются в отдельный стерильный контейнер;
• перед забором мазка из зева и носоглотки не следует есть (в течение 4-5 часов до сдачи анализа);
• если вы сдаете мазок из влагалища, уретры или секрет простаты, желательно воздержаться от половой жизни (в течение 1-2 дней до сдачи анализа).

Где сдать анализ на чувствительность к антибиотикам в Москве

Сделать анализ на чувствительность к антибиотикам (посев на чувствительность к антибиотикам) в Москве Вы можете в АО «Семейный доктор». Сдать биологический материал анализ можно в любой из поликлиник компании.

Оставьте телефон –
и мы Вам перезвоним

Не занимайтесь самолечением. Обратитесь к нашим специалистам, которые правильно поставят диагноз и назначат лечение.

Микроскопия и культивирование в стоматологии. Определение чувствительности к антибиотикам

Биохимические методы идентификации в стоматологии. Биохимия зубных бактерий

В течение всей первой половины XX в. дифференциация микроорганизмов проводилась по их способности утилизировать различные субстраты. В 1911 г. Russell описал среду с двумя сахарами, которая позволяла разделить организмы тифоидные, паратифоидные и дизентерийные. Simmons показал, что с помощью цитрата в качестве единственного источника углерода можно отл ичать роды и виды бактерий, особенно если добавить к среде агар и бромтимоловый синий. В 1946 г. Christinsen ввел в обиход среду, на которой можно было выявить активность уреазы. Одновременно с развитием таких биохимических тестов исследователи приложили немало усилий для сокращения времени, требуемого на реализацию этих тестов.

В 1948 г. Arnold и Weaver описали микротехнику для выявления синтеза индола бактериями за время от 6 мин до 2 ч при условии использования густого инокулюма микроорганизмов в 1 мл среды. В 1949 г. Soto проверил способности микроорганизмов утилизировать углеводы с использованием бумажных дисков, пропитанных углеводами и бромкрезоловым пурпурным. Это сильно уменьшило количество нужной для анализа среды, которая готовилась вручную, и позволило наблюдать результаты всего через 8 ч. В 1962 г. Le Minor и Hamida показали, что результаты по выявлению активности р-галактозидазы можно получить уже через 1 ч. В 1963 г. Vracko и Sherris адаптировали концепцию использования бумажных дисков и полосок для разработки spot-тестов.

В 1964 г. General Diagnostics Division of Warner-Chilcott Laboratories вывела на рынок бумажные полоски с реагентами PathoTec, которые позволяли выявлять некоторые специфические ферменты, синтезируемые клинически значимыми бактериями: лизин- и орнитиндекарбоксилаза, уреаза, фенилаланиндеаминаза, ферменты гидролиза эскулина и синтеза индола. Этим было положено начало коммерческим системам идентификации, ручным и автоматизированным, с помощью которых можно было корректно идентифицировать микроорганизмы.

Все коммерческие биохимические системы идентификации основаны на выявлении пяти основных свойств:
• изменение рН-среды при росте бактерий (требуется 15—24 ч);
• определение активности ферментов (2—4 ч);
• утилизация различных типов углеводов;
• образование видимых колоний микроорганизмов;
• детекция летучих или нелетучих жирных кислот с помощью газовой хроматографии.

Изменение рН-среды происходит из-за жизнедеятельности бактерий (при утилизации преимущественно углеводов накапливаются кислоты, белков — соединения с щелочной реакцией) и выявляется по изменению цвета красителя. Скорость изменения рН зависит от количества внесенных в ячейку клеток бактерий, времени и температуры инкубации. Поскольку время роста клеток в ячейке довольно велико — более 15 ч — все операции требуется проводить асептически во избежание размножения посторонней микрофлоры.

