Лимфокин-активированные киллеры для иммунизации. Влияние лимфокин-активированных киллеров на врожденный иммунитет
Обновлено: 19.05.2024
Натуральные киллеры (NK) являются частью врожденной иммунной защиты против инфекции и рака. Механизмы влияния NK-клеток на инфицированные вирусом клетки различны и напрямую связаны с работой ингибиторных и активационных клеточных рецепторов. Немаловажную роль в активации NK-клеток и, соответственно, в развитии воспаления играют цитокины, в особенности интерфероны I типа (IFN), IL-12, IL-15 и IL-18. Помимо цитокинов контроль активности NK-клеток осуществляется при помощи Трег субпопуляции Т-лимфоцитов. По причине высокой значимости этих лимфоцитов для сохранения нормального состояния организма человека, важно знать результаты нарушений, связанных с аномалиями NK-клеток, а также возможные механизмы воздействия на NK-клетки при помощи различных препаратов, которые оказывают стимулирующее воздействие на NK-клетки, что благоприятно сказывается на защите организма.
1. Лебединская О.В., Лебединская Е.А., Годовалов А.П., Ахматова Н.К. Цитотоксическая активность мононуклеарных лейкоцитов мышей при действии иммуномодулирующих препаратов различного происхождения // Медицинская иммунология. – 2011. – Т. 13, № 4-5. – С. 322.
2. Лебединская О.В., Велижева Н.П., Чикилева И.О., Годовалов А.П., Киселевский М.В. Динамика накопления и морфология CD4+/CD25+ Т-клеток в популяции лимфокин-активированых киллеров // Морфологические ведомости. – 2010. – № 3. – С. 24-29.
3. Титов Л.П., Карпов И.А. Противовирусный иммунитет: молекулярно-клеточные механизмы, закономерности развития и иммунопатология // Медицинский журнал. ‒ 2007. ‒ №1(19). – С. 4-14.
4. Brandstadter J.D., Yang Y. Natural Killer Cell Responses to Viral Infection // J. Innate Immun. ‒ 2011. – Vol. 3(3). – P. 274–279.
5. Orange J.S. Natural killer cell deficiency // J. Allergy. Clin. Immunol. – 2013. – Vol. 132(3). – P. 515–526.
Введение. Естественные киллеры, натуральные киллеры, NK - клетки – большие гранулярные лимфоциты периферической крови и лимфоидных органов [3].
В цитоплазме этих клеток содержатся гранулы с белком перфорином, вызывающим образование в мембранах клеток-мишеней пор (каналов), и гранзимами (семейство сериновых протеаз, нарушающих ДНК, прохождение клеточного цикла и растворяющих ядро при входе в клетку [4]). Эти гранулы высвобождаются из цитоплазмы клеток в процессе взаимодействия последних с клетками-мишенями (инфицированными вирусом или опухолевыми). Противовирусный эффект этих клеток неспецифичен.
NK-клетки атакуют клетки-мишени двумя путями: а) с помощью активационного рецептора распознают клетки-мишени, не экспрессирующие молекулы гистосовместимости I класса и лизируют их; б) распознают и лизируют клетки с помощью механизма антителозависимой цитотоксичности, взаимодействуя с фиксированными на их мембране вирусспецифическими антителами посредством Fc-рецепторов.
Рецепторы NK-клеток
На поверхности мембраны NK-клеток имеется два типа рецепторов – активационный и ингибиторный [3].
Для контроля несоответствующих активирующих сигналов существует набор ингибиторных рецепторов, которые подавляют активацию NK-клеток. К ним относятся лектиноподобные гетеродимеры, такие как CD94-NKG2A, KIRs, обнаруженные у людей, или лектинподобные гомодимеры Ly49, обнаруженные у мышей. Эти ингибирующие рецепторы "исследуют" молекулы МНС класса I и защищают здоровые клетки от неадекватного опосредованного NK-клетками киллинга [4].
При взаимодействии MHC1 и ингибиторного рецептора, на мембране NK-клеток возникает ингибиторный сигнал, который и предупреждает лизис клеток-мишеней. Так нормальные соматические клетки защищаются от повреждающего действия естественных киллеров, т.е. они могут активировать ингибиторный рецептор. Инфицированные же вирусом клетки-мишени, как правило, характеризуются сниженной экспрессией молекул I класса на своей поверхности. Естественно, что такие клетки-мишени эффективнее распознаются активационным рецептором этих клеток. А так как ингибиторный сигнал при этом недостаточен или вовсе отсутствует, то, естественно, формирование активационного сигнала превалирует. В результате происходит быстрое прикрепление NK-клеток к поверхности клетки-мишени, из гранул высвобождаются молекулы перфорина, которые достигают мембраны инфицированной вирусом клетки и вызывают ее повреждение путем образования трансмембранного канала. Через это отверстие в цитоплазму клетки-мишени проникают белки-гранзимы, запускающие механизм апоптоза. Клетки-мишени при этом погибают [3]. В дополнение к рецепторам, активирующим NK-клетки, стимуляция Toll-подобного рецептора (TLR) на NK-клетках играет важную роль в их активации. Было показано, что TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 экспрессируются на человеческих NK-клетках, и что лиганды для этих TLR могут активировать NK-клетки человека in vitro. Аналогично, прямая активация TLR4 бактериальным компонентом фимбриального белка FimH, по-видимому, важна для активации NK-клеток.
Цитокины, участвующие в активации NK-клеток
Помимо прямой стимуляции через активирующие рецепторы NK-клетки на начальных стадиях вирусной инфекции могут активироваться цитокинами.
Четыре основных цитокина, участвующих в активации NK-клеток, представляют собой интерфероны I типа (IFN), IL-12, IL-15 и IL-18. Эти цитокины могут продуцироваться непосредственно инфицированными клетками, а также активированными дендритными клетками или макрофагами.
IFN I типа непосредственно активируют NK-клетки для усиления цитотоксичности. Эта роль IFN типа I была хорошо установлена в условиях инфицирования MCMV (мышиный цитомегаловирус), LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита) и несколькими другими вирусами. Они также могут индуцировать секрецию IL-15, цитокина, способного индуцировать пролиферацию NK-клеток.
В отличие от IFN типа I, IL-12 активирует NK-клетки для увеличения продукции IFN-γ. Секреция IFN-γ повышает функциональную активность NK-клеток, что создает условия ранней защиты от некоторых инфекций до тех пор, пока в реакцию не вступят Т-клетки , продуцирующие тот же цитокин. Вирус простого герпеса (HSV) вызывает более выраженную секрецию IL-12 и IFN типа I как у мышей, так и у людей, тогда как у пациентов с ВИЧ наблюдается снижение выработки ИЛ-12, который коррелирует со степенью активации NK-клеток, соответственно. Другой цитокин, IL-18, также может индуцировать продукцию IFN-γ NK-клетками. И IL-12, и IL-18 необходимы для первичных NK-клеток в ответе на вирусную инфекцию [4].
Влияние T-рег на NK-клетки
Помимо влияния цитокинов доказано влияние на NK-клетки Т-регуляторных клеток. Естественные CD4+/CD25+ Т-регуляторные клетки (Трег) составляют у человека около 5% периферических CD4+ Т-лимфоцитов и поддерживают гомеостаз периферической аутотолерантности посредством супрессии аутореактивных Т-клеток. На мышиных опухолевых моделях показан возможный механизм, с помощью которого Трег вызывают угнетение литической и секреторной функций натуральных киллеров (НК) in vitro и контролируют их пролиферацию. Под действием растворимого фактора роста опухоли β (TGF-β), продуцируемого опухолевыми клетками и связанного с мембраной Т-регуляторных лимфоцитов, у НК-клеток снижается экспрессия системы молекул, ассоциированных с цепью MHC I класса (NKG2D). Это приводит к угнетению функциональной активности натуральных киллеров и позволяет Трег контролировать НК в норме и при опухолевом росте. Удаление CD4+/CD25+ Т-регуляторных клеток вызывает резкое увеличение темпов пролиферации натуральных киллеров, равно как и их цитотоксической активности. При этом НК-клеточный гомеостаз зависит не только от функционирования Т-регуляторных лимфоцитов. Однако активность НК обратно пропорциональна частоте встречаемости Трег у онкологических пациентов, а удаление Трег может стимулировать НК-опосредованный лизис опухолевых клеток ex vivo [2].