В 1980 г. Bascomb и Spencer описали некоторые автоматизированные методы для измерения активности ферментов в бактериальной суспензии, которые могли дать результаты в течение 6 ч. Изменения цвета в этих системах было следствием гидролиза или обесцвечивания комплекса соответствующего фермента с хромогеном или флюорогеном. Из-за укорочения времени инкубации, нужного для выявления деятельности фермента, проблема контаминации не была актуальной.

Для того чтобы выяснить, какой набор углеводов может использовать микроорганизм для своего роста, в ячейки со средой, отличающейся только видом сахара, вносят суспензию испытуемого микроорганизма и наблюдают за изменением окраски красителя тетразолия фиолетового. Изменение происходит за счет переноса электронов от продукта реакции переработки углевода на краситель: если углевод не усваивается, то окраска меняться не будет.

Четвертый метод — простая визуальная детекция роста проверяемого микроорганизма в присутствии субстрата: размножающиеся клетки вызывают помутнение среды в ячейке. Эта реакция также длительная и требует не менее 10 ч.

Пятый метод идентификации — хроматография конечных продуктов метаболизма жирных кислот — используется не очень широко, но отличается большей информативностью и меньшим временем анализа по сравнению с остальными методами. Основан он на том, что крупные группы микроорганизмов отличаются друг от друга характерным набором фосфолипидов клеточной мембраны. Недостатком данного метода является то, что нельзя идентифицировать роды и виды микроорганизмов.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Изучение качественного состава микроорганизмов в зубном налете, содержимом зубодесневых борозд и ПК проводят с помощью микроскопии в темном поле или фазово-контрастной микроскопии по М. О. Биргеру (1982).

При фазово-контрастной микроскопии определяют процентное содержание пяти морфологических форм микроорганизмов (кокки, неподвижные палочки, подвижные палочки, извитые формы, филаменты). Рассчитывают коэффициент устойчивости микроорганизмов как соотношение неподвижных и подвижных форм микроорганизмов.

Со времен Коха и Пастера культивирование было основным методом выделения и изучения свойств микроорганизмов. Современные знания о свойствах микрофлоры ротовой полости были получены с использованием культуральных методов, и молекулярно-биологические работы по изучению орального микробного сообщества в основном подтверждают данные классических исследований, лишь несколько расширяя спектр микроорганизмов биопленки.

Помимо классических и синтетических сред было разработано множество селективных сред, поддерживающие рост только определенных групп микроорганизмов, и дифференциальных, на которых колонии нужного вида клеток окрашивались, тогда как остальные оставались бесцветными. Однако во всех случаях формирование колонии проводится из единственной клетки — чистой культуры, которая в дальнейшем характеризуется микроскопически и/или по физиологическим и биохимическим свойствам.
Одним из часто применяющихся в клинической практике культуральных микробиологических методов является метод посева по Gold (метод секторных посевов).

Для определения количественного состава микроорганизмов методом посева по Gold материал собирают с помощью стерильного стандартного диска диаметром 6 мм, изготовленного из целлофановой пленки толщиной 40 мкм.

Диск вводят в ПК пуговчатым зондом так, чтобы он был согнут пополам. Оставляют на 1 мин для заполнения пространства между согнутыми краями диска содержимым ПК, после чего диск извлекают пинцетом и помещают в пробирку с фосфатным буфером. Взвесь тщательно гомогенизируют и делают посев на кровяном агаре, используя бактериологическую петлю диаметром 2 мм (емкость 0,005 мл). По окончании инкубации проводят подсчет колоний по секторам.
Количественный состав микроорганизмов оценивают по числу микроколоний на 1 ед. площади диска.

Метод полуколичественной оценки роста аэробной и анаэробной флоры разработан для культивирования факультативных анаэробных микроорганизмов. Материал для микробиологического исследования забирают целлофановым диском и помещают его в пробирки с питательной средой для контроля стерильности, обогащенную пептоном, с добавками твина и гемина (производства г. Оболенск, Московской обл.). Создание анаэробных условий при использовании этой среды обеспечивается содержанием в ее составе тиогликолята натрия.