Рекрутирование NK-клеток в место заражения
Контроль за вирусными инфекциями требует не только соответствующей активации NK-клеток, но и эффективного рекрутирования активированных NK-клеток к месту инфекции. В нормальном состоянии NK-клетки могут быть найдены в селезенке, легких, костном мозге, лимфатических узлах, мононуклеарных клетках периферической крови и печени. Сфингозин-1-фосфат играет важную роль в миграции лимфоцитов, а S1P5R, рецептор, связанный с G-белком (GPCR), дифференциально экспрессируется на NK-клетках для контроля их развития и нормального состояния.
При попадании в организм инфекции NK-клетки мигрируют в направлении заражения и накапливаются там. В целом, в транспорт NK-клеток в места воспаления вовлечены четыре типа рецепторов хемокинов: CCR2, CCR5, CXCR3 и CX3CR1. Все, кроме CX3CR1, как было показано, играют роль в хемотаксисе к местам вирусного заражения. В частности, CCR2 и CCR5 имеют решающее значение для транспортировки в печень при инфицировании MCMV. CCR5 индуцирует попадание NK-клеток в центральную нервную систему при инфекции HSV-2. CXCR3 помогает движению NK-клеток в печень при заражении вирусом денге и, наряду с CD62L, как правило, облегчает миграцию в лимфатические узлы при воспалении. Однако до конца механизмы миграции NK-клеток в область воспаления до конца не известны.Natural killer (NK) cells, as part of the innate immune system, play a key role in host defense against viral infections. Recent advances have indicated that NK cell activation and function are regulated by the interplay between inhibitory and activating signals. Thus, a better understanding of mechanisms responsible for NK cell activation and function in the control of viral infections will help develop NK cell-based therapies. In this review, we will first discuss how NK cells are activated in response to viral infections. We will then focus on the recruitment of activated NK cells to the site of infection as well as on NK cell effector mechanisms against virally infected cells.
Key Words: Natural killer cells, Viral infection, Innate immunity
Реакция NK-клеток на инфицированные вирусом клетки
После активации и рекрутирования в место заражения NK-клетки используют три основные стратегии для уничтожения инфицированных вирусом клеток: производство цитокинов, секрецию цитолитических гранул и цитолиз. Выработка IFN-γ является важной эффекторной функцией активированных NK-клеток. IFN-γ оказывает непосредственное влияние на то, чтобы клетки хозяина были менее восприимчивы к вирусу и могли действовать дистантно, чтобы предотвратить инфицирование других клеток. Он также рекрутирует и активирует другие эффекторные лейкоциты, включая цитотоксические Т-лимфоциты и CD4 + Т-хелперы 1 типа [4].
Нарушения, связанные с NK-клетками
Важность NK-клеток для здоровья человека была подчеркнута растущим числом лиц, у которых отсутствуют NK-клетки и / или их функции. В настоящее время известно более 40 случаев поражения NK-клеток. Аномалии NK-клеток, однако, в некоторых случаях представляют собой основной иммунологический дефект. В совокупности эти условия называются дефицитом NK-клеток. Недавние достижения добавили ясности в этот диагноз и выявили дефекты в трех разных генах, которые могут вызывать дефицит NK-клеток (NKD): GATA2, MCM4 и FCGR3A. У больных могут отсутствуют либо сами NK-клетки (CNKD), либо их функции (FNKD). Хотя сообщается о различных методах лечения пациентов с CNKD и FNKD, но никогда не проводилось организованного клинического испытания какой-либо терапии у этих пациентов. Большинство терапевтических подходов сосредоточено на восприимчивости к герпесвирусам и применении профилактических противовирусных препаратов [5].
Влияние на NK-клетки
Как говорилось ранее, NK-клетки играют важную роль в контроле за вирусными инфекциями организма, поэтому закономерно встает вопрос о стимуляции активности этих клеток, а также и других клеток врожденного иммунитета для защиты организма. Возможность такого влияния была найдена воздействием на клетки-эффекторы врожденного иммунитета некоторых препаратов иммуномодулирующего действия.
При проведении эксперимента на мышах для изучения действия иммуномодулирующих препаратов, таких как: поликомпонентная вакцина Иммуновак, состоящая из антигенных компонентов St. aureus, K. pneumoniae, P. vulgaris и E. Coli; стафило-протейно-синегнойная жидкая вакцина (СПСА); стимфорте (водная вытяжка из органов и тканей ужей); фукоидан (сульфатированный гетерополисахарид из бурых водорослей) и нуклеинат натрия (низкомолекулярная NaРНК, полученная при гидролизе кормовых дрожжей), было выявлено, что они оказывают стимулирующее действие на клетки-эффекторы врожденного иммунитета и вызывают пролиферативные процессы в лимфоидной ткани различных зон иммунокомпетентных органов. При этом наибольшей активностью обладали иммуномодуляторы бактериального происхождения, поскольку в их составе имелись патоген-ассоциированные молекулярные структуры микроорганизмов, являющиеся лигандами для рецепторов клеток врожденного иммунитета и приводящие к их активации [1].
Лимфокин-активированные киллеры для иммунизации. Влияние лимфокин-активированных киллеров на врожденный иммунитет
IL-2 или его экзогенные аналоги стимулируют пролиферацию естественных киллеров и усиливают их цитолитические функции, приводя к образованию так называемых лимфокин-активированных киллеров (ЛАК). По своей природе ЛАК являются цитотоксическими лимфоцитами, которые способны уничтожать клетки, зараженные вирусами или внутриклеточными бактериями и опухолевые клетки. В настоящее время возможности ЛАК-терапии исследуются при различных формах онкологических заболеваний. При инфекционных заболеваниях метод адоптивного переноса ЛАК практически не изучался.
Этот вопрос был нами изучен при заражении мышей линии СВА культурой штамма К. pneumoniae K2.
Лимфокин-активированные киллеры получали из МЛ селезенки мышей при культивировании в течение двух суток в среде RPMI-1640, содержащей 1000 МЕ/мл IL-2, затем клетки отмывали и использовали в эксперименте.
Морфогистохимические исследования выявили, что ЛАК представляют собой крупные клетки лимфоидного ряда типа иммунобластов и пролимфоцитов с базофильной цитоплазмой. В мазках часто обнаруживаются клетки в состоянии митотического деления. При фазово-контрастной микроскопии ЛАК представляют пролиферирующие конгломераты клеток.
Таким образом, при воздействии IL-2 на МЛ селезенок мышей происходила генерация ЛАК, характеризующаяся пролиферацией и активацией клеток лимфоидного ряда. Повышенная экспрессия активаци-онных антигенов, формирующая особенности иммунофенотипа ЛАК, также свидетельствовала о процессах активации лимфоцитов. Кроме того, нами было выявлено, что ЛАК обладали достоверно более высокой киллерной активностью по сравнению с интактными МЛ по отношению к NK-чувствительной линии клеток мышиной лимфомы YAC-1.
Согласно сложившемуся мнению, NK — основная субпопуляция лимфоцитов, экспрессирующая р75р цепь рецептора IL-2 и селективно активирующаяся и пролиферирующая под его воздействием с образованием ЛАК, способных эффективно лизировать опухолевые клетки-мишени. Однако наряду с изложенными представлениями, имеются данные о существовании в популяции ЛАК NKT-клеток, экспрессирующих не только маркеры NK (CD16, CD56), но и Т-клеточные дифференцировочные антигены (CD3, CD4, CD8).