Образование колоний после инкубации на поверхности питательной среды и в глубину до 1 см оценивают как рост аэробной флоры, а формирование колоний в более глубоких слоях питательной среды — как рост факультативных анаэробных микроорганизмов.

Для выявления дисбиотических сдвигов в полости рта проводят исследование микрофлоры на дисбактериоз по критериям В. В. Хазановой (1996): дисбиотический сдвиг, дисбактериоз I—II, III и IV степени.

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используют два метода: диско-диффузионный и метод разведений антибиотика в плотной или жидкой питательной среде.

Методика С. М. Навашина (1982) заключается в определении чувствительности выделенной микрофлоры к антибиотикам путем диффузии в агар с помощью бумажных дисков, пропитанных антибиотиками.

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют по диаметру окружности свободной от колоний зоны вокруг диска, которая свидетельствует о задержке роста микрофлоры: чувствительный, среднеустойчивый, устойчивый.

Необходимо отметить, что примерно 50—60 % микрофлоры, вегетирующей в тканях пародонта, относятся к трудно культивируемым видам микроорганизмов. Некоторые микробы не формируют видимых глазом колоний. Другие микроорганизмы иногда переходят в некультивируемое состояние при обработке солевыми растворами, ледяной водой, низкими температурами. Третьи просто не способны усваивать питательные вещества из сред, стандартно применяемых для культивирования, так как требуют каких-то симбионтов, или питательных добавок, или нуждаются в особых поверхностях для прикрепления и нормальной жизнедеятельности.
Следовательно, определенные виды микроорганизмов не могут быть получены в виде чистой культуры и могут быть охарактеризованы только косвенно.

Современная молекулярная диагностика в стоматологии. Ценность молекулярной диагностики

Внедрение в практику стоматологии современных молекулярных методов открывает новые перспективы в решении вопросов этиологии и патогенеза стоматологических заболеваний. Несомненно, возможность идентификации новых, малоизученных бактериальных форм, оказывающих влияние на развитие патологических процессов в тканях и органах челюстно-лицевой области, будет иметь существенное значение для решения насущных задач профилактики и лечения.

В настоящее время большинство ученых используют универсальные праймеры в попытках охарактеризовать все микробное сообщество. Однако необходимость создания праймеров, специфичных для микрофлоры ротовой полости, заставляет обратиться к методам культивирования. Ввиду объективных ограничений метода ПЦР и иммунохимического анализа требуется проверка получаемых праймеров и антител на чистой культуре микроорганизмов. Только после такой проверки можно уверенно применять новые препараты в диагностике пародонтита и других заболеваний ротовой полости.

При лечении пациентов с ВЗП нередко применяют антибиотики. Проблема выбора антибактериальных средств, контроля их эффективности, выявление резистентности микроорганизмов к назначенному лечению могут решаться посредством использования молекулярных методов. Поскольку зачастую в клинике антибактериальные препараты назначаются без должного учета всех факторов, задачу внедрения молекулярных методов исследования, в частности ПЦР, в клиническую стоматологию на сегодняшний день следует признать в высшей степени актуальной.

Применение методов молекулярной диагностики также способствует развитию исследований в области изучения генов устойчивости к антибиотикам. Так, ПЦР была использована для выявления локусов ДНК, ответственных за устойчивость к тетрациклину и эритромицину у анаэробных микроорганизмов (Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas). Местное назначение тетрациклина, по данным ряда авторов, может приводить к появлению в ПК бактерий, устойчивых к этому. Согласно Villedieu и соавт. (2002), примерно 11 % культивируемых организмов ротовой полости устойчивы к тетрациклину. Показано разнообразие генов устойчивости к тетрациклину в микрофлоре ротовой полости у взрослых здоровых лиц.