Эти данные соответствуют высказанным ранее предположениям о NK-клетках, которые рассматривались не только как самостоятельная субпопуляция, но и как этап дифференцировки зрелых лимфоцитов. Из зрелых лимфоцитов при инкубации с IL-2 могут быть получены так называемые NK-ЛАК-клетки.
В наших экспериментах после культивирования МЛ селезенки мышей с IL-2, были получены ЛАК, экспрессирующие на своей мембране активационные молекулы (CD25) и молекулы главного комплекса гисто-совместимости МНС I, МНС II. В то же время, в популяции ЛАК, кроме NK, присутствовали клетки, экспрессирующие и Т-клеточные дифференцировочные антигены (CD3, CD4, CD8).
Последние в таких же количествах были выявлены в исходной популяции МЛ. Использованная технология получения лимфокин-активированных киллеров обеспечила существенное увеличение NK-клеток с 1,5 до 20,3%, а также клеток, содержащих маркер CD25 и молекул антигенного представления МНС I и II.
Полученную суспензию лимфокин-активированных киллеров вводили мышам внутрибрюшинно по 2,5 х 106 клеток в 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем, внутрибрюшинно вводили по 250 клеток в объеме 0,5 мл К pneumoniae K2. В качестве контроля были использованы МЛ, культивировавшиеся в присутствии ФГА (10 мкг/мл).
Лимфокин-активированные киллеры у инфицированных К. pneumoniae (100 LD50) мышей обеспечивали 100 % выживание животных при практически одновременном внутрибрюшинном введении киллерных и микробных клеток. МЛ, активированные ФГА, защищали в 50 % случаев при 100% гибели интактных мышей, получивших ту же заражающую дозу.
Наши исследования подтверждают целесообразность исследований по использованию ЛАК для адоптивной иммунотерапии, поскольку введенные мышам внутрибрюшинно ЛАК предотвращали развитие заболевания К.pneumoniae K2 у животных.
При определении цитокинов в культуральной среде ЛАК выявлялось повышенное содержание IL-1 через 24 ч и 72 ч инкубации (254+12,3 пг/мл и 213±11,5 пг/мл, соответственно), через 72 ч — IL-6 (224±21,2 пг/мл) и IL-10 (150±10,5 пг/мл) по сравнению с культурой МЛ (содержание этих цитокинов в контроле не превышало 25-80 пг/мл), инкубированных без IL-2. Интересно отметить, что в культуральной среде ЛАК не увеличивалось содержание регуляторного IL-12, что мы в значительных количествах определяли в культуральной среде ДК.
Цитотоксическую активность лимфокин-активированных киллеров, полученных из селезенки мышей (СВА), определяли на NK-зависимой линии клеток мышиной лимфомы YAC-1 в тесте восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест). Опухолевые клетки (1 х 104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с ЛАК в разных соотношениях и по оптической плотности при длине волны 540 нм, рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Оценка киллерной активности эффекторных клеток показала, что ЛАК обладают достоверно большей NK-активностью по сравнению с МЛ интактных мышей.
При соотношении 1:5 ЛАК и опухолевых клеток мышиной лимфомы YAC-1 цитотоксическая активность киллеров увеличивалась в 6 раз по сравнению с МЛ. В данных условиях МЛ лизировали 15,5 % клеток линии К562, в то время как в аналогичных условиях ЛАК вызывали гибель 92,2 % опухолевых клеток (р < 0,01). В меньших соотношениях мишени/эффекторы (1:2 и 1:1) эти различия не столь значимы, хотя цитотоксическая активность ЛАК превышает таковую у МЛ интактных мышей.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Иммуностимулирующая способность дендритных клеток. Активация врожденного иммунитета
Повышенное внимание генной инженерии в последнее время обращено на увеличение иммуностимулирующей способности ДК. Через вирусные или невирусные векторы в ДК встраивают такие трансгены, как иммуностимулирующие цитокины (например, IL-12, GM-CSF), костиму-лирующие молекулы и антигены. Существуют следующие методы переноса генетического материала в ДК: катионная липидопосре-дованная трансфекция, электропорация, баллистическая трансфекция и трансдукция вирусных векторов. Стимулирующая способность модифицированных ДК зависит от трансфекционных систем и от происхождения ДК, а также от стадии развития ДК. Преимущество генной трансфекции — в эндогенной презентации на молекулах МНС I эндогенно экспрессируемого белка.
Изучение эффективности путей введения ДК выявило, что при внутривенном введении накопление ДК отмечается в печени, селезенке и костном мозге и отсутствует в регионарных лимфатических узлах При внутрикожном введении в лимфатических узлах определяется небольшая фракция ДК, а при подкожном пути введения ДК там не обнаруживаются. Поэтому исследователи часто комбинируют пути введения для достижения максимального эффекта, а также увеличивают количество введений для усиления антигенспецифического ответа.
Приведенные материалы свидетельствуют о том, что, несмотря на ключевую роль ДК в реализации эффекторных функций врожденного иммунитета, а также максимальной (по сравнению с другими АПК) способности представлять антиген и инструктировать направленность адаптивного иммунитета, использование ДК в клинике для модуляции иммунного статуса находится на стадии накопления знаний.
В современной литературе активно обсуждается возможность создания неспецифической иммунологической защиты против неизвестного патогена путем активации системы врожденного иммунитета. Исходя из этих предпосылок, такие PAMPs можно рассматривать как потенциально перспективные компоненты различного рода иммунопрепаратов для стимуляции неспецифической защиты от патогенов и целенаправленного программирования адаптивного иммунитета.
Была исследована способность поликомопонентной бактериальной вакцины Иммуновак-ВП-4 активировать врожденный иммунитет и оказывать протективное действие при инфекционном процессе. Выбор вакцины был обусловлен следующими соображениями: вакцина состоит из комбинации антигенных комплексов 4 условно патогенных микроорганизмов и содержит большой набор PAMPs (липополисахарид, пептидогликан, тейхоевые кислоты и т.д.); кроме того, ранее в опытах на животных и при испытании на людях выявили выраженное иммуномодулирующее действие препарата.
Протективную активность поликомопнентной бактериальной вакцины «Иммуновак-ВП-4» изучали на модельной инфекции мышей при заражении летальной дозой (106 микробных клеток) штамма Salmonella typhimurium 415. За 24 часа до заражения мышей вакцинировали однократно внутрибрюшинно дозой 400 мкг вакцины. Для контроля заражающей дозы использовали интактных животных, которых заражали тремя 10-кратно убывающими дозами культуры (10-105-10 микробных клеток) и определяли величину LD50. На дозу брали по 6 мышей.
В сыворотке крови мышей определяли спектр экспрессируемых цитокинов Образцы сывороток исследовали в различные интервалы времени, как после вакцинации, так и после заражения S. typhimurium вакцинированных мышей. Контролем служили показатели у интактных животных.
В этом опыте была изучена экспрессия цитокинов у вакцинированных мышей до заражения и в динамике 120 часов после заражения. Для суждения степени увеличения уровня цитокинов в исследованных группах мышей мы представили их в абсолютных величинах и в относительных по кратности, и проценту повышения по сравнению с интактными.
Как и в предыдущих исследованиях вакцинация вызывала активную экспрессию IL-10, IL-6, TNF-a уже через 1 час после введения Иммуновак-ВП-4, через 4 часа выявлено значительное увеличение IL-12 и IFN-y, играющих центральную роль в формировании и регуляции эффекторных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета. К 24 часам уровни цитокинов снижаются, но и в этот срок они значительно превышают показатели контроля.