Интересные результаты были продемонстрированы этими авторами при исследовании образцов слюны и зубных бляшек, полученных от 20 здоровых взрослых, не принимающих антибиотики в течение предыдущих 3 мес. Было описано 8 классов генов устойчивости к тетрациклину, кодирующих рибосомный белок и найденных у Veilonella, Prevotella, Streptococcus, Staphylococcus, Streptomyces, Lactobacillus, Neisseria, Enterococcus. Гены устойчивости обнаружены как у грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов.

Гены устойчивости грамотрицательных микроорганизмов широко распространены по геному и связаны с большими плазмидами, большинство из которых способно перемещаться. Гены устойчивости грамположительных микроорганизмов обычно находятся на малых передающихся плазмидах. Показано, что некоторые бактерии (Neisseria, Haemophilus, Streptococcus) распространяют гены устойчивости к тетрациклину посредством транспозонов. В другом исследовании было обнаружено, что многие виды бактероидов несут большое количество новых самопередающихся хромосомных элементов с геном устойчивости к тетрациклину Тс. Некоторые элементы несут также ген устойчивости к эритромицину Tm. Эти элементы вставлены в хромосому бактероидов и передаются самостоятельно от хромосомы донора к хромосоме реципиента.

Следует признать, что изучение устойчивости у бактерий ротовой полости к различным антибиотикам в настоящее время является одним из приоритетных научных направлений.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ: Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии (Н.А.Семина, С.В.Сидоренко); Государственным научным центром по антибиотикам (С.П.Резван, С.А.Грудинина); Научно-исследовательским институтом антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии (Л.С.Страчунский, О.У.Стецюк, Р.С.Козлов, М.В.Эйдельштейн); Кафедрой микробиологии и химиотерапии Российской медицинской академии последипломного образования (Е.А.Ведьмина, Л.Г.Столярова, И.В.Власова); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (З.С.Середа).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 4 марта 2004 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН "Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков", утв. Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР В.Е.Ковшило 10 марта 1983 г. N 2675-83.

1. Область применения

1.1. В настоящих методических указаниях изложены стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (методы серийных разведений и диско-диффузионный метод).

1.2. Методические указания предназначены для применения в микробиологических лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и здравоохранения.

2. Общие сведения

Определение чувствительности микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП) - приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотико-резистентности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП (диско-диффузионный и серийных разведений) были разработаны во второй половине 60-х - начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений.

Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотико-резистентности у микроорганизмов потребовало более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к интерпретации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.

В настоящих методических указаниях систематизированы современные подходы к определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека, учитывающие рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США.

Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для решения следующих задач:

- обоснование целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни отдельным пациентам;

- обоснование эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов;

- осуществление наблюдения за распространением антибиотико-резистентности в отдельных учреждениях или географических регионах;

- исследование новых химических соединений на наличие антибактериальной активности.

3. Показания для исследования чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам

В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АБП показано далеко не во всех случаях. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП является обязанностью врача-бактериолога.

Определять чувствительность к АБП представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания, бактерий, выделенных из объектов внешней среды, за исключением случаев проведения специальных исследований, нецелесообразно.

Обязательному исследованию на чувствительность к АБП подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма.

Определение чувствительности выделенного штамма микроорганизма показано, если уровень его устойчивости к АБП не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма. Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение природной чувствительности или резистентности микроорганизма к АБП не является целью практических исследований.

Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.

При обнаружении на плотных питательных средах после первичного посева смешанной культуры исследовать антибиотикочувствительность до идентификации и оценки этиологической значимости отдельных микроорганизмов нецелесообразно.

Прямое определение чувствительности с использованием клинического материала (без выделения чистой культуры) возможно только в исключительных случаях при условии подтверждения однородности культуры и высокой степени обсемененности при окраске по Граму, причем исследование следует повторить после выделения чистой культуры микроорганизма.

Следует уделять особое внимание определению чувствительности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной резистентности.

У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП, т.е. когда случаев резистентности не описано (например, Streptococcus pyogenes - все штаммы чувствительны к пенициллину), проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.

Факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе, следует оценивать с крайней осторожностью и рекомендуется обращаться за консультациями в лаборатории, занимающиеся изучением антибиотико-резистентности.

Не следует в практических целях исследовать микроорганизмы, для которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизованы и отсутствуют критерии интерпретации результатов. Результаты, полученные в данном случае, не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению.

4. Методы определения чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам

4.1. Общая характеристика методов

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные.

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП - величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК).

МПК - минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.

Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям МПК (см. ниже). Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.

В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или резистентный).

Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5х6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов.

4.1.1. Основные этапы проведения тестирования

Оценка антибиотикочувствительности, независимо от конкретного метода, предполагает последовательное выполнение нескольких этапов:

- приготовление питательных сред;

- приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма);

- учет и интерпретация результатов, формулировка рекомендаций по лечению.

Диффузионные методы включают также этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.

4.1.2. Приготовление питательных сред для определения чувствительности

Для оценки чувствительности используют специально предназначенные для этой цели среды, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке и по своим характеристикам удовлетворяющие требованиям, приведенным в разделе 5. Внутрилабораторный контроль качества среды проводят при использовании всех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяют выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.

Агар разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм - 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4-8 °С в течение 5 суток.

4.1.3. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма)

Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1,5·10 КОЕ/мл. Практически наиболее приемлемым методом оценки концентрации бактериальной суспензии является измерение ее оптической плотности. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5·10 КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по МакФарланду. Контроль оптической плотности суспензии можно также осуществлять спектрофотометрически (денситометрически). Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры. Бактериальную суспензию можно готовить либо из бульонной, либо из агаровой культуры.

Приготовление инокулюма из агаровой культуры

Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту МакФарланда. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин после приготовления.

Приготовление инокулюма из бульонной культуры

При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5-6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0-5,0 мл жидкой неселективной питательной средой. Инкубируют при 35 °С. Через 5-6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по МакФарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.

Стандарт МакФарланда может быть либо приобретен, либо приготовлен в лаборатории.

4.1.4. Приготовление стандарта 0,5 по МакФарланду

К 0,5 мл раствора ВаСl в концентрации 0,048 моль/л (1,175% раствор ВаСl·2HO) медленно при тщательном перемешивании добавить 99,5 мл раствора HSO в концентрации 0,18 моль/л (1%) до получения гомогенной суспензии.

Полученную суспензию необходимо разлить по 4-6 мл в пробирки с герметично закрывающимися крышками. Пробирки должны быть такого же диаметра, как и используемые для приготовления бактериальной суспензии.

Хранить пробирки с суспензией необходимо в темноте при комнатной температуре.

Перед использованием пробирки необходимо тщательно встряхивать и оценивать однородность суспензии. При появлении видимых частиц пробирки изымаются из употребления.

Стандарт мутности необходимо обновлять или проверять его оптическую плотность ежемесячно.

4.2. Методы серийных разведений

4.2.1. Приготовление растворов АБП для методов серийных разведений

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов АБП. Различают "основные" растворы АБП (пригодные для хранения) и "рабочие" - те, которые необходимо использовать "ех tempore" для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов АБП необходимо использовать субстанции АБП с известной активностью, лекарственные формы не пригодны. Для взвешивания субстанций необходимо использовать электронные лабораторные весы с точностью до 4 знака, для измерения объемов - калиброванные дозаторы и пипетки.

Читайте также:

  
• Методика бронхографии через двухпросветную бронхоспирометрическую трубку. Сочетание бронхоспирометрии и бронхоскопии
  
• Клиника отравления цитостатиками (противоопухолевыми средствами)
  
• Клиника и диагностика респираторного дистресс-синдрома
  
• Клиника полиомиелита. Диагностика полиомиелита. Лечение полиомиелита. Профилактика полиомиелита.
  
• Неправильное положение и предлежание плода