На этом фоне вакцинированные Иммуновак-ВП-4 мыши в 100% оставались живыми в течение 4 суток после заражения. В контрольной группе интактных мышей гибель животных регистрировали через 24 часа после заражения. К 5-м суткам 100% контрольных животных погибли.
Иммунизация от инфекции дендритными клетками. Эффективность активации врожденного иммунитета
Далее была изучена способность сингенных дендритных клеток индуцировать специфическую защиту от инфекции на модели К. pneumoniae К2. ДК получали из костного мозга мышей методом, описанным выше На 7-е сутки в культуру ДК вносили лизат К. pneumoniae K2 (50 мкл/мл) и 20 нг/мл TNF-a. На 9-е сутки ДК отмывали и ими иммунизировали мышей линии СВА.
Мышей иммунизировали в разных опытах 4-, 3- и 2-кратно с интервалом в 2 недели. В 1-м опыте ДК вводили подкожно по 2,5-3,0х106 клеток в 0,5 мл, во 2-м опыте и далее — такое же количество клеток вводили 3-кратно подкожно или внутрибрюшинно. Иммуногенную активность дендритных клеток, пульсированных лизатом К. pneumoniae К2, определяли при внутрибрюшинном заражении мышей вирулентным штаммом К. pneumoniae K2 в дозе 100 микробных клеток в объеме 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Заражали мышей через 14 суток после последней вакцинации ДК Опыт сопровождали контролем заражающей дозы на невакцинированных мышах. Наблюдение за животными проводили в течение 10 суток (гибель мышей прекращалась на 7-е сутки после заражения).
Зрелые ДК, пульсированные лизатом К.pneumoniae, при таком режиме иммунизации мышей и заражении через 14 суток предупреждали гибель от летальной дозы гомологичной инфекции в 83,3-100% случаев при 100% гибели контрольных животных, в то время как незрелые ДК при такой же постановке эксперимента не обладали протективной активностью Полученные данные свидетельствуют о возможности формирования адаптивного (специфического) иммунного ответа под влиянием ДК, обработанных гомологичным антигеном.
В следующих экспериментах по изучению специфического проти-воинфекционного эффекта дендритных клеток, созревших под влиянием различных антигенов: лизата К. pneumoniae K2 (50 мкл/мл), TNF-a (20 нг/мл) и Иммуновак-ВП-4 (25 мкг/мл) схема иммунизации ДК была сокращена до двух введений и через 14 суток заражали мышей К.pneumoniae K2 в дозе 25-50 микробных клеток.
Зрелые ДК, нагруженные лизатом К.pneumoniae К2 (с TNF-a и без TNF-a), при двукратной иммунизации обеспечивали защиту мышей в 100 % случаев, против 20 % выживших мышей в контроле. В то время как ДК, созревшие под влиянием только TNF-a, не защищали мышей от летальной дозы инфекции, а ДК, созревшие под действием Иммуновак-ВП-4, оказывали протективныи эффект в 33,3 % случаев. В этом опыте получены также данные о том, что только ДК, нагруженные гомологичным антигеном, обладали значительным протективныи эффектом, выявленным нами через 14 суток после иммунизации. Это свидетельствует о способности предъявления ДК антигенов Т-лимфоцитам, которые дифференцируются в специфические клетки-эффекторы.
Резюмируя вышеизложенное, следует отметить, что антигенпредставляющая функция ДК установлена также на модельных инфекциях мышей. Специфическая протективная активность в отношении К. pneumoniae K2, тестируемая через 14 суток после 2-4 кратного введения ДК, формируется только ДК, нагруженными гомологичным антигеном. Зрелые ДК при использовании в качестве индуктора созревания Иммуновак-ВП-4, но не нагруженные антигеном, обеспечивают в этот срок слабую защиту, что, вероятно, связано с наличием перекрестно реагирующих антигенов в составе антигенных компонентов Иммуновак ВП-4.
Активация врожденного иммунитета и возможность создания защиты от неизвестного патогена показана при одновременном введении мышам зрелых и незрелых ДК, и в качестве неизвестного патогена К. pneumoniae K2.
Получены экспериментальные факты, подтверждающие гипотезу, согласно которой активация врожденного иммунитета иммуномодуляторами бактериального происхождения, являющимися агонистами TLRs, ведет к быстрому развитию резистентности к гетерологичным патогенам. При заражении S typhimurium однократно иммунизированных Иммуновак-ВП-4 мышей выявлено значимое увеличение продолжительности жизни по сравнению с интактными животными.
Исследование цитокинового профиля у вакцинированных Иммуновак-ВП-4 мышей выявило уже через 0,5 часа после введения ВП-4 увеличение экспрессии IL-10, IL-6, через 4 часа увеличение продукции IL-12, IFN-y. При заражении таких мышей S. typhimurium отмечается полная резистентность в течение четырех суток (при гибели к этому времени 85% интактных мышей) и слабая при этом экспрессия цитокинов.
Лимфокин-активированные киллеры (ЛАК) - это клетки, генерируемые из монуклеаров крови (МНК) при инкубации с интерлейкином-2 (ИЛ-2). ЛАК оказывают избирательное действие на трансформированные клетки, вызывая лизис опухолевых клеток-мишеней, и не влияют на нормальные клетки своего организма.
Имеющиеся данные об экспрессии и морфологии ЛАК весьма малочисленны и достаточно противоречивы. Поэтому целью настоящей работы являлось изучение морфологических, функциональных и иммунофенотипических особенностей ЛАК в разные сроки культивирования.
Через 36 часов, 3, 5, 9, 10 суток после начала культивирования из центрифугата надосадочной жидкости культур,содержащих мононуклеарные клетки крови донора, были сделаны мазки, которые окрашивались на РНК по Браше с контрольной обработкой РНК-азой, эозин-азуром по Романовскому-Гимза, реактивом Шиффа по Шабадашу с контролем амилазой на гликоген и гликозаминогликаны. В окрашенных по Браше мазках подсчитывалось процентное содержание выявляемых клеток. Проводилась статистическая обработка данных с использованием программы «ИП-СО» (Россия).
Исследование иммунофенотипа ЛАК позволило установить,что эти клетки активно экспрессируют на своей мембране активационные молекулы «CD-38»,молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса (HLA-DR).ЛАК характеризуются высоким уровнем молекул адгезии (CD-58).
Цитологическое изучение МНК при инкубации с ИЛ-2 позволило установить, что через 3 суток количество лимфоцитов существенно возрастало и продолжало прогрессивно увеличиваться до 10 суток, при этом отмечалось появление бластных форм. Наиболее ранние изменения отмечались на 3 сутки инкубации, когда среди мононуклеаров преобладали пиронинофильные лимфоциты. Большое количество бластных форм и пиронинофильных лимфоцитов сохранялось вплоть до 10 суток инкубации с ИЛ-2.
Таким образом, при воздействии ИЛ-2 на МНК крови здоровых доноров происходила пролиферация и активация клеток лимфоидного ряда - генерация ЛАК. При этом зрелые лимфоциты подвергались бласттрансформации и характеризовались морфологически как пролимфоциты и иммунобласты. В процессе дедифференцировки лимфоциты активизировались, о чём свидетельствовало накопление РНК в цитоплазме, проявляющееся в её яркой пиронинофильной окраске. Об активации лимфоцитов указывали также особенности иммунофенотипа ЛАК в виде повышенной экспрессии активационных антигенов и молекул адгезии. ЛАК обладали достоверно более высокой киллерной активностью по отношению к опухолевым клеткам. Максимальное количество ЛАК генерировалось на 3-5 сутки, и высокая киллерная и пролиферативная активность сохранялась в течение 10 суток.
Полученные результаты подтверждают целесообразность использования ЛАК, полученных на 3-5 сутки инкубации для адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований, поскольку именно в эти сроки ЛАК обладают наиболее высоким уровнем пролиферативной и цитотоксической активности.
Читайте также